Molekulová absorpční spektrometrie v ultrafialové a viditelné oblasti

Transkript

1 Molekulová absorpční spektrometrie v ultrafialové a viditelné oblasti Obsah kapitoly Teorie, základní pojmy UV spektra organických sloučenin Zásady měření UV spektra biologicky významných látek Dvousložková a vícesložková analýza Derivační spektrometrie Automatizace spektrofotometrického měření FIA Teorie UVVIS spektrometrie Absorpce elektromagnetického záření změna energetického stavu molekuly změna elektronového stavu (obsazenost orbitalů): kj/mol změna vibračního stavu: 260 kj/mol změna rotačního stavu: cca 3 kj/mol vztah k vlnové délce absorbovaného záření E = E e + E v + E r = h. ν = h. c / λ h = 6, J s (Planckova konstanta) 1

2 Spektrální oblasti Označení Vzdálená ultrafialová oblast far UV (vakuová oblast) Blízká ultrafialová oblast near UV Viditelná oblast VIS λ <190 nm nm nm Absorbující látky nasycené sloučeniny monoenové sloučeniny polynenasycené a aromatické sloučeniny barevné látky Komplementarita barev λ (nm) Barva absorbovaného světla fialová modrá zelenomodrá modrozelená zelená zelenožlutá žlutooranžová červenooranžová červená Barva absorbující látky žlutozelená žlutá oranžová červenooranžová purpurová fialová modrá zelenomodrá modrozelená 2

3 Energetické změny při elektronových přechodech E σ* π* n π* π π* n σ* σ σ* n π Pravděpodobnost přechodu ovlivňuje absorpční koeficient souvislost se spinovým stavem excitovaného elektronu: 1) přechod S0 (základní singlet) S1 (vyšší singlet) je spinově dovolený ε max l.mol 1.cm 1 2) přechod S0 T1 (triplet) je spinově zakázaný ε max 10 0 l.mol 1.cm 1 σ Základní pojmy chromogen = absorbující látka chromofor = skupina (seskupení atomů v molekule), která způsobuje absorpci v UVVIS oblasti auxochrom = substituent nebo skupina atomů s volným elektronovým párem (např. Cl, OH, SH, NH 2 ); v konjugaci s πelektronovým chromoforem obvykle vyvolává posun λ max k delším vlnovým délkám bathochromní posun (červený posun) = posun λ max k delším vlnovým délkám vyvolaný chemickou modifikací molekuly nebo vlivem rozpouštědla hypsochromní posun (modrý posun) = posun λ max ke kratším vlnovým délkám hypochromní efekt = snížení ε max hyperchromní efekt = zvýšení ε max 3

4 Chromofory a odpovídající přechody Chromofor, příklad sloučeniny H 2 O C=O, H CH=O H 2 C=CH CH=O C=N N=N σ σ* 183 C=S n π* 500 NO 2 n π* N=O Přechod CC a CH, CH 4 σ σ* cca 170, 173 CX, CH 3 OH, CH 3 NH 2, CH 3 I n σ* , 187, 215, 258 C=C, H 2 C=CH 2 π π* , 162 H 2 C=CH CH=CH 2 π π* 217 n π*, π π* n π*, π π* n σ*, n π* n π* n π* 270, , 270, , , Konjugované polyeny n H (CH=CH) n H CH 3 (CH=CH) n CH , , , , ? 310 4, , ,1 4

5 αkaroten, λ max = 447 nm βkaroten, λ max = 451 nm γkaroten, λ max = 462 nm lykopen, λ max = 476 nm Benzoidní aromatické sloučeniny Sloučenina Benzen Toluen Brombenzen Fenol Benzaldehyd Acetofenon Kys. benzoová Anilin Styren Skořicový aldehyd Kys. skořicová Bifenyl ,9 3,8 3,9 3,8 4,1 4,0 4,1 3,9 4,0 4,4 4,3 4, ,0 2,4 2,3 3,2 3,0 3,0 3,0 3,5 2, ,7 1,7 5

6 Spektra kondenzovaných aromatických uhlovodíků Pětičlenné heterocykly Sloučenina Furan Furfural 2Acetylfuran Pyrrol 2Acetylpyrrol Thiofen 2Acetylthiofen Thiazol ,0 3,3 3,4 4,2 3,6 3, ,1 4,1 2,5 4,2 3,7 3,7 3,6 6

7 Šestičlenné heterocykly Sloučenina Pyridin ,3 2Pikolin 262 3,4 Pyrazin 260 3,7 Chinolin 227 4, , ,4 Isochinolin 218 4, , ,5 Pyrimidin 343 3,3 Indol 225 4, ,8 Zásady spektrometrického měření výběr kyvety křemenné pro UV oblast skleněné pro VIS b 0,15 cm optimální rozsah A 0,12 výběr rozpouštědla záznam spektra rychlost skenu horší opakovatelnost spektrální interval užší (0,20,5 nm) vysoké rozlišení, horší opakovatelnost širší (1,54 nm) malé rozlišení, lepší opakovatelnost měření absorbance vhodné pro široké absorpční pásy (VIS oblast) ředění vzorku jen pro stabilní absorbující látky 7

8 Rozpouštědla pro UV spektrometrii Rozpouštědlo Spodní mez λ (nm) Rozpouštědlo Spodní mez λ (nm) acetonitril, voda 190 chloroform 240 isooktan, cyklohexan 195 ethylacetát 260 hexan 201 dimethylformamid 270 methanol, ethanol 205 octová kys ,4dioxan 215 benzen 280 diethylether 220 toluen 285 glycerol 230 pyridin 300 dichlormethan 233 aceton 330 Vliv rozpouštědla na absorpční spektrum V různých rozpouštědlech se mírně liší: hodnoty λ max, ε tvar spektra (interakce rozpouštědloanalyt) Spektrum fenolu změřené v ethanolovém a isooktanovém roztoku 8

9 Biologicky významné látky Látka NAD, NADP NADH, NADPH FMN, FAD pyridoxal ε (l.mol 1.cm 1 ) (FMN) (FAD) (FMN) (FAD) Další biologicky významné látky Látka cholesterol kalciferoly βkaroten retinol trans,trans9,12 oktadecenová kys. adenosin guanosin cytidin thymidin uridin ε (l.mol 1.cm 1 )

10 Analýza dvou složek vedle sebe 0,8 0,6 λ 1 λ 2 A 0,4 0, (nm) Aditivita absorbance: A λ1 = b. (ε Aλ1. c A + ε Bλ1. c B ) A λ2 = b. (ε Aλ2. c A + ε Bλ2. c B ) c A = c B = A λ1 A λ2. ε Bλ1 / ε Bλ2 b. ( ε Aλ1 ε Aλ2. ε Bλ1 / ε Bλ2 ) A λ2 A λ1. ε Aλ2 / ε Aλ1 b. (ε Bλ2 ε Bλ1. ε Aλ2 / ε Aλ1 ) Derivační spektrometrie 0,12 0,10 0,08 0,06 Původní spektrum A vs. λ 0,04 (nm) 0,01 1. derivace da/dλ vs. λ 2. derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 0,01 10

11 T = Φ /Φ 0 A = log 10 T = 2,303. ln T = ε. b. c da/dλ = 2,303. (1/T). dt/dλ = b. c. dε/dλ první (i druhá) derivace absorbance je rovněž přímo úměrná koncentraci absorbující látky 0,12 0,10 0,08 0,06 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λmax = 9 nm 0,04 původní spektrum A vs. λ 436 0, první derivace da/dλ vs. λ 0,01 druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ

12 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λmax = 7,5 nm původní spektrum A vs. λ 436 0, ,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 451 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λ max = 6 nm původní spektrum A vs. λ 5 0, ,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 5 12

13 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 9 nm původní spektrum A vs. λ 436; 15, ,01 433; 2, ; 0, první derivace da/dλ vs. λ 0 0 0,01 druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 452; 5, ,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 7,5 nm původní spektrum A vs. λ 6 454; 1, ; 2, ,01 0 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 6 13

14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 6 nm původní spektrum A vs. λ 6 433; 2, ; 1, ,01 0 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 6 Průtoková analýza FIA FIA = flow injection analysis alternativa k běžnému vsádkovému provedení reakce (vzorek + činidlo v nádobě) průtokové uspořádání přípravy vzorku, reakce analytu s činidlem a měření jednotlivé operace probíhají v toku činidla nebo nosného roztoku, do něhož je injektován vzorek efektivní způsob automatizace spektrometrické analýzy (UVVIS spektrofotometrie, AAS, AES ) 14

15 Příklad použití FIA Spektrofotometrické stanovení chloridů Hg(SCN) 2 + 2Cl HgCl 2 + 2SCN Fe 3+ + SCN [Fe(SCN)] 2+ měření rhodanátového komplexu železa (λ max = 480 nm) FIA uspořádání: peristaltické čerpadlo pumpuje kontinuálně činidlo nástřik 30 µl vzorku každých 38 s kapilára stočená do spirály zajišťuje promíchání detektor: fotometr s mikrocelou (10 µl) kalibrace 575 mg/l analýza 100 vzorků za hodinu Instrumentace pro FIA zařízení pro odběr vzorků peristaltické čerpadlo (hadičky s průměrem 0,254 mm, průtok 0540 ml/min) PTFE kapiláry a spojky nízkotlaký injektor (smayčka 5500 µl) pomocná zařízení mikrokolony, filtry, ventily, termostat detektor 15

16 Některá uspořádání analyzátorů na principu FIA dávkování do toku diluentu (využití v AAS, ICP pro analýzu koncentrovaných vzorků) dávkování vzorku do toku činidla, detekce dávkování vzorku do toku diluentu, spojení s tokem činidla, detekce příklad: generování hydridů As, Se, Sb, Te, Sn v AAS, ICP dávkování do toku diluentu, spojení postupně s toky dvou činidel technika stopped flow stanovení SCN : tvorba barevného produktu analytu s činidlem 5BrPADAP (2(5bromo2pyridylazo)5 diethylaminofenol) za přít. ox. činidla (K 2 Cr 2 O 7 ) Další možnosti využití FIA prekoncentrace analytu (sorpce a eluce, koprecipitace a rozpouštění, převedení na těkavou sloučeninu ) detekce nestabilních reakčních produktů přesným časováním měření 16