Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie živočichů a imunologie.

Transkript

1 Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie živočichů a imunologie Protilátky krevního systému AB0 Bakalářská práce Brno 2006 Jana Kamarýtová

2 OBSAH 1. Úvod AB0 systém Historie Krevní skupiny AB0 systému Skupina A a její podskupiny Skupina B a její podskupiny Skupina Skupina AB Substance A, B a H na trombocytech Distribuce krevních skupin Tvorba protilátek Reakce antigen-protilátka Interakce Ag/Ab in vivo Interakce Ag/Ab in vitro Průkaz reakce Ag/Ab Dědičnost AB0 systému Složky AB0 systému Erytrocyty Antigeny Struktura molekuly antigenu AB0 systému Protilátky Charakteristika protilátek Struktura protilátek Anti-A a anti-b Anti-A,B Anti-H Monoklonální protilátky AB0 systému Charakteristika monoklonálních a polyklonálních protilátek Výhody monoklonálních protilátek Příprava monoklonálních protilátek Humanizované monoklonální protilátky Monoklonální protilátky systému AB

3 4.6. Využití monoklonálních protilátek Poruchy a choroby závislé na AB0 systému Krevní transfuse Hemolytické onemocnění novorozenců (HON) Rejekce transplantátu Závěr. 40 Tabulka distribuce krevních skupin na světě. 41 Použitá literatura 43 Seznam zkratek.. 44 Seznam obrázků a tabulek. 45

4 Prohlašuji, že jsem tuto písemnou rešerši vypracovala sama na základě uvedené použité literatury. Zároveň bych chtěla poděkovat za spolupráci a ochotu Mgr. Janě Benešové a Mgr. Monice Duškové, Dr.

5 1.ÚVOD Krevní systém AB0 jako prvně objevený krevní systém člověka patří v současnosti stále k nejdůležitějším především při transfusích a transplantacích. AB0 systém je základní imunohematologickou charakteristikou člověka, jeho specifita je určena antigeny na erytrocytech a protilátkami v séru. Tyto protilátky mají své specifické charakteristiky a vlastnosti, které se budu snažit v této rešerši objasnit spolu s charakteristikou antigenů, erytrocytů a jednotlivých krevních skupin AB0 systému. A protože se v současné době v lékařské praxi a vědeckém výzkumu používají především tzv. monoklonální protilátky, bude část práce věnována právě jim. Původní předpoklad, že protilátky systému AB0 jsou vrozené, tedy tělu vlastní, je v současné době již překonán. Struktury podobné antigenům AB0 se vyskytují v celé přírodě ať už na površích bakterií, u různých živočichů či rostlin. Nastává tedy otázka proč mají někteří jedinci v krvi protilátky anti-a a druzí protilátky anti-b? Proč vzniklo toto rozdělení a důmyslné mechanismy proti cizí krvi s ním spojené, když možnost kontaktu s cizí krví připadá v úvahu víceméně jen při umělém převodu krve, tedy při transfusích? Na tyto otázky zatím neexistují jednoznačné odpovědi, ale studium a pochopení těchto mechanismů může výrazně přispět k objasnění problému. Díky studiu antigenů a protilátek byly umožněny úspěšné krevní transfuse, které dříve, díky inkompatibilitě krve, končívaly smrtí, dále transplantace orgánů a v některých případech i úspěšnost donošení dítěte matkou. Proto část této práce budu věnovat právě této problematice

6 2. AB0 SYSTÉM 2.1 HISTORIE ABO SYSTÉMU Prvním objeveným krevně skupinovým systémem u člověka byl systém ABO. Nezávisle na sobě jej objevili Landsteiner (1901), Janský (1907) a Moss (1910) (Malaska, 1957). Landsteiner svůj objev zveřejnil v práci Agglutinationsercheinungen normaler menschlicher Blute zde popsal podle aglutinačních vlastností určené tři krevní skupiny A, B a C. Rozdělení dosáhl na základě mísení krvinek a séra vyšetřovaných osob. U skupiny A sérum aglutinovalo, tj. shlukovalo krvinky skupiny B, naopak u skupiny B sérum aglutinovalo krvinky skupiny A. Vlastní krvinky se sérem neaglutinovaly. U skupiny C nedošlo k aglutinaci vůbec. V roce 1902 Descatello a Sturli prokázali čtvrtou skupinu, ve které byly krvinky aglutinovány séry všech ostatních skupin. Tato skupina byla nazvána AB. To, že Landsteiner neurčil čtvrtou základní krevní skupinu, bylo zřejmě způsobeno tím, že žádná z jeho vyšetřovaných osob neměla tuto krevní skupinu (Daniels, 2002). Kompletně stanovili čtyři základní krevní skupiny podle aglutinačních vlastností Janský (1907) a Moss (1910). Tyto skupiny označili římskými číslicemi I, II, III a IV. Moss je označil v opačném pořadí než Janský. Dr. Janský označil jako skupinu I tu krev, kde se krvinky neaglutinovaly žádným sérem a její sérum aglutinovalo krvinky všech ostatních skupin. Krvinky skupiny IV se naopak aglutinovaly všemi séry, ale jejich sérum neaglutinovalo jiné krvinky. Sérum, které označil skupinou II, aglutinovalo krvinky skupin III a IV. Sérum skupiny III aglutinovalo krvinky skupin II a IV (Malaska, 1957). Moss se lišil v označení tak, že zaměnil skupinu I a skupinu IV. Toto různé označení bylo po řadu let příčinou mnoha nesrovnalostí, a proto v roce 1921 výbor amerických vědeckých společností doporučil na základě priority objevu označení Janského. Ve 30. letech 20. století se krevní skupiny začaly označovat písmeny A, B, AB a 0 (která nahradila C) podle Landsteinera, tj. tzv. mezinárodní klasifikací (Malaska, 1957)

7 Tabulka 1 : Vzájemný vztah mezi označením Janského, Mosse a mezinárodní klasifikací. (podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Mezinárodní Erytrocyt Sérum Janský Moss klasifikace - aglutinogen - aglutinin 0 I IV - anti-a, anti-b A II II A anti-b B III III B anti-a AB IV I A,B - V roce 1911 von Dungern a Hirschfeld potvrdili, že krevní skupiny jsou děděny, jak už ukázali Ottenberg s Epsteinem, a že pro ně platí Mendlovy zákony dědičnosti. V roce 1924 Bernstein zveřejnