Hodnocení morfologie a imunofenotypizace leukocytů jako reflexní testy automatizovaného krevního obrazu: koncept, možnosti a kazuistiky

Transkript

1 Hodnocení morfologie a imunofenotypizace leukocytů jako reflexní testy automatizovaného krevního obrazu: koncept, možnosti a kazuistiky Kateřina Pilátová, Lenka Zdražilová Dubská Oddělení laboratorní medicíny Masarykův onkologický ústav

2 Úvod Mikroskopie nátěru na sklo Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost buněčných inkluzí, struktura jádra aj.) Přítomnost parazitů, artefaktů aj. Automatický KO + diff. Subpopulace lymfocytů (T- a B- lymfocyty, NK buňky ) Imunofenotyp patologických lymfocytů Přítomnost CD34+ buněk

3 Automatický analyzátor KO + diff. Leukocyty Mono B-ly IDENTIFIKACE 6ti populační dif. rozpočet leukocytů Morfologie buňky SFL (fluorescence) obsah DNA/RNA Velikost buňky (přímý rozptyl) T-ly Laserový paprsek Sysmex XE-5000 RELATIVNÍ/ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE Morfologie buňky FSC (boční rozptyl) vnitřní struktura / granularita buňky

4 Automatický analyzátor KO + diff. Erytrocyty Trombocyty Sysmex XE-5000 IDENTIFIKACE Erytrocyty a trombocyty impedanční metoda (opticky) Hemoglobin absorpční spektrometrie NRBC, retikulocyty: speciální kanály, ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE

5 Digitální mikroskopie Leukocyty Velikost buňky Mikroskopie software (neuronová síť), oko IDENTIFIKACE včetně nezralých forem a patologií Morfologie buňky Mikroskopie software (neuronová síť), oko, speciální barvení vlastnosti cytoplazmy (granulace, cytoplazmatické inkluze) vlastnosti jádra (velikost, přítomnost jadérek, struktura chromatinu, segmentace jader) Přítomnost parazitů, artefaktů aj. Mikroskopie oko CellaVision DM1200 RELATIVNÍ KVANTIFIKACE

6 Digitální mikroskopie Erytrocyty Trombocyty Velikost Mikroskopie software (neuronová síť), oko Ery: mikrocytóza, makrocytóza, anizocytóza Trombo: makrotrombocyty, mikrotrombocyty, anizocytóza CellaVision DM1200 IDENTIFIKACE Morfologie Mikroskopie software (neuronová sít), oko, speciální barvení Ery: např. abnormální tvar, chromie, inkluze, penízkovatění aj. Trombo: hypochromie trombocytů, shlukování trombocytů NRBC Retikulocyty ORIENTAČNĚ KVANTIFIKACE trombocyty, schistocyty

7 Leukocyty Anti-CD14 Anti-CD19 IDENTIFIKACE včetně subpopulací lymfocytů, identifikace lymfomových buněk, CD34+ buněk aj... Imunofenotyp Fluorescence Velikost buňky (přímý rozptyl) Mono T-ly B-ly Anti-CD3 Laserový paprsek Navios, Beckman Coulter RELATIVNÍ KVANTIFIKACE ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE Fluorescenční kuličky (např. cirkulující endoteliální buňky, CD34+ buňky) Morfologie buňky FSC (boční rozptyl) vnitřní struktura / granularita buňky

8 Erytrocyty Trombocyty Pouze speciální aplikace: Ery: paroxysmální noční hemoglobinurie, fetomaternální hemoragie aj. Navios, Beckman Coulter Trombo: diagnostika vrozených poruch funkce destiček, imunitních a megakaryocytárních trombocytopenií, polymorfie systému lidských trombocytárnich antigenů (HPA) ve vztahu k aloimunizaci aj.

9 Úvod Mikroskopie nátěru na sklo Morfologie (např. tvar erytrocytů, přítomnost buněčných inkluzí, struktura jádra aj.) Přítomnost parazitů, artefaktů aj. Automatický KO + diff. Subpopulace lymfocytů (T- a B- lymfocyty, NK buňky ) Imunofenotyp patologických lymfocytů Přítomnost CD34+ buněk

10 Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK Kvantitativní Onkologické diagnózy C Neonkologické diagnózy Z Parametr Hodnota menší než Hodnota větší než Jednotka Parametr Hodnota menší než Hodnota větší než Jednotka Leukocyty 1,0 30,0* 10 9 /l Hemoglobin 60** ženy: 180 muži: 195 g/l Trombocyty /l Neutrofily - 20,0* 10 9 /l Eozinofily - 4, /l Monocyty - 3, /l Lymfocyty - 4, /l Nezralé granulocyty - 0,3* 10 9 /l NRBC počet - 0,1*** 10 9 /l * Nejsou-li podávány růstové faktory granulocytů. ** Je-li anémie doprovázena trombocytopenií (trombocyty 100x10 9 /l). *** Nejsou-li podávány růstové faktory erytropoézy (erytropoetin). Leukocyty 4,0 30, /l Hemoglobin 70* ženy: 180 muži: 195 g/l Trombocyty 100* /l MCV fl RDW - 22 % Neutrofily 1,0 20, /l Eozinofily - 2, /l Bazofily - 0, /l Monocyty - 1, /l Lymfocyty - 4, /l Nezralé granulocyty 0, /l NRBC počet - 0, /l Retikulocyty počet - 0, /l * Flowcytometrické vyšetření se provádí pouze, je-li současně anémie a trombocytopenie.

11 Kritéria pro nátěr a flowcytometrické vyšetření PK Kvalitativní Flag WBC Akce Flag RBC Akce Flag PLT Akce Abn Lympho / L_Blasts? Atypical Lympho? Blasts? Immature Gran? Left Shift? RBC Lyse Resistance? Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr Z Flow Z Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr C + Z Flow C + Z Nátěr Z Flow Z Nátěr C + Z Flow C + Z Fragments? HGB Defect? Iron Deficiency? RBC Agglutination? Dimorphic Population RBC Abn Distribution Nátěr C + Z Nátěr C + Z Nátěr C + Z Nátěr C + Z Nátěr Z Nátěr Z PLT Clumps? PLT Abn Distrib. PLT Abn Scattergram Nátěr C + Z Nátěr Z Nátěr Z NRBC Abn Scattergram Nátěr C + Z RET Abn Scattergram Nátěr Z WBC Abn Scattergram Nátěr C + Z

12 Kazuistika 1 Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP patologický KO + diff. Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie CD45-KrO lymfo 79 % HLA-Dr-PC5 B-lymfo 74 % CD19-FITC lambda 1 % CD5-APC750 CD20-PC7 lambda-pe kappa 98 % CD19-PC5 kappa-fitc CD79b-PE CD38-PB CD23-APC FMC7-FITC CD10-PC5 Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sig(kappa)+ FMC7+ CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci z nezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk

13 Kazuistika 1 Muž 79 let, C61 (ca prostaty) CT zvětšené a zmnožené uzliny v malé pánvi a RP patologický KO + diff. Imunohistochemie cyklind1 Hodnocení: abnormální B-lymfocyty s imunofenotypem CD19+ CD20+ HLA-DR+ CD45+ sig(kappa)+ FMC7+ CD79b+ CD5+ CD23- CD38+ CD10+ CD200- CD117- CD11c+/- odpovídající monoklonální B-lymfoproliferaci z nezralých buněk. Res: B lymfoproliferace z nezralých buněk. B-PLL?

14 Kazuistika zahájena léčba obinutuzumabem (anti-cd20) a leukeranem kontrola KO + diff Automatizovaný KO + diff. Lymfo 23 % B-lymfo 0,6 % CD45-KrO HLA-Dr-PC5 CD19-FITC T-lymfo 92 % CD3-APC750 CD34-PC7 Hodnocení: leukopenie, trombocytopenie, v biochemii LDH = 16,51 kat/l ( : LDH = 4,81 kat/l)

15 Kazuistika 2 Muž 19 let, zarudlý krk s bílými čepy, únava, afebrilní Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie Lymfo 65 % CD45-KrO HLA-Dr-PC5 B-lymfo 2,5 % T-lymfo 89 % CD19-FITC CD3-APC750 CD4-PB Th-lymfo 12 % CD3-APC750 CD8-APC Tc-lymfo 71 % CD3-APC750 HLA-Dr-PC5 CD4-PB SEROLOGIE Cytomegalovirus (CMV) CMV IgG negativní CMV IgM pozitivní Epstein-Baarové virus (EBV) EBV VCA IgG pozitivní EBV VCA IgM pozitivní EBV EBNA IgG negativní Hodnocení: expanze cytotox. CD8+ T-lymfocytů s reaktivním imunofenotypem. Res: infekční mononukleóza

16 Kazuistika 3 Žena 67 let, C181 (tu appendixu, dlouhodobá remise) Lymfocytóza v KO + diff. došetřeno flowcytometricky Automatizovaný KO + diff. CD45-KrO Lymfo 62 % HLA-Dr-PC5 B-lymfo 4 % T-lymfo 89 % CD19-FITC CD3-APC750 Th-lymfo 16 % Tc-lymfo 12 % CD4-PB CD8-APC CD3-APC750 CD3-APC750

17 Kazuistika 3 Žena 67 let, C181 (tu appendixu) Lymfocytóza v KO + diff. došetřeno flowcytometricky Digitální mikroskopie CD314-APC gammadelta CD % TCR gammadelta 59 % TCRdelta9-PB 99 % TCRgd-FITC TCRgamma9-PC5 Hodnocení: Atypický nález v oblasti T-lymfocytů; cca 60% lymfocytů periferní krve představují gamma delta T- lymfocyty; jež jsou z 99% TCRgamma9/delta2 CD4- CD8low+ CD56low+ CD16low+ NKG2D+ CD69- HLA-Dr-. Res: gammadelta T-lymfocyty s expresí znaků NK buněk.

18 Kazuistika 4 Žena 79 let, DM II.typu na inzulinoterapii V rámci pravidelné diabetologické kontroly zjištěna v KO leukocyotóza s lymfocytózou První hematologické vyšetření B-CLL??? Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie CD45-KrO lymfo 71 % HLA-Dr-PC5 B-lymfo 4,5 % T-lymfo 3,1 % CD19-FITC CD3-APC750 CD4-PB 88 % CD3-APC750 Hodnocení: aberantní T-lymfocyty: CD3- CD8- CD4+ CD34- CD14- CD19- CD5+ CD25- CD103- CD27+ CD45RO- CD38- CD16- CD56- dělící se dle exprese CD45 do dvou populací. Res: T-lymfoproliferace

19 Kazuistika 5 Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie CD45-KrO CD14-PE CD34-PC7 Hodnocení: leu: neutropenie, monocytopenie, hypersegmentované granulocyty; ery: makrocytóza, anizocytóza (dimorfní populace), makroovalocyty, knizocyty, stomatocyty; trombocytopenie.

20 Kazuistika 5 Žena 85 let, vyšetření pro pancytopenii PK + KD Automatizovaný KO + diff. CD45-KrO CD14-PE CD34-PC7 Hodnocení: Středně buněčný aspirát KD, hyperplastická erytrocytopoéza. Res: megaloblastová anémie.

21 Kazuistika 6 Muž 68 let, C229 (hepatocelulární karcinom) přichází na MOÚ pro susp. tu jater v rámci předoperačního vyšetření patologický KO + diff. Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie CD45-KrO Lymfo 32 % CD34+ buňky 7 % CD34-PC7 Hodnocení: flowcytomericky v periferní krvi zachyceno 7% CD34+ buněk/blastů; jedná se o buňky CD45low+ CD34+ CD14- HLA-Dr+ CD19- CD3- CD4-. Morfologicky bez aureových tyčí vzhledu negranulovaných nediferencovaných blastů. Res: hemoblastóza v PK.

22 Kazuistika 7 Žena 67 let, C502 (ca mammae) chemoterapie KO + diff., pro neutropenii podány G-CSF (filgrastim, Zarzio) Ko + diff. kontrola Automatizovaný KO + diff. Digitální mikroskopie CD45-KrO Lymfo 32 % Granulo cca 40 % Neutrofily = 20,8 % Lymfocyty = 39,4 % Monocyty = 18,1 % Eozinofily = 2,7 % Bazofily = 2,1 % Metamyelocyty = 4,8 % Myelocyty = 5,3 % Promyelocyty = 6,4 % IG = 16,5 % Mono 19 % CD14-PE

23