Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Neurobiologie Bc. Veronika Moníková Cirkadiánní regulace proteinu STAT3 v SCN a vliv leptinu na jeho aktivaci v SCN, v jiných částech hypotalamu a epifýze Circadian regulation of STAT3 protein in the SCN and it s activation by leptin in the SCN, other parts of hypothalamus and the pineal gland Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: RNDr. Zdeňka Bendová, PhD. Praha, 2015

2 PROHLÁŠENÍ Tímto prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem také uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, Podpis 2

3 PODĚKOVÁNÍ V první řadě bych velmi ráda poděkovala mé školitelce paní RNDr. Zdeňce Bendové, PhD., za velikou trpělivost a ochotu při psaní této diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala mé rodině a blízkým, že mi byli a stále jsou oporou. Zvláštní dík patří mému Jakubovi. 3

4 ABSTRAKT Signální dráha JAK/STAT je jedna z nejlépe prostudovaných intracelulárních kaskád přenášejících signály z extracelulárního prostředí do buněčného jádra s cílem ovlivnit expresi cílových genů. Cirkadiánní hodiny lokalizované v suprachiasmatických jádrech (SCN) hypotalamu jsou citlivé zejména ke světlu, mohou však reagovat na nesvětelné signály jako jsou růstové faktory, opioidy, cytokiny a leptin, u kterých bylo prokázáno, že vykonávají svoji funkci prostřednictvím JAK/STAT signální dráhy. Nedávné výsledky naší laboratoře ukázaly, že protein STAT3 je silně produkován SCN potkana. Naše experimenty měly primárně za cíl otestovat cirkadiánní regulaci produkce STAT3 v SCN a popsat vliv exogenně podaného leptinu na fosforylaci STAT3 v SCN, epifýze a strukturách hypotalamu zodpovědných za regulaci potravního chování a energetický metabolismus. Protože aktivace leptinových receptorů může stimulovat i řadu jiných signálních kaskád, zvolili jsme fosforylované formy kináz ERK1/2 a GSK-3β jako další markery intracelulárních změn po aplikaci leptinu ve studovaných strukturách. Naše výsledky prokázaly rytmickou produkci proteinu STAT3 v SCN potkana a naznačily cirkadiánní regulaci citlivosti hypotalamických struktur k leptinu. Získaná data také naznačila, že aktivita buněk SCN a epifýzy měřená zvolenými markery se významně nemění po intraperitoneálním podání leptinu. Klíčová slova: cirkadiánní rytmy, epifýza, ERK1/2, GSK-3β, hypotalamus, JAK/STAT signalizace, potkan, STAT3, suprachiasmatická jádra 4

5 ABSTRACT JAK/STAT signaling pathway is one of the most studied intracellular cascades transmitting signals from the extracellular environment to the cell nucleus in order to affect expression of target genes. Circadian clocks localized in the suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus are sensitive especially to light but they can respond to non-photic stimuli such as growth factors, opioids, leptin and cytokines that have been demonstrated to perform its function via the JAK/STAT signaling pathway. The recent findings of our laboratory demonstrated that STAT3 protein is highly produced by SCN of rat. Primary aim of our experiments was to test the circadian regulation of STAT3 production in SCN and describe the effect of exogenously administered leptin on STAT3 phosphorylation in the SCN, pineal gland and hypothalamic structures responsible for regulated feeding behavior and energy metabolism. Because activation of leptin receptors may stimulate a number of other signaling cascades, we chose phosphorylated forms of kinase ERK1/2 and GSK-3β as other markers of intracellular changes after administration of leptin in the studied structures. Our results proved rhythmic production of STAT3 protein in SCN of rat and indicated circadian regulation of sensitivity to leptin in hypothalamic structures. The data also indicated that the activity of cells in SCN and pineal gland measured by selected markers is not significantly changed after the intraperitoneal administration of leptin. Keywords: circadian rhythms, pineal gland, ERK1/2, GSK-3β, hypothalamus, JAK/STAT signaling, rat, STAT3, suprachiasmatic nuclei 5

6 OBSAH ABSTRAKT... 4 ABSTRACT... 5 SEZNAM ZKRATEK ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED JAK/STAT SIGNÁLNÍ DRÁHA JANUS KINÁZA STAT PROTEINY LEPTIN PŮSOBENÍ LEPTINU V JÁDRECH HYPOTALAMU REGULUJÍCÍCH POTRAVNÍ CHOVÁNÍ LEPTIN JAKO AKTIVÁTOR JAK/STAT SIGNALIZACE CIRKADIÁNNÍ SYSTÉM SUPRACHIASMATICKÁ JÁDRA EPIFÝZA ROLE LEPTINU A PROTEINU STAT3 V CIRKADIÁNNÍM SYSTÉMU PROTEIN KINÁZA ERK1/ PROTEIN KINÁZA GSK-3β CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE MATERIÁL A METODY EXPERIMENTÁLNÍ ZVÍŘATA EXPERIMENTÁLNÍ PARADIGMA EXPERIMENT 1 - DENNÍ RYTMUS V EXPRESI PROTEINU STAT3 A JEHO FOSFORYLOVANÝCH FOREM V SCN EXPERIMENT 2 - VLIV INTRAPERITONEÁLNÍ APLIKACE LEPTINU NA AKTIVITU PROTEINU STAT3, A KINÁZ ERK1/2 A GSK-3β V SCN, V EPIFÝZE A VE STRUKTURÁCH HYPOTALAMU ZODPOVĚDNÝCH ZA REGULACI POTRAVNÍHO CHOVÁNÍ POSTUP STANOVENÍ EXPRESE PROTEINŮ POMOCÍ METODY IMUNOHISTOCHEMIE MATERIÁL A VYBAVENÍ POSTUP

7 4.3.3 POČÍTÁNÍ BUNĚK STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ VÝSLEDKY DENNÍ RYTMUS V EXPRESI PROTEINU STAT3 A JEHO FOSFORYLOVANÝCH FOREM V SCN VLIV INTRAPERITONEÁLNÍ APLIKACE LEPTINU NA AKTIVITU PROTEINU STAT3, A KINÁZ ERK1/2 A GSK-3β V SCN, V EPIFÝZE A VE STRUKTURÁCH HYPOTALAMU ZODPOVĚDNÝCH ZA REGULACI POTRAVNÍHO CHOVÁNÍ SUPRACHIASMATICKÁ JÁDRA EPIFÝZA OBLOUKOVÁ JÁDRA VENTROMEDIÁLNÍ HYPOTALAMUS DORSOMEDIÁLNÍ HYPOTALAMUS DISKUZE DENNÍ RYTMUS V EXPRESI PROTEINU STAT3 A JEHO FOSFORYLOVANÝCH FOREM V SCN VLIV INTRAPERITONEÁLNÍ APLIKACE LEPTINU NA AKTIVITU PROTEINU STAT3, A KINÁZ ERK1/2 A GSK-3β V SCN, V EPIFÝZE A VE STRUKTURÁCH HYPOTALAMU ZODPOVĚDNÝCH ZA REGULACI POTRAVNÍHO CHOVÁNÍ SUPRACHIASMATICKÁ JÁDRA EPIFÝZA OBLOUKOVÁ JÁDRA VENTROMEDIÁLNÍ HYPOTALAMUS DORSOMEDIÁLNÍ HYPOTALAMUS SHRNUTÍ ZÁVĚR LITERATURA

8 SEZNAM ZKRATEK 3V 3. mozková komora AgRP agouti-related protein ARC nuclei arcuate, oblouková jádra AVP arginin-vasopresin BMAL1 brain and muscle Arnt-like protein-1 CC coiled-coil doména CKI ε casein-kináza 1ε CLOCK circadian locomotor output cycles kaput CNTF ciliary neurotrophic factor CREB camp response element-binding protein, camp vazebný protein CRY cryptochrome DMH dorsomediální hypothalamus dmscn dorsomediální část suprachiasmatických jader ERK1/2 Extracellular regulated kinase 1 and 2 FERM four-point-one, ezrin, radixin and moesin GRP gastrin-releasing peptid GSK-3β glykogen syntáza kináza 3β HSF-1 heat shock transcription factor 1 IL interleukin JAK Janus Kináza LD light-dark cycle, režim světlo-tma LepBr leptinový receptor LPS lipopolysacharid MAPK mitogenem-aktivovaná protein kináza NE norepinefrin NPY neuropeptid Y OC optické chiasma PACAP pituitary adenylate cyclase-activating protein PER period perk1/2 fosforylovaná kináza ERK1/2 pgsk-3β fosforylovaná kináza GSK3β PIAS protein inhibitors of activated STATs 8

9 POMC proopiomelanokortin pstat3(s) fosforylovaná forma proteinu STAT3(S) pstat3(y) fosforylovaná forma proteinu STAT3(Y) PTPs protein tyrosine phosphatases RHT retinohypothalamic tract retinohypotalamická dráha RORα Retinoic acid-related orphan receptor α SCN suprachiasmatic nuclei, suprachiasmatická jádra Ser serin SH2 Src Homology 2 SHP2 protein-tyrozinová fosfatáza 2 SOCS suppressors of cytokine signaling SP1 specificity protein 1 STAT Signal Transducers and Activators of Transcription STAT3(S) fosforylovaný protein STAT3 na serinu STAT3(Y) fosforylovaný protein STAT3 na tyrosinu TAD transaktivační doména TNF-α tumor necrosis factor α TTFL transcription-translation feedback loop, transkripčně translační zpětnovazebné smyčky TYK2 tyrosin kináza 2 Tyr tyrosin VIP vasoaktivní intestinální polypeptid vlscn ventrolaterální část suprachiasmatických jader VMH ventromediálním hypotalamus ZT zeitgeber time, experimentální čas 9

10 1 ÚVOD Hlavní cirkadiánní pacemaker ležící v suprachiasmatických jádrech (SCN) hypotalamu, řídí metabolické procesy organismu a umožňuje jim být v souladu s denními změnami okolního prostředí. Tyto centrální cirkadiánní hodiny jsou seřizovány primárně světlem a synchronizují síť sekundárních cirkadiánních hodin lokalizovaných v mozku a dalších periferních orgánech. SCN reagují také na další signály, jako jsou například růstové faktory, opiody, případně cytokiny. Sekrece většiny metabolických hormonů je také řízena impulzy ze SCN. Mezi tyto hormony patří i leptin, syntetizovaný tukovou tkání a působící primárně na hypotalamická jádra kde aktivuje JAK/STAT(z angl. Janus kinase/signal transducers and activators of transcription) signální dráhu. Kromě hypotalamu ovlivňuje leptin také tvorbu melatoninu v epifýze. Od objevení, před více jak dvaceti lety, aktivace JAK/STAT signální dráhy řadou extracelulárních signálů se tato dráha stala jednou z nejvíce studovaných vnitrobuněčných signálních sítí. Hlavní funkcí JAK kinázou fosforylovaných proteinů STAT je jejich dimerizace a translokace do jádra buňky, kde se váží na specifické regulační sekvence a potlačují nebo aktivují transkripci cílových genů. Kromě JAK/STAT signální dráhy jsou v SCN i další dráhy, které se podílí na přenosu světelné informace a regulace hlavního cirkadiánního mechanismu v SCN. Mezi tyto dráhy patří dráha ERK1/2 (z angl. extracellular regulated kinase 1 and 2) a GSK-3β (glykogen syntáza kináza-3β). Nedávné výsledky naší laboratoře ukázaly, že protein STAT3 je silně exprimován v SCN. Proto se tato práce se zabývá cirkadiánní regulací proteinu STAT3 a jeho fosforylovaných forem v SCN a také vlivem exogenně podaného leptinu, přirozeného aktivátoru proteinu STAT3, na hladinu jeho fosforylovaných forem a fosforylovaných forem kináz ERK1/2 a GSK-3β v SCN, epifýze, dorsomediálním hypotalamu (DMH), obloukovém jádře (ARC, z angl. nucleus arcuate) a ventromediálním hypotalamu (VMH). 10

11 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 JAK/STAT SIGNÁLNÍ DRÁHA Vnitrobuněčná signální dráha JAK/STAT je jednou z mnoha užitečných kaskád působících napříč živočišnou říší, která slouží k převodu velkého množství signálů důležitých pro vývoj a homeostázu. Tato dráha je hlavním signalizačním mechanismem pro širokou řadu cytokinů a růstových faktorů. Aktivace JAK vede k buněčné proliferaci, diferenciaci, migraci a též apoptóze. Tyto buněčné děje jsou důležité například pro hematopoézu, pro vývoj a aktivaci imunitního systému nebo adipogenezi (Rawlings et al., 2004; Stark and Darnell, 2012). Obr. č. 1 zobrazuje JAK/STAT signální dráhu, která je popsána v dalších kapitolách. Obrázek č. 1: Schématické znároznění JAK/STAT signální dráhy. Aktivace JAK pomocí cytokinů vede k fosforylaci proteinů STAT, které dimerizují a přesouvají se do jádra, kde aktivují genovou transkripci. (Převzato a upraveno z Shuai and Liu, 2011.) JANUS KINÁZA Název této kinázy je odvozen od římského boha Januse, který je zobrazován se dvěma opačnými tvářemi. Janus je bohem začátků a konců, který se dívá zároveň do budoucnosti a minulosti. Toto je velmi vhodné podobenství, protože Janus kinázy vlastní dvě téměř identické fosfát-přenášející domény. Jedna doména s kinázovou aktivitou je negativně regulována druhou. 11

12 Rodina kináz JAK se skládá ze čtyř členů, JAK1, JAK2, JAK3 a tyrosin kinázy 2 (TYK2) (Wagner and Schmidt, 2011). Janus kinázy jsou charakteristické tím, že mají tandemové homologní kinázové domény na C-konci. Vazba JAK s intracelulární doménou různých cytokinů je zprostředkována doménou FERM (z angl. four-point-one, ezrin, radixin and moesin). Další společné motivy zahrnují doménu Src2 (SH2), pseudokinázovou doménu, která zprostředkovává serin/treonin kinázovou aktivitu a tyrosin kinázovou doménu. (Costa- Pereira et al., 2011; Stark and Darnell, 2012). Aktivace Janus kináz začíná jejich multimerizací indukovanou navázáním ligandu na receptor, který je s nimi spojen. Molekuly JAK se tak dostanou do těsné blízkosti a dochází k jejich vzájemné autofosforylaci a/nebo k trans-fosforylaci. Následně JAK fosforylují další cíle, včetně vlastních receptorů a proteinů STAT (Rawlings et al., 2004; Kiu and Nicholson, 2012) STAT PROTEINY Rodina proteinů STAT sestává ze sedmi proteinů kódovaných různým genem (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b a STAT6). Každý STAT obsahuje několik důležitých sekvencí: N-terminální doménu, tzv. coiled-coil (CC) doménu, hlavní DNAvazebnou doménu, spojovací oblast, SH2 doménu s tyrosinovým zbytkem a C-terminální transaktivační doménu (TAD). Obr. č. 2 zobrazuje rodinu proteinů STAT i s jednotlivými doménami. Obrázek č. 2: Rodina proteinů STAT. (Převzato a upraveno z Miklossy et al., 2013.) 12

