Cytometrická detekce intracelulárních signalizačních proteinů

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Cytometrická detekce intracelulárních signalizačních proteinů"

Michaela Žáková
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 Cytometrická detekce intracelulárních signalizačních proteinů Proč? Ačkoli značení povrchových antigenů může dobře charakterizovat různé buněčné populace, neposkytuje nám informace o funkční odpovědi buňky na stimul, která bezprostředně odráží intracelulární signalizační děje. Dokonce ani v případě, kdy je sledovaným antigenem cytokinový receptor nebo receptor s tyrosinkinázovou aktivitou, hladina tohoto antigenu ne vždy koreluje s buněčnou odpovědí na specifický ligand. Veronika Kanderová CLIP-Cytometrie V Úvalu 84, 15006, Praha 5 kanderov@seznam.cz

2 Co? Intracelulární signalizační dráhy představují složitou komunikační síť, která přenáší signály z mnoha povrchových receptorů do jádra, kde dochází k aktivaci učitých genových cílů. Tyto dráhy hrají důležitou úlohu v buněčné proliferaci, diferenciaci, přežívání, apoptóze a buněčné smrti. Fosforylace tyrosinových, serinových a threoninových zbytků je kritická pro kontrolu aktivity proteinů zúčastněných v těchto signálních drahách. Vývoj vysoce fosfo-specifických protilátek, které rozeznávají fosforylovanou a nefosforylovanou formu určitého proteinu a které jsou přímo konjugované s fluorochromem, umožňuje spolu s průtokovou cytometrií detekci aktivačních stavů proteinů na úrovni jednotlivých buněk a v různých (i velmi malých) buněčných subpopulacích.

3 Výhody Krutzik et al. Clinical Immunology 110 (2004)

4 Jak? Technika detekce fosforylovaných proteinů má několik důležitých proměnných: 1. stimulace (podmínky, za kterých jsou buňky kultivovány) 2. fixace buněk 3. permeabilizace buněk 4. použité protilátky (klon, poměr Ab-fluorochrom, fosfo-specifita) Krutzik et al. Clinical Immunology 110 (2004)

efektivně zmrazit fosforylační stav proteinu nepoškodit epitopy, zachovat optické vlastnosti 1,5-4% paraformaldehyd (PFA),

5 Krutzik et al. Cytometry A (2003) STIMULACE indukovat fosforylaci sledovaných proteinů PMA/ionomycin, cytokin, ligand, FIXACE rychle, efektivně zmrazit fosforylační stav proteinu nepoškodit epitopy, zachovat optické vlastnosti 1,5-4% paraformaldehyd (PFA), 10min, RT PERMEBILIZACE přístup protilátky k fosfo-epitopu zachovat povrchové epitopy zachovat optické vlastnosti stabilita fosfo-epitopů při delším skladování vzorků v -20 C 50-90%, methanol, 4 C, 10min 5 týdnů v -20 C Kiernan Microscopy Today (2000)

6 ZACHOVÁNÍ POVRCHOVÝCH EPITOPŮ 1,5% PFA, 90% MetOH 4% PFA, 50% metoh PLNÁ KREV A whole blood fixation and permeabllization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of phospho-epitope expression in leukocyte subpopulations : Chow et al., Cytometry 67A:4-17 (2005) do 24h heparin, léky, inhibitory fixace: 4% PFA..10min, RT lyzace erythrocytů: 0,1% Triton X min, RT permeabilizace: 50% MetOH minim. 5min, 4 C

VALIDACE PROTILÁTEK nízkomolekulární inhibitory fosforylace signálních molekul Merck Calbiochem Inhibitor SourceBook (http://www.

7 VÝBĚR PROTILÁTEK (Ab) titrace Ab (stimulované vs. nestimulované buňky) výběr fluorochromu (Alexa 488, Alexa 647, ) poměr Ab-fluorochrom doba značení (30min, 4 C, v PBS + 1% BSA) VALIDACE PROTILÁTEK nízkomolekulární inhibitory fosforylace signálních molekul Merck Calbiochem Inhibitor SourceBook ( Sigma-Aldrich ( + Na 3 VO 4 ortovanadát sodný PMA - sf serum free medium UO126

8 Zpracování výsledků Single Cell Profiling of Potentiated Phospho-Protein Networks in Cancer Cells, Irish et al. Cell, Vol. 118, , July 23, 2004

9 Klinické aplikace Charakterizace buněk imunitního systému Vývoj imunitního systému: sledování fosfo-změn v průběhu vývoje T a B-lymfocytů a jiných buněčných populací (korelace intracelulárních dějů se stupněm buněčné diferenciace) Biochemický profil řídce zastoupených buněk (DC, naivní a paměťové efektorové buňky, kmenové buňky) Odpověď buněk imunitního syystému na cytokiny a jiné extracelulární stimuly Propojení mezi různými signalizačními kaskádami Onemocnění-specifická buněčná signalizace př: leukemie, autoimunitní onemocnění (př. revmatoidní artritida) : korelace fosfo-statutu s klinickými projevy nemoci antigen-specifická T buněčná odpověď při virové nebo bacteriální infekci (sledování odpovědi lymfocytárních subpopuplací při akutní a chronické infekci, korelace značení tetramery s intracelulární signalizací) sledování změněné intracelulární signalizace virově infikovaných buněk Sledování odpovědi buněk na chemoterapii, farmakodynamický profil léčiv Screening intracelulární fosforylace pro rychlou identifikaci specifických inhibitorů a modulátorů kináz Screening odpovědi primárních buněk na léčiva, sledování účinnosti a vedlejších efektů Identifikace fosfo-epitopů kináz jako diagnostických indikátorů progrese onemocnění Analýza fosfo-epitopů během vakcinačních protokolů : sledování účinnosti na buněčné úrovni

10 Závěr Single-Cell Phospho-Flow Cytometry, tedy cytometrická detekce fosforylovaných forem intracelulárních signalizačních proteinů je unikátní metodou nově vyvinutou ke studiu biologického chování buněk. Výhodou této metodiky je současné multiparametrové značení povrchových a intracelulárních antigenů, které umožňuje rychle identifikovat přesný signalizační profil v definované (i velmi malé) buněčné subpopulaci a detekovat stimul-specifický, buněčně-specifický nebo onemocnění-specifický fenotypový profil. Inkorporace povrchových antigenů do značících protokolů umožňuje analyzovat různé buněčné subpopulace v jednom vzorku, což výrazně redukuje čas a meziexperimentální variabilitu. Musíme však mít na vědomí několik důležitých ohledů, zejména dostupnost protilátek pro daný fosfo-epitop, vhodnost klonů protilátek pro průtokovou cytometrii a rychlou a reverzibilní povahu signalizačních jevů v buňce.

11 Doporučené články a www. adresy Intracellular Phospho-protein Staining Techniques for Flow Cytometry: Monitoring Single Cell Signaling Events : Krutzik and Nolan, Cytometry Part A 55A:61-70 (2003) Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications : Krutzik et al., Clinical Immunology 110: (2004) Flow Cytometric Analysis of Kinase Signaling Cascades : Perez et al., Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols (2004) Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: from mechanism to translational medicine at the single-cell level : Perez and Nolan, Immunological Reviews 210: (2006) A whole blood fixation and permeabllization protocol with red blood cell lysis for flow cytometry of phosphor-epitope expression in leukocyte subpopulations : Chow et al., Cytometry 67A:4-17 (2005) Pharmacodynamic Monitoring of Molecular-Targeted Agents in the Peripheral Blood of Leukemic Patients using Flow Cytometry : Hedley et al., J Toxicol Pathol. 36: (2008) Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling : Krutzik and Nolan, Nature Meth. 3: (2006) High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry : Krutzik et al. Nature Chem Biol. 4: (2008) Nolan lab Cell Signaling Technology BD Phosflow BC Sigma-Aldrich Merck Calbiochem Inhibitor SourceBook nebo

Podobné dokumenty

Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice

Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice Mgr. Marcela Vlková, Ph.D. Ústav klinické imunologie a alergologie, FN u sv. Anny v Brně Průtoková cytometrie v klinické laboratoři Relativní a absolutní