6. Metody molekulové spektroskopie spektrofotometrie, luminiscenční metody

Transkript

1 Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti 6. Metody molekulové spektroskopie spektrofotometrie, luminiscenční metody Pavel Matějka

2 6. Metody molekulové spektroskopie spektrofotometrie, luminiscenční metody 7. Identifikaci aktivních složek a pomocných látek použití knihoven a databází spekter 8. Detekce a identifikaci aktivních složek a pomocných látek infračervená spektrometrie 9. Detekce a identifikaci aktivních složek a pomocných látek Ramanova spektrometrie 10.Spektrální metody pro identifikaci a kvantifikaci NIR spektrometrie 11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv 12.NMR spektrometrie při analýze roztoků 13.Kvantitativní NMR spektrometrie 14.Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci farmaceutických látek

3 Jablonskiho diagram

4 Absorpční fotometrie - rychlost změny stavu - nejrychlejší pro elektronové přechody během elektronového přechodu se nezmění geometrie molekuly Frank- Condonův princip

5 Absorpční fotometrie - základní obecné schéma instrumentace Τ 0

6 Absorpční fotometrie - jednopaprsková instrumentace

7 Absorpční fotometrie - dvoupaprsková instrumentace v prostoru

8 Absorpční fotometrie - mnohakanálová detekce

9 Absorpční fotometrie - základní veličiny PROPUSTNOST Τ Φ Φ 0 ABSORBANCE A logτ MOLÁRNÍ ABSORPČNÍ KOEFICIENT A b c

10 Absorpční fotometrie SPEKTRA - závislost Τ, A nebo ε na - vlnové délce λ - vlnočtu - frekvenci energii fotonů Absorbance Wavelength (nm) 350 MOLEKULOVÁ SPEKTRA - pásy - oddělené překrývající se

11 UV-vis spektrometrie - 6 TYPŮ přechodů 1) σ - σ* - nejvyšší energie přechodu 2) n - σ* 3) π - π* 4) n - π* 5) přenos náboje (CT charge-transfer) (MLCT) 6) přechody v ligandovém poli (LF) (d - d) - nejnižší energie přechodu

12 UV-vis spektrometrie 1) σ - σ* PŘECHODY - orbitaly od jednoduchých vazeb - absorpce ve vzdálené UV oblasti pod 180 nm ( vakuové UV ) LÁTKY vykazující pouze σ - σ* PŘECHODY - - VHODNÁ ROZPOUŠTĚDLA pro běžnou UV-vis spektrometrii příklad - nasycené alifatické uhlovodíky

13 UV-vis spektrometrie 2) n - σ* PŘECHODY - orbitaly s nevazebnými elektrony - heteroatomy (substituenty) nesoucí elektronový pár - O, Cl - absorpce pod 200 nm - VHODNÁ ROZPOUŠTĚDLA pro běžnou UV-vis spektrometrii CH 3 Cl (λ max = 173 nm) CH 3 OH (λ max = 184 nm)

14 UV-vis spektrometrie 4) n - π* PŘECHODY - dvojné vazby a atomy nesoucí elektronový pár -C=O, -C=S, -C=N- - mnohdy možný jak π - π*, tak n - π* přechod - energie přechodu n - π* nižší vůči energii přechodu π - π* v téže molekule na téže funkční skupině - energie přechodu n - π* silně ovlivněna typem atomu nesoucím elektronový pár

15 UV-vis spektrometrie CHROMOFORY - skupiny odpovědné za absorpci záření AUXOCHROMY - skupiny způsobující posun absorpčních maxim - skupiny způsobující zvýšení intenzity pásů - -OH, -NH 2, halogeny - vliv na změnu dipolového momentu při přechodu

16 UV-vis spektrometrie 5) přenos náboje (CT charge-transfer) přenos elektronu z jedné části molekuly na druhou - donor a akceptor elektronu např. MLCT - metal to ligand charge transfer LMCT - ligand to metal charge transfer Fe 2+ a o-fenanthrolin benzen a jod toluen a chloroform

17 UV-vis spektrometrie 6) přechody v ligandovém poli (LF) (d - d) - nejnižší energie přechodu - přechody ve viditelné až blízké infračervené oblasti - sejmutí degenerace d-orbitalů vlivem ligandového pole - geometrická struktura komplexů - oktaedrické pole - např. 6 jednodonorových ligandů - tetraedrické pole - např. 4 jednodonorové ligandy

18 Kvantitativní spektrometrie - specifické aspekty jednotlivých metod MOLEKULOVÁ absorpční/reflexní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - pásové spektrum - malý počet širokých pásů - většinou v absorpčním módu ANALÝZA ANORGANICKÝCH SOLÍ - UV oblast ANALÝZA ORGANICKÝCH LÁTEK ANALÝZA KOORDINAČNÍCH SLOUČENIN ANALÝZA PRODUKTŮ ENZYMATICKÝCH REAKCÍ