13 Tyto proteiny slouží jako transkripční faktory a zprostředkovávají účinek mnoha ligandů, například cytokinů, hormonů, opioidů nebo růstových faktorů, na různé cílové geny. Ligand, který se váže na specifický receptor, aktivuje tyrosin kinázu z rodiny Jak nebo Src, která následně fosforyluje STAT proteiny lokalizované v cytoplazmě. Fosforylace konzervovaného tyrosinu ležícího u SH2 domény vede k dimerizaci dvou molekul STAT díky SH2- fosfotyrosinové interakci. Tato homo nebo heterodimerizace mění konformaci STAT proteinů, která jim umožní rozpoznat cílové sekvence DNA v jádře. V jádrech se takto váží na určité promotory genů a ovlivňují jejich expresi (Kiu and Nicholson, 2012). Fosforylace serinovými kinázami na serinovém zbytku v doméně TAD proteinů STAT zvyšuje genovou transkripci. Isoformy STAT, kterým chybí TAD, působí jako hlavní negativní regulátory genové exprese (Caldenhoven et al., 1996; Decker and Kovarik, 2000; Yang et al., 2005). Kromě výše popsaného hlavního signálního modelu bylo objeveno, že STAT proteiny mohou modulovat genovou expresi i bez fosforylovaného stavu (Yang and Stark, 2008). STAT proteiny také interagují i s jinými transkripčními faktory, např. HSF-1 (z angl. heat shock transcription factor 1) nebo SP1 (z angl. specificity protein 1), koaktivátory, s kinázou ERK2 a některými membránovými receptory (Chatterjee-Kishore et al., 2000). Každý STAT protein může být aktivován mnoha odlišnými extracelulárními podněty, které mohou být tkáňově specifické. Jeden typ extracelulárního podnětu, např. cytokinů může aktivovat různé podtypy proteinů STAT (Jeon et al., 2010). Vzhledem k tomu, že JAK/STAT signalizace je univerzální a základní intracelulární cesta pro působení cytokinů, vyvinula se řada mechanismů pro řízení intenzity a trvání aktivace proteinů STAT. Tyto mechanismy umožňují jemné ladění účinků cytokinů a brání přehnané aktivitě JAK/STAT kaskády často spojené s rozvojem různých onemocnění. Existují tři hlavní mechanizmy negativní regulace: defosforylace proteinů STAT fosfotyrozinovými fosfatázami (PTPs, z angl. protein tyrosine phosphatases), jejich přímá inhibice STAT inhibitory (PIAS, z angl. protein inhibitors of activated STATs) a pomocí cytokinových supresorů (SOCS, z angl. suppressors of cytokine signaling) (Rawlings et al., 2004; Kiu and Nicholson, 2012). Nejstudovanějším inhibičním mechanismem JAK/STAT signální dráhy jsou proteiny SOCS. Rodina těchto proteinů je zastoupena nejméně osmi členy s SH2 doménou a SOCS boxy na C-terminálním konci. SOCS proteiny vytváří jednoduchou zpětnou vazbu JAK/STAT kaskádě. Aktivované STAT proteiny stimulují transkripci Socs genů a výsledné SOCS proteiny se váží na fosforylované Janus kinázy a jejich receptory a inhibují jejich katalytickou aktivitu (Hilton et al., 1998; Kershaw et al, 2013). 13

14 Proteiny STAT1 a STAT2 se řadí mezi hlavní cíle cytokinů, které mohou pracovat jako nádorové supresory (Najjar and Fagard, 2010). Interleukiny (IL), zejména IL-12 a IL-4, aktivují proteiny STAT4 a STAT6 a jsou spojovány hlavně s revmatickými chorobami (Luan et al., 2012; Yamaoka et Tanaka, 2009). Protein STAT5 je znám zejména jako transkripční faktor epiteliálních buněk mléčné žlázy (Watson and Burdon, 1996). Obě formy STAT5 proteinu se ale vyskytují i v nervové tkáni a mohou se např. vázat na C-terminální doménu opioidních receptorů (Mazarakou and Georgoussi, 2005; Georganta et al., 2010). Nedávné práce naší laboratoře ukázaly, že obě formy se také vyskytují hojně v SCN (Moravcová et al., odesláno do tisku). Proteiny STAT3 jsou exprimovány ve většině tkání (Zhong et al., 1994) a jsou spojovány se signalizací aktivovanou růstovými hormony, např. CNTF (z angl. ciliary neurotrophic factor), cytokiny jako např. IL-6 nebo TNF-α (z angl. tumor necrosis factor α) a v některých strukturách mozku také leptinem hormonem tukové tkáně, důležitým regulátorem potravního chování a energetické rovnováhy (Bates and Myers, 2004; Colomiere et al., 2009). Pro funkci proteinu STAT3 je důležitá fosforylace dvou základních aminokyselin; tyrosinu v pozici 705 a serinu v pozici 727. Tyrosinová fosforylace STAT3 je nezbytná pro jeho vazbu na specifická místa DNA a iniciaci transkripce cílových genů. Význam serinové fosforylace není zcela jednoznačný. Některé studie poukazují na to, že fosforylace serinu 727 je důležitá pro vazbu STAT3 s vaznými proteiny CREB (z angl. camp response element-binding protein) (Schuringa et al., 2001) jiné studie uvádějí, že také může inhibovat fosforylaci tyrosinu 705 (Chung et al., 1997). Jaderný lokalizační signál je u STAT3 lokalizován v CC doméně (Liu et al., 2005). 2.2 LEPTIN Leptin je hormon produkovaný tukovou tkání v závislosti na zásobě triglyceridů a slouží jako rozhodující ukazatel dlouhodobého stavu energie v organismu (Maffei et al., 1995). Tento hormon působí hlavně v hypotalamu, kde je jeho činnost spojená s dalšími adipokiny, gastrokiny a dalšími signály, které řídí energetickou homeostázu a termogenezi v hnědé tukové tkáni (Meyers et al., 2009; Ring and Zeltser, 2010; Rezai-Zadeh et al., 2014) PŮSOBENÍ LEPTINU V JÁDRECH HYPOTALAMU REGULUJÍCÍCH POTRAVNÍ CHOVÁNÍ V mozku působí leptin na velké množství neuronů s leptinovými receptory (LepRb), primárně lokalizovaných v hypotalamu a mozkovém kmeni (Patterson et al., 2011). Zatímco 14

15 působení leptinu na jádro tractu solitarius hraje roli v modulaci sytosti, aktivace neuronů ventrální tegmentální oblasti leptinem se podílí na kontrole systému odměny a trestu (Hommel et al., 2006; Hayes et al., 2010). Leptin v oblastech hypotalamu působí na populace neuronů nacházející se zejména v laterální hypotalamické oblasti, ve VMH, a DMH a v ARC (Scott et al., 2009; Patterson et al., 2011). Nejstudovanější oblastí z hlediska působení leptinu jsou ARC, ve kterých leptin inhibuje neurony vyplavující orexigenní agouti-related protein a neuropeptid Y (AgRP/NPY) a stimuluje neurony produkující anorexigenní proopiomelanokortin (POMC). POMC neurony produkují anorexigenní neuropeptidy, zatímco AgRP je silný antagonista melanokortinového systému a NPY je nejvýznamnější orexigenní peptid v mozku (Schwartz et al., 2000). Leptin tedy působí na ARC jako periferní signál sytosti a v přirozených podmínkách vyvolává anorexigenní stav. Oblast VMH reguluje potravní chování a metabolismus neboť jeho léze vyvolává hyperfágii, obesitu a diabetes, a zvyšuje hladinu kortikoidů (Gold, 1973; Dallman, 1984; Keesey and Powley, 1986; van Swieten et al., 2014.). Působení leptinu ve VMH je nejčastěji studováno v souvislosti s metabolismem glukózy a regulací hladiny glukagonu u myších modelů diabetu. Ukazuje se, že aktivace intracelulární signalizace neuronů VMH leptinem vede ke snížení diabetické hyperglykémie normalizací plazmového glukagonu. VMH tedy zprostředkovává antidiabetické působení leptinu na svalový a jaterní metabolismus (Meek et al., 2013). Oblast DMH řídí pohybovou aktivitu a účastní se regulace termogeneze hnědou tukovou tkání. Neurony DMH obsahují mnoho LepRb a jejich aktivace leptinem je nezbytná pro regulaci energetického metabolismu, teplotní homeostázu a udržení tělesné hmotnosti živočichů (Enriori et al., 2011; Zheng et al., 2011). U myší aplikace leptinu snížila chuť k jídlu a zvýšila aktivitu sympatických nervů (Zhang et al., 2011). Význam DMH v homeostáze tělesné hmotnosti je podpořena zjištěním, že DMH dostává signály z ARC a má zásadní eferentní výstupy do dalších hypotalamických oblastí (Bouret et al., 2004). Aktivace leptinových receptorů také indukuje pohybovou aktivitu, zatímco jejich inaktivace pohybovou aktivitu snižuje (Rezai-Zadeh et al., 2014). Na Obr. č. 3 jsou znázorněny hlavní hypotalamické oblasti, na které leptin působí. 15

16 Obrázek č. 3: Působení leptinu v hypotalamu. Leptin působí přes svůj receptor (LepRb) na neurony propojených jader hypotalamu a reguluje tak pocit sytosti a neuroendokrinní funkce. V obloukovém jádře (ARC) kontroluje melanokortinový systém pomocí proopiomelanokortinových (POMC) a agouti-related protein (AgRP) syntetizujících neuronů. VMH ventromediální hypotalamus, DMH dorsomediální hypotalamus, LHA laterální hypotalamická oblast, PVH paraventrikularní hypotalamus, MC4R melanokortinový receptor 4. Plné čáry přímé dráhy z ARC do PVH, šrafované čáry další signální dráhy mezi hypotalamickými jádry. (Převzato a upraveno z Allison and Myers, 2014.) LEPTIN JAKO AKTIVÁTOR JAK/STAT SIGNALIZACE Leptin je vyloučen tukovou tkání do krevního oběhu a míří do mozku přes choroidní plexus a cirkumventrikulární orgány a váže se na LepRb exprimované v určitých oblastech hypotalamu a jádrech mozkového kmene (Elias et al., 2000; Scott et al., 2009; Patterson et al., 2011). Hematoencefalickou bariéru překonává pomocí saturačního transportního systému (Banks et al., 1996). LepBr je cytokinový receptor, který se vyskytuje na buněčné membráně jako monomer nebo dimer (Devos et al., 1997). Na rozdíl od většiny cytokinových receptorů vazba leptinu neaktivuje LepBr prostřednictvím dimerizace receptoru, ale pomocí konformační změny, která vede k autofosforylaci a aktivaci JAK2 navázané na motivy Box1 a Box2 v membránové části LepBr (Kloek et al., 2002). Aktivovaná JAK2 následně fosforyluje LepRb na třech pozicích tyrosinu: tyrosin 985, tyrosin 1077 a tyrosin (Banks et al., 2000). Po navázání leptinu na LepRb dojde k aktivaci několika signálních drah. Fosforylovaný Tyrosin 1138 na LepRb řídí fosforylaci proteinu STAT3 na tyrosinu (pstat3(y)) (Banks et al., 2000). Aktivovaný pstat3 se přesouvá do jádra, kde indukuje expresi cílových genů, 16

17 včetně genu pro SOCS3. Tento supresor poté způsobí inhibici dráhy aktivované LebRb (Bjorbaek et al., 1999). Fosforylace tyrosinu 985 vede k aktivaci protein-tyrozinové fosfatázy 2 (SHP2) a následné aktivaci ERK signální dráhy (Bjorbaek et al., 2001). Tyrosin 985 také slouží také jako vazebné místo pro SOCS3 a je tedy důležitý pro zpětnou inhibici LepRb (Bjorbaek et al., 2000). Četné signální dráhy aktivované LepRb z nichž přední místo zaujímá dráha STAT3, regulují energetickou homeostázu, (Bates and Myers, 2003). Mutace, které deaktivují LepRb, stejně jako antagonisté tohoto receptoru, potvrzují, že LepRb je nezbytný pro působení leptinu v mozku (Tartaglia, 1997). U myších jedinců substituční mutace v tyrosinech LepRb, která zabraňuje aktivaci STAT3, vede k hyperfagii a obezitě, a slouží jako model pro studium diabetu (Bates et al., 2003). Myši se selektivní delecí STAT3 v neuronech s exprimovaným LepRb trpí také hyperfagií a obezitou, ale mají částečně zachovanou homeostázu glukózy, která je pravděpodobně řízena signální kaskádou ERK1/2 z VMH (Piper et al., 2007; Toda et al., 2013). Energetická bilance pomocí STAT3 signalizace je nejlépe popsána v ARC. Delece STAT3 z neuronů syntetizujících AgRP vede k lehké obezitě, zvýšené expresi NPY a snížené citlivosti na leptin (Gong et al., 2008). Pokud dojde k deleci STAT3 v neuronech syntetizujících POMC, tak se také lehce zvýší ukládání tuků v organismu. Z těchto nálezů je možné předpokládat, že role STAT3 po působení leptinu je větší v neuronech exprimujících AgRP (Xu et al., 2007). Na druhou stranu, mutantní, konstitutivně aktivní forma STAT3 exprimovaná v ARC v AgRP neuronech vyvolává anorexii a s ní spojenou nízkou váhu, zatímco v POMC neuronech obezitu (Ernst et al., 2009). 2.3 CIRKADIÁNNÍ SYSTÉM Chování a fyziologické procesy jsou řízeny hierarchicky uspořádaným systémem cirkadiánních (z latinského circa dies zhruba denní) oscilátorů lokalizovaných v mozku a ve většině periferních tkání. Cirkadiánní rytmy jsou generovány endogenně a jejich perioda není rovna 24 hodinám. Proto je nutná synchronizace s vnějším prostředím pomocí světla tzv. retinohypotalamickou dráhou (RHT) (Albrecht, 2012). Cirkadiánní systém, jehož funkce lze vystopovat až do raných životních forem, pomáhá organismům připravovat se na pravidelné činnosti, např. spánek a bdění, příjem potravy, aktivitu a jiné (Mohawk et al., 2012). 17

18 Základním mechanismem cirkadiánních oscilací, znázorněným na Obr. č. 4, jsou transkripčně-translační pozitivně-negativní zpětnovazebné smyčky tzv. hodinových genů. Mezi proteiny hodinových genů primární smyčky patří transkripční faktory CLOCK (the circadian locomotor cycles kaput) a BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein-1). Tyto proteiny spolu tvoří v jádře heterodimer a jeho navázáním na E-boxy promotorů dalších hodinových genů Per1, Per2 a Per3 (Period) a Cry1 a Cry2 (Cryptochrome) spustí jejich transkripci. Proteiny PER a CRY se hromadí v cytoplazmě a vytváří také heterodimery. PER:CRY heterodimery se vrací zpět do jádra a potlačují aktivitu heterodimeru CLOCK:BMAL1. Posttranlačními modifikacemi v cytoplazmě, hlavně fosforylací caseinkinázou 1ε (CKI ε) a GSK-3β dochází k degradaci komplexu PER:CRY, tudíž proteiny CLOCK a BMAL1 mohou spustit další transkripci (Takahashi et al., 2008). Protein kináza ERK1/2 fosforyluje a tím negativně reguluje hodinové proteiny BMAL1, CRY1 a CRY2 (Sanada et al., 2002). Sekundární smyčka, která ustaluje funkci cirkadiánních hodin, se skládá z RORα (Retinoic acid-related orphan receptor α) a Rev-ERBα genů. Transkripce těchto genů je také pomocí komplexu CLOCK:BMAL1. Proteiny RORα a REV-ERBα následně regulují expresi samotného genu Bmal1 (viz. Obr. č. 4) (Preitner et al., 2002) SUPRACHIASMATICKÁ JÁDRA U savců každá buňka obsahuje své vnitřní hodiny a ty dohromady tvoří cirkadiánní systém. Hlavní řídící centrum leží v hypotalamu - nad optickým chiasma, v SCN. Tyto jádra se dělí na část ventrolaterální (vlscn), tzv. jádro a dorsomediální (dmscn), tzv. slupku (Moore et al., 2002) (viz. Obr. č. 5). Informace o světle jsou vnímány fotosenzitivními gangliovými buňkami v sítnici, obsahujícími specifický fotopigment melanopsin. Tyto buňky posílají světelnou informaci přímo do SCN přes RHT. Vlákna této monosynaptické dráhy končí ve vlscn na neuronech, které exprimují vasoaktivní intestinální polypeptid (VIP) a gastrin-releasing peptid (GRP). Světelná stimulace sítnice během subjektivní noci vede k uvolnění neurotransmiteru glutamátu a PACAP (z angl. pituitary adenylate cyclase-activating protein) na terminální synapsi RHT (Ecker et al., 2010) a aktivuje signální dráhy vedoucí k indukci transkripce hodinových genů Per (Golombek and Rosenstein, 2010). Do vlscn vedou také dráhy z intergenikulátního lístku talamu, odkud přicházejí genikulohypotalamickým traktem informace o světelných i nesvětelných podnětech a z mediálního raphe vstupuje do vlscn serotogenní inervace (Leak and Moore, 2001). Neurony dmscn syntetizují calretinin a 18