19 Fluorescence a fosforescence

20 Fluorescence a fosforescence FLUORESCENCE luminiscence s krátkým dosvitem spinově dovolený přechod - bez změny orientace elektronového spinu

21 Fluorescence a fosforescence FOSFORESCENCE luminiscence s dlouhým dosvitem spinově zakázaný přechod - změna orientace elektronového spinu možný díky spin-orbitální interakci

22 Fluorescence a fosforescence DOBA ŽIVOTA EXCITOVANÉHO STAVU kinetika zániku excitovaného stavu INTENZITA fluorescence a fosforescence KVANTOVÝ VÝTĚŽEK N / N F ABS počet vyzářených fotonů vůči počtu absorbovaných - VLIV NEZÁŘIVÝCH PROCESŮ - intra- a intermolekulárních

23 Fluorescence a fosforescence STRUKTURA MOLEKULY dvojné vazby - aromáty, konjugované C=C heteroatomy - C=O, dusíkaté heterocykly VLIV SUBSTITUENTŮ - -OH, -NO, -NO 2 RIGIDITA struktury π-elektronového systému CHELÁTY MEZIMOLEKULOVÉ INTERAKCE především zhášení luminiscence vliv ph, teploty, viskozity, polarita rozpouštědla

24 Fluorescence a fosforescence MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER spektrofluorimetr

25 MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence FLUORESCENČNÍ ZÁŘENÍ EXCITUJÍCÍ PAPRSEK

26 Fluorescence a fosforescence MĚŘENÍ STACIONÁRNÍCH SPEKTER spektrofluorimetr zdroj záření - xenonová výbojka - rtuťová výbojka křemenné kyvety mřížkové monochromátory detektor - fotonásobič excitační a emisní spektra excitační - změna vlnové délky excitujícího záření konstantní λ emisního toku emisní - fixovaná λ excitujícího záření proměnná λ emisního toku

27 MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIS a UV oblast - fluorescence a fosforescence x Wavelength (nm)

28 Fluorescence a fosforescence STACIONÁRNÍ SPEKTRA knihovny spekter charakteristická spektra polyaromatických uhlovodíků charakteristická spektra fluorescenčních indikátorů ČASOVĚ ROZLIŠENÁ SPEKTRA měření doby života excitovaných stavů snazší u fosforescence obtížnější u fluorescence - studium přenosu energie - studium dynamiky molekul v roztocích - využívání fluorescenčních sond

29 Fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra - pásové spektrum - malý počet širokých pásů - kvantový výtěžek fluorescence - samoabsorpce - zhášení rozpouštědlem či zhášedly - quenching STANOVENÍ NÍZKÝCH OBSAHŮ PŘEDEVŠÍM ORGANICKÝCH LÁTEK F k ε bc

30 Fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra PŘÍMÉ METODY - stanovení PAH - stanovení hemoproteinů - stanovení vitamínů - stanovení steroidů - stanovení chininu

31 Fluorescence a fosforescence MOLEKULOVÁ emisní spektrometrie - VIDITELNÁ a UV oblast - fluorescence a fosforescence - stacionární spektra NEPŘÍMÉ METODY - tvorba chelátů - např. s morinem - stanovení hliníku - stanovení aniontů na principu zhášení fluorescence - stanovení na základě reakce provázené vznikem fluoreskujícího produktu

32 Pharmaceutical studies Synchronous Fluorescence Spectroscopy (SFS) Narrow peak width Easier identification in mixtures Excitation Emission Matrix (EEM) Spectroscopy Three dimensional spectral landscape plots Analyzed via multivariate data tools such as parallel factor analysis (PARAFAC)

33 SFS Data

34 SFS Data comparison of usual spectra and SFS data (fixed Δλ)

35 SFS Data

36 EEM Data

37

38 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

39

40

41

42 Optická konfokální mikrospektroskopie Fluorescenční obrazy při různých excitačních a emisních vlnových délkách Využití vlastní fluorescence / fotoluminiscence materiálu či využití fluorescenčních sond DAPI interkaluje do struktury DNA a RNA (modře) GFP zelený fluorescenční protein FITC fluorescein isothiokyanát (oblíbený fluorofor, snadno kovalentně modifikující např. protilátky) Fluorescein vyzařuje zelené světlo, když je osvícen modrým Cy3, Cy5 a Alexa 568 fluorofory vyvinuté specielně pro fluorescenční mikroskopii, vysoce fotostabilní a s vysokou účinností fluorescence

43