19 arginin-vasopresin (AVP) a tato oblast SCN přijímá většinu signálů z vlscn. VIP, které je rytmicky uvolňované z vlscn, synchronizuje dmscn (Golombek and Rosenstein, 2010). Tato hypotalamická jádra u savců řídí pomocí humorálních a neurálních signálů periferní cirkadiánní hodiny, které jsou například v kosterním svalstvu, srdci, játrech, tukových tkáních nebo v epifýze a mnoha částech mozku, např. DMH nebo VMH (Reppert and Weaver, 2002; Mohawk et al., 2012). Obrázek č. 4: Schéma transkripčně translační zpětnovazebné smyčky (TTFL). Suprachiasmatická jádra přijímají informaci o světle ze sítnice retinohypotalamickým traktem (RHT), který uvolňuje glutamát a PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide). Světelný signál způsobí vtok iontů vápníku (Ca 2+ ) do buňky, který aktivuje kaskádu proteinových kináz, ERK1/2. Ty následně aktivují CREB transkripční faktor, který se váže na CRE místo a zvyšuje transkripci Per1 a Per2 genů. Mezi aktivátory TTFL se řadí v jádře BMAL1 a CLOCK proteiny, které spolu během dne vytvoří heterodimer, který svojí vazbou přes E-box zahajuje transkripci Per1, Per2, Cry1, Cry2 a tzv. hodinami kontrolovaných genů. Proteiny těchto genů v cytoplazmě spolu interagují a po fosforylaci kasein kinázami Iε/δ (CK Iε/δ) a glykogen syntázovou kinázou-3 (GSK-3) se přemisťují do jádra, kde inhibují svojí transkripci. Sekundární smyčka znázorňuje transkripci samotného Bmal1 genu, která je řízena ROR a REV-ERB receptory přes RORE oblast. (Převzato a upraveno z Mohawk et al., 2012.) 19

20 Obrázek č. 5: Struktura suprachiasmatických jader (SCN). Světelná informace přicházející přes sítnici do SCN. PACAP - pituitary adenylate cyclase-activating protein, dmscn dorsomediální hypotalamus, vlscn ventrolaterální hypotalamus. (Převzato a upraveno z Hafner et al., 2012.) EPIFÝZA Epifýzu se SCN spojuje multisynaptická dráha. Cirkadiánní signály ze SCN jsou přenášeny postupně do paraventrikulárního jádra hypotalamu, intermediolaterálního jádra spinální míchy, superiorního cervikálního ganglia a odtud sympatickým systémem do epifýzy (Borjigin et al., 1999; Kalsbeek et al., 2000). Epifýza je také inervována parasympatickým systémem (Larsen, 1999), ale jeho role a regulace je dosud neznámá. Primární funkce tohoto nepárového neuroendokrinního orgánu je přenos informace o světle a tmě do celého těla prostřednictvím hormonu melatonin (Borjigin et al., 2012). Tvorba melatoninu je regulována primárně neurotransmiterem norepinefrinem (NE) vylučovaným sympatickým zakončením na základě stimulů z SCN, který svojí vazbou na adrenergní receptory aktivuje dráhu syntézy tohoto hormonu (Johnston and Skene, 2015). Kromě NE, může být syntéza melatoninu modulována, například i PACAP, NPY a insulinem (Simonneaux and Ribelayga, 2003; Peliciari-Garcia et al., 2008). Leptin patří mezi další regulátory tvorby melatoninu. Podáním leptinu se zvýší hladina proteinu STAT3 v epifýze, který je důležitým aktivátorem signální dráhy leptinu. Tato indukce STAT3 nemá žádný vliv na syntézu melatoninu, kdežto samotný leptin inhibuje tvorbu melatoninu (Peliciari-Garcia et al., 2013). Stejně jako většina buněčných typů a tkání vlastní cirkadiánní mechanismus, který se projevuje expresí hodinových genů, tak ani epifýza není výjimkou (Yoshikawa et al., 2005). Odstraněním sympatických vláken vedoucích ze SCN jsou cirkadiánní rytmy epifýzy zrušeny, což naznačuje, že hodinový systém epifýzy není dostatečný k vytváření cirkadiánního rytmu 20

21 melatoninu. Přesto nelze vyloučit možnost, že oscilace rytmů epifýzy potřebují více než jeden signál z lokálních hodinových složek kromě signálů ze SCN. Role samotných hodinových genů v modulaci SCN-regulované rytmicity epifýzy zůstávají předmětem dalšího výzkumu, podobně jako jejich regulace skrz JAK/STAT signální dráhu ROLE LEPTINU A PROTEINU STAT3 V CIRKADIÁNNÍM SYSTÉMU Hormony regulující metabolismus, včetně leptinu, vykazují cirkadiánní oscilace ve své produkci (Ahima et al., 1998; Bodosi et al., 2004). Cirkadiánní hladina leptinu v plazmě dosahuje maxima během časné až střední světelné periody nočních živočichů, jako jsou potkani a myši (Kalsbeek et al., 2001). U lidí rytmus leptinu vykazuje denní rytmus v krevním séru s vysokými hladinami v době spánku (Shea et al., 2005). Ablace SCN eliminuje cirkadiánní rytmus leptinu u hlodavců, což naznačuje, že centrální cirkadiánní hodiny regulují jeho syntézu (Kalsbeek et al., 2001). Nedávná studie ukázala, že operativní odstranění epifýzy křečkům způsobuje také ztrátu cirkadiánního rytmu v produkci leptinu (Chakir et al., 2015). To naznačuje, že syntéza leptinu tukovou tkání je regulována z SCN nepřímo, prostřednictvím oscilující hladiny melatoninu. Aplikace leptinu může fázově posouvat rytmus v koncentraci krevní glukózy a také rytmus v příjmu potravy myší (Grosbellet et al., 2015). Leptinový receptor je lokalizován v neuronech SCN (Guan et al., 1997; Yi et al., 2006) a je tedy možné, že se leptin váže přímo na neurony SCN. Tento předpoklad potvrzuje nález, kdy aplikace leptinu na in vitro kultury SCN, vyvolala fázové předběhnutí rytmu v elektrické aktivitě a ukázalo se, že leptin má přímý vliv na samotné cirkadiánní hodiny (Prosser and Bergeron, 2003). Ve většině oblastí mozku působí leptin aktivaci JAK/STAT signální kaskády. V SCN byla nalezena vysoká hladina proteinu STAT3, jejíž funkce není zatím prozkoumána. Zdá se, že hraje roli v imunitní odpovědi cirkadiánního pacemakeru na stimulaci endotoxinem lipopolysachariem (LPS) (Moravcová et al., v přípravě). Zda se může účastnit také přenosu informace z LepRb v SCN není zatím známo PROTEIN KINÁZA ERK1/2 Mitogenem-aktivovaná protein kinázová dráha (MAPK) je vedle JAK/STAT dráhy dalším příkladem intracelulární kaskády převádějící extracelulární podněty do buněčného jádra k indukci či inhibici genové exprese. Všechny eukaryotní buňky mají několik MAPK drah, které koordinovaně řídí různorodé buněčné aktivity od regulace genové exprese, mitózy, buněčné diferenciace a proliferace (Roux and Blenis, 2004). 21

22 MAPK dráhy patří také mezi klíčové signální dráhy cirkadiánního systému. MAPK dráha je v SCN aktivována hlavně po světelném pulsu jak glutamátem, tak PACAP. Tato dráha je složena ze tří po sobě jdoucích serin-treoninových kináz, Raf, MAP kinase kinase a ERK1/2. ERK1/2 fosforyluje řadu cytosolických substrátů a přemisťuje se do jádra, kde usnadňuje genovou transkripci (Butcher et al., 2005). Po světelné stimulaci během noci nebo subjektivní noci, dochází k fosforylaci serinu a treoninu kinázy ERK1/2 ve vlscn, s maximem do 15 minut od osvětlení (Doi et al., 2007). Narušení světlem indukované aktivity ERK1/2 blokuje synchronizaci cirkadiánních hodin (Butcher et al., 2002). Proto je ERK1/2 signální dráha nedílnou součástí mechanismu propojujícího fázové změny cirkadiánního systému a světelnou stimulaci (Dziema et al., 2003). Hladina fosforylovaného proteinu ERK1/2 (perk1/2) má v SCN také endogenní rytmus a dosahuje ve vlscn maxima v noci a v dmscn během subjektivního dne (Nakaya et al., 2003; Pačesová et al., 2015). Význam této antagonistické regulace v SCN není zcela zřejmý. Je možné, že mají vliv na molekulární podstatu cirkadiánních oscilací různou fosforylací proteinu BMAL1 (Sanada et al., 2002). Hladina perk1/2 v obou částech SCN ale odlišně reaguje na některé stimuly z vnějšího prostředí. Akutní aplikace morfinu například zvyšuje její hladinu v obou částech SCN, pokud je podán ve světlé části dne, ale pokud je podán v noci, výrazně snižuje její hladinu avšak pouze ve vlscn (Pačesová et al., 2015). Kináza ERK1/2 je aktivována mnoha extracelulárními podněty a také leptinem. Leptinem indukovaná perk1/2 v neuronech VMH vede například ke zvýšení využití glukózy v kosterním svalstvu (Toda et al., 2013). Leptin aktivuje ERK1/2 dráhu také v ARC, která přispívá ke kontrolovanému příjmu potravy a udržování tělesné hmotnosti (Rahmouni et al., 2009) PROTEIN KINÁZA GSK-3β GSK-3 je také serin-treoninová kináza, která byla poprvé objevena jako fosforylační enzym glykogen syntázy. Kromě nedílné součásti glykogenového metabolismu, GSK-3 pracuje jako regulátor dalších buněčných procesů. V mozku je vysoká hladina kinázy GSK-3 a její patologické změny jsou spojeny s různými neurologickými poruchami, jako je Alzheimerova choroba, bipolární porucha nebo vznik rakoviny (Doble and Woodgett, 2003; Rayasam et al., 2009). U savců existují dvě formy GSK-3, GSK-3α a GSK-3β, které jsou strukturně podobné, ale liší se funkčně. Aktivita GSK-3 kinázy je primárně řízena fosforylací regulačních serinových 22

23 zbytků, serin 21 u GSKα a serin 9 u GSKβ, která inhibuje aktivitu kinázy (Jope and Johnson, 2004). Kináza GSK-3β je nedílnou součástí cirkadiánního systému, kdy její hlavní úlohou je fosforylace proteinu PER2, čímž napomáhá translokaci PER2 do jádra (Iitaka et al., 2005) a fosforylace proteinu CRY2, čímž napomáhá jeho degradaci (Harada et al., 2005). Fosforylovaná forma této kinázy (pgsk-3β) osciluje jak ve vlscn, tak dmscn s maximem během noci v čase ZT21 a je nejnižší v čase ZT11 (Iitaka et al., 2005; Pačesová et al., 2015). Kináza GSK-3β je také nutná pro aktivaci fosforylace proteinu STAT3 při zánětlivých procesech (Beurel and Jope, 2008). Nedávné studie ukázaly, že rytmická hladina GSK-3β v SCN reaguje analogicky jako perk1/2 na aktivaci opioidních receptorů morfinem (Pačesová et al., 2015). 23

24 3 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cíle této diplomové práce jsou následující: Popsat denní rytmus hladiny proteinu STAT3 a jeho fosforylovaných forem v SCN potkana. Zjistit, zda působení leptinu na cirkadiánní pacemaker v SCN je zprostředkováno aktivací transkripčního faktoru STAT3 podobně jako v jiných hypotalamických strukturách. Zjistit, zda působení leptinu na SCN má vliv také na základní signální kaskády cirkadiánních hodin reprezentované kinázami ERK1/2 a GSK-3β. Zjistit, zda leptin působí na signální dráhy v epifýze struktuře zodpovědné za syntézu melatoninu, která je přímým působením leptinu potlačována. Zjistit, zda cirkadiánní systém reguluje citlivost hlavních cílových hypotalamických struktur pro leptin, jako jsou ARC, VMH a DMH. 24

25 4 MATERIÁL A METODY 4.1 EXPERIMENTÁLNÍ ZVÍŘATA Ve všech experimentech byli použiti dospělí samci (300 g) laboratorního potkana kmene Wistar (Velaz s.r.o.). Zvířata byla krmena standardní krmnou směsí. Přístup k potravě a pitné vodě měla zvířata ad libitum. Teplota byla po čas experimentu udržována na 23 C ± 2 C. 40 W zářivky zajišťovali denní světlo a jeho intenzita se pohybovala v rozmezí 150 a 250 lux, v závislosti na umístění chovných klecí. Stanovený světelný režim byl spravován automatickými spínacími hodinami. 4.2 EXPERIMENTÁLNÍ PARADIGMA Zvířata byla 14 dní před pokusem chována ve světelném režimu 12 hodin světla a 12 hodin tmy (LD 12:12, z angl. light-dark) EXPERIMENT 1 - DENNÍ RYTMUS V EXPRESI PROTEINU STAT3 A JEHO FOSFORYLOVANÝCH FOREM V SCN Cílem prvního experimentu bylo zjistit, zda protein STAT3 a jeho fosforylované formy vykazují denní rytmus u zvířat, která byla adaptována v LD 12:12 podmínkách. Zvířata byla odebírána ve 4 hodinových intervalech 24 hodinového cyklu (viz schéma na Obr. č. 6). Hladina proteinu STAT3 byla stanovována na tkáňových řezech v oblastech SCN pomocí imunohistochemie (viz 4.3). Obrázek č. 6: Časová osa odběru vzorků v experimentu 1. Zeitgeber time (ZT) určuje čas v podmínkách, kde vnějším synchronizátorem je světlo a tma. Čas ZT 0 je čas rozsvícení a ZT 12 značí čas zhasnutí. Červené šipky znázorňují čas, kdy byla zvířata usmrcena (n=3). 25

26 4.2.2 EXPERIMENT 2 - VLIV INTRAPERITONEÁLNÍ APLIKACE LEPTINU NA AKTIVITU PROTEINU STAT3, A KINÁZ ERK1/2 A GSK-3β V SCN, V EPIFÝZE A VE STRUKTURÁCH HYPOTALAMU ZODPOVĚDNÝCH ZA REGULACI POTRAVNÍHO CHOVÁNÍ Ve druhém experimentu jsme chtěli zjistit, zda aplikace leptinu ovlivňuje aktivitu proteinu STAT3 v SCN, v epifýze a dalších strukturách hypotalamu. Jako další struktury jsme si vybrali ARC, VMH a DMH. Aktivita transkripčních faktorů STAT3 a proteinových kináz ERK1/2 a GSK-3β byla opět stanovována pomocí metody imunohistochemie (viz. 4.3). Aplikace leptinu byla rozdělena na denní a noční podání. Leptin byl podáván intraperitoneálně (1mg/kg). Schéma pokusu je znázorněno na obr. č. 7. Obrázek č. 7: Časová osa odběru vzorků v experimentu 2. Čas ZT 0 je čas rozsvícení a ZT 12 značí čas zhasnutí. Červené šipky znázorňují aplikaci leptinu ve dne (ZT9) a v noci (ZT18). Žluté šipky zobrazují odběry zvířat po denní aplikaci leptinu, modré šipky po noční aplikaci (n=2). 4.3 POSTUP STANOVENÍ EXPRESE PROTEINŮ POMOCÍ METODY IMUNOHISTOCHEMIE V obou experimentech jsme používali imunohistochemickou metodu, která prokazuje přítomnost antigenů ve tkáni za pomocí vazby specifických protilátek. 26

27 4.3.1 MATERIÁL A VYBAVENÍ Přístroje: Cryocut Leica CM 1850, Světelný mikroskop Olympus Provis Potřeby: Roztoky a chemikálie: Kultivační jamky, inkubační komůrky, plastové kyvety, štětec, pinzeta, běžné laboratorní potřeby 0,01 M fosfátový pufr, ph =7,4 (PBS, phosphate-buffered saline; Sigma), 20% sacharóza (v 0,1 M fosfátovém pufru, ph=7,4; Penta), 70% a 96% etanol (EtOH; Penta), xylen (Penta), DPX mountant for histology (Sigma), thiopental sodný (rozpuštěný v 10 ml dh 2 O, INC Czech Republic a.s.), heparin (Zentiva), želatina (Carl ROTH), domestos (Unilever Hungary Ltd.), 0,5% a 30% peroxid vodíku (H 2 O 2 ; Penta), 0,3% Triton-X (Sigma), 1% a 0,3% BSA pufr (bovine serum albumine, hovězí sérový albumin; Sigma), 3,3 -diaminobenzidin (DAB; Sigma), Cryomount (zelévací médium pro zmrazené řezy; Bamed s.r.o.), 4 % PFA (paraformaldehyd; Sigma-Aldrich), Leptin from rat (Sigma Aldrich) Kity: Vectastain ABC KIT PK-6101 Rabbit IgG (Vector Laboratories Ltd.) Primární protilátky: anti-stat3 (Cell Signalling Technologies) ředění 1:300 anti-phoshp-stat3 (Tyr705) (Cell Signalling Technologies) ředění 1:300 anti-phospho-stat3 (Ser727) (Cell Signalling Technologies) ředění 1:300 anti- p44/42 MAPK (perk1/2) (Cell Signalling Technologies) ředění 1:1500 anti- Phospho-GSK-3β (Ser9) (Cell Signalling Technologies) ředění 1:600 27

28 Roztoky: Avidin-biotin-peroxidáza (ABC): ředění 1:400 roztoku A + ředění 1:400 roztoku B do 0,3% BSA BSA pufr: 1% roztok BSA ředěný PBS + 0,3% Triton-X 100 DAB: 10 mg (tableta) rozpuštěná ve 20 ml PBS + 7 µl 30% H 2 O 2 0,01 M fosfátový pufr (ph=7,4): obsah sáčku rozmíchán v 1 l destilované vody 4% PFA: na magnetickém míchadle rozmícháno 80 g PFA v 1 l PBS při 80 C, do čirého roztoku; po vychladnutí byl roztok naředěn PBS do celkového objemu 2 l, ph upraveno na 7,2; vzniklý 4% roztok PFA byl přefiltrován do perfuzní lahve 20% sacharóza: 20 g sacharózy rozmícháno ve 100 ml 0,01 M PBS POSTUP Provedení anestezie potkanů intraperitoneální injekcí thiopentalu (50 mg/kg) Aplikace heparinu do levé komory srdeční (zamezení srážení krve) Zavedení kanyly do aorty ascendens a promytí oběhového systému roztokem PBS po dobu 3 minut a následná fixace 4% roztokem PFA po dobu 5 minut Vyjmutí mozků a následná fixace v 4% roztoku PFA dalších 12 hodin a poté vložení do 20% roztoku sacharózy (kryoprotektivní funkce) a inkubace při teplotě 4 C po dobu nejméně 24 hodin Uchování vzorků v suchém ledu při -80 C Krájení vzorků na 30 µm silné řezy v oblasti mediálního SCN a dalších struktur pomocí přístroje Cryocut Leica CM 1850 při teplotě -22 C. Řezy mozku byly štětcem přeneseny do jamek s PBS; do každé jamky 28

29 vždy pipetováno 0,3 ml PBS. Řezy epifýz byly zachyceny na želatinová podložní skla. Promývání řezů v 0,01 M PBS 2x 5 minut Zablokování endogenních peroxidáz 0,5% H 2 O 2 10 minut Promývání řezů v 0,01 M PBS 3x 5 minut Zablokování nespecifického pozadí 2% roztokem séra NGS ředěného v 1% BSA 60 minut Inkubace řezů v primární protilátce (ředění v 1% BSA) přes noc (4 C) Promývání řezů v 0,3 % BSA 3x 5 minut Inkubace řezů v sekundární biotinylované protilátce 60 minut Promývání řezů v 0,3 % BSA 3x 5 minut Inkubace řezů v ABC komplexu (ředění 1:400, příprava 30 minut předem) 60 minut Promývání řezů v 0,3 % BSA 5 minut Promývání řezů v 0,01 M PBS 2x 5 minut Inkubace řezů v roztoku DAB 1-5 minut Barevná reakce zastavena promývaním řezů v 0,01 M PBS 3x 5 minut Pomocí štětce řezy naneseny na želatinová podložní skla Zaschnutí řezů přes noc Odvodnění řezů: o omytí destilovanou vodou o 70% etanol 5 minut o 96% ethanol 2x 5 minut o xylen 3x 5 minut Fixace řezů pokapáním DPX a přikrytím krycího skla POČÍTÁNÍ BUNĚK Připravené řezy na želatinových sklech byly nafoceny světelným mikroskopem Olympus Provis. Pro další postup byly vybrány vzorky s mediální částí SCN, ARC, VHM a DMH (viz. Obr. č. 8, 9). Počet imunopozitivních buněk byl počítán manuálně v počítačovém programu ImageJ(NIH). Vybrané struktury byly v programu ohraničeny a všechny buňky uvnitř byly započítávány. 29

30 Obrázek č. 8: Suprachiasmatická jádra potkana. SCN suprachiasmatická jádra. (převzato a upraveno podle Paxinos and Watson, 2009). Obrázek č. 9: Vybraná jádra hypothalamu potkana. ARC oblouková jádra (z angl. nuclei arcuate), DMH dorsomediální hypotalamus, VMH ventromediální hypotalamus (převzato a upraveno podle Paxinos and Watson, 2009). 30

31 4.3.4 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ Na hodnocení dat denních profilů proteinu STAT3 a jeho fosforylovaných forem byly použity následující statistické metody: Aritmetický průměr: x = Σxi / n Směrodatná odchylka: SD = [ (1/n 1) * Σ(xi x)2 ]1/2 Střední chyba průměru: SEM = SD/n1/2 Vzniklé rozdíly mezi skupinami jsme hodnotili jednocestnou analýzou variance ANOVA s hodnotou statistické významnosti P < 0,05. Data získaná z experimentu byla vynesená pouze jako aritmetické průměry se směrodatnou odchylkou neboť n = 2. 31

32 5 VÝSLEDKY 5.1 DENNÍ RYTMUS V EXPRESI PROTEINU STAT3 A JEHO FOSFORYLOVANÝCH FOREM V SCN Tento experiment měl za cíl zjistit, zda protein STAT3 vykazuje v SCN denní rytmus ve své expresi. Primárně jsme se zaměřili na nefosforylovanou formu STAT3. Hodnotili jsme také hladinu proteinu STAT3 fosforylovaného na serinu (pstat3(s)) a pstat3(y). Naše výsledky ukázaly, že hladina nefosforylované formy STAT3 se významně liší během 24 hodinového cyklu (F (11, 34) = 3,707; P < 0.01). Signifikantně největší nárůst imunoreaktivních buněk byl naměřen mezi ZT20 a ZT4 (F (6) = 8,626; P < 0.05) a pokles mezi ZT4 a ZT8 (F (6) = 11,285; P < 0.05) (Obr. č. 10 A). Hladiny obou fosforylovaných forem pstat3(s) a pstat3(y) nevykazují statisticky významný rytmus (Obr. č. 10 B). Obr. č. 11 ukazuje příklady imunohistochemické detekce jednotlivých forem STAT3 v SCN, které sloužili jako podklad pro kvantitativní hodnocení. A B Obrázek č. 10: Denní rytmus v expresi proteinu STAT3 v SCN. Data jsou dvojitě vynesena, v režimu LD12:12 (ZT12 doba zhasnutí). Každý časový bod (± S.E.M ze 3 zvířat) reprezentuje procento maximálního počtu STAT3-imunoreaktivních buněk v SCN. Nefosforylovaná forma STAT3 (A); kolečka pstat3(y), trojúhelníky pstat3(s) (B). 32

33 A B C Obrázek č. 11: Fotografie mediálních řezů SCN s maximální hladinou proteinu STAT3 v čase ZT4 (A), pstat3(s) v čase ZT16 (B) a pstat3(y) v čase ZT16 (C). OC optické chiasma, 3V 3. mozková komora. 5.2 VLIV INTRAPERITONEÁLNÍ APLIKACE LEPTINU NA AKTIVITU PROTEINU STAT3, A KINÁZ ERK1/2 A GSK-3β V SCN, V EPIFÝZE A VE STRUKTURÁCH HYPOTALAMU ZODPOVĚDNÝCH ZA REGULACI POTRAVNÍHO CHOVÁNÍ Ve druhém experimentu jsme také pomocí imunohistochemické metody zjišťovali, zda intraperinoneální aplikace leptinu ovlivní hladinu pstat3(s), pstat3(y), fosforylované formy ERK1/2 (perk1/2) a fosforylované formy GSK-3β (pgsk-3β) jak v SCN, epifýze, tak v ARC, DMH a VMH. Aplikace leptinu byla rozdělena na denní podání v čase ZT9 a noční v čase ZT18 (viz kapitola 4.2.2) SUPRACHIASMATICKÁ JÁDRA Počet imunoreaktivních buněk na protilátku proti pstat3(s) a pstat3(y) jsme počítali v celém SCN. Hladiny perk1/2 a pgsk-3β jsme hodnotili zvlášť pro vlscn a dmscn. Naše výsledky naznačují, že noční aplikace leptinu může mírně snížit hladinu pstat3(s) v čase ZT23, tj. 5 hodin po podání, avšak další hodnoty ukazují, že denní nebo noční aplikace leptinu významně neovlivňuje hladinu ani pstat3(s) ani pstat3(y) (Obr. č. 12 A, B). Hodnoty naměřené pro indukovanou perk1/2 ve vlscn naznačují, že po nočním podání leptinu může mírně klesat počet imunoreaktivních buněk v čase ZT23 podobně jako hladina pstat3(s), naopak může o něco narůst počet imunopozitivních buněk v dmscn (Obr. č. 12 C, D). K nejvýraznějšímu poklesu po aplikaci leptinu došlo u hladiny pgsk-3β ve vlscn; aplikace leptinu v čase ZT9 snížila počet imunoreaktivních buněk v ZT12 jak ve vlscn, tak i dmscn a v čase ZT17 došlo k poklesu pouze ve vlscn a naopak k mírnému nárůstu 33

34 v dmscn. Podání leptinu v noci snížilo počet imunoreaktivních buněk pgsk-3β pouze ve vlscn v čase ZT21 a ZT23 (Obr. č. 13 A, B). Statistický význam těchto rozdílů však nebyl stanoven, neboť data zahrnují hodnoty pouze ze dvou pokusných zvířat. Fotografie na obr. č. 14, 15 zobrazují SCN s detekcí studovaných proteinů v čase ZT23. A 120 SCN - pstat3(s) - LEPTIN B 120 SCN - pstat3(y) - LEPTIN % maximální hodnoty % maximální hodnoty ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 0 ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 C vlscn - perk1/2 - LEPTIN D dmscn - ERK1/2 - LEPTIN % maximální hodnoty % maximální hodnoty ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 0 ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 Obrázek č. 12: Vliv leptinu na hladinu pstat3(s) A, pstat3(y) B v SCN, perk1/2 C ve vlscn, perk1/2 D v dmscn (± SD ze 2 zvířat). Grafy jsou rozděleny do dvou částí, první čtyři sloupce znázorňují výsledky po denní aplikaci leptinu v čase ZT9 a šest sloupců na pravé straně po noční aplikaci leptinu v čase ZT18. Černé sloupce kontroly, šedé sloupce leptin. 34

35 A vlscn - pgsk-3β - LEPTIN B dmscn - pgsk-3β - LEPTIN % maximální hodnoty % maximální hodnoty ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 0 ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 Obrázek č. 13: Vliv leptinu na hladinu pgsk-3β A ve vlscn a pgsk-3β B v dmscn (± SD ze 2 zvířat). Grafy jsou rozděleny do dvou částí, první čtyři sloupce znázorňují výsledky po denní aplikaci leptinu v čase ZT9 a šest sloupců na pravé straně po noční aplikaci leptinu v čase ZT18. Černé sloupce kontroly, šedé sloupce leptin. A B C D Obrázek č. 14: Fotografie mediálních řezů SCN s maximální detekcí pstat3(s) - kontrola (A), po aplikaci leptinu (B), pstat3(y) kontrola (C), po aplikaci leptinu (D) v čase ZT23 pomocí specifických protilátek vizualizovaných diaminobenzidinem. OC optické chiasma, 3V 3. mozková komora. A B C D Obrázek č. 15: Fotografie mediálních řezů SCN s detekcí perk1/2 - kontrola (A), po aplikaci leptinu (B), pgsk-3β kontrola (C), po aplikaci leptinu (D) v čase ZT23 pomocí specifických protilátek vizualizovaných diaminobenzidinem. OC optické chiasma, 3V 3. mozková komora. 35

36 5.2.2 EPIFÝZA Po aplikaci leptinu v čase ZT9 nedošlo k žádné signifikantní změně hladiny pstat3(s) a pstat3(y) v epifýze. Je zde naznačen nepatrný vzestup hladin obou proteinů 3 hodiny po aplikaci leptinu. Noční aplikace leptinu ukázala podobné výsledky jako denní, kromě času ZT23, kdy došlo k mírnému poklesu počtu u pstat3(s)-imunoreaktivních buněk u stimulovaných zvířat v porovnání s kontrolními (Obr. č. 16 A, B). Hodnoty naměřené pro indukovanou perk1/2 ukazují pouze nárůst její hladiny 3 hodiny po denní aplikaci leptinu (Obr. č. 16 C). Aplikace leptinu nemá významný vliv na expresi pgsk-3β v epifýze (Obr. č. 16 D). Fotografie znázorňující epifýzu s imunohistochemickou detekcí studovaných proteinů v čase ZT12 jsou na obr. č. 17, 18. A EPIFÝZA - pstat3(s) - LEPTIN B EPIFÝZA - pstat3(y) - LEPTIN % maximální hodnoty % maximální hodnoty ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 0 ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 C 140 EPIFÝZA - perk1/2 - LEPTIN D 140 EPIFÝZA - pgsk-3β - LEPTIN % maximální hodnoty % maximální hodnoty ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 0 ZT 12 ZT 17 ZT 21 ZT 23 ZT 2 Obrázek č. 16: Vliv leptinu na hladinu pstat3(s) A, pstat3(y) B, perk1/2 C, pgsk-3β D v epifýze (± SD ze 2 zvířat). Graf je rozdělen do dvou částí, první čtyři sloupce znázorňují výsledky po denní aplikaci leptinu v čase ZT9 a šest sloupců na pravé straně po noční aplikaci leptinu v čase ZT18. Černé sloupce kontroly, šedé sloupce leptin. 36

37 A B C D Obrázek č. 17: Fotografie řezů epifýzy s detekcí pstat3(s) - kontrola (A), po aplikaci leptinu (B), pstat3(y) kontrola (C), po aplikaci leptinu (D) v čase ZT12 pomocí specifických protilátek vizualizovaných diaminobenzidinem. A B C D Obrázek č. 18: Fotografie řezů epifýzy s detekcí perk1/2 - kontrola (A), po aplikaci leptinu (B), pgsk-3β kontrola (C), po aplikaci leptinu (D) v čase ZT12 pomocí specifických protilátek vizualizovaných diaminobenzidinem OBLOUKOVÁ JÁDRA Denní aplikace leptinu neměla významný vliv na hladinu pstat3(s) v ARC. Naopak po nočním podání leptinu došlo ve všech časech ke snížení hladiny pstat3(s) v porovnání s kontrolními zvířaty (Obr. č. 19 A). Výsledky hodnocení změny hladiny pstat3(y) jsou založeny na malém množství vzorků a předběžně ukazují, že podání leptinu neovlivňuje bazální hladinu tohoto proteinu (Obr. č. 19 B). Výsledky sledování změny hladiny perk1/2 ukazují, že podání leptinu v ZT9 zvyšuje aktivitu této kinázy v obou sledovaných časech. Naopak podání leptinu v ZT18 může vyvolat snížení hladiny perk1/2, které je nejzřetelnější v ZT23, tedy 5 hodiny po podání leptinu (Obr. č. 19 C). Denní ani noční aplikace leptinu významně nemění hladinu proteinu pgsk-3β v obloukovém jádře. Jeho průměrná hladina je spíše snížená po denní aplikaci, noční podání naopak může mírně zvyšovat jeho množství v časech ZT21 a ZT2 (Obr. č. 19 D). 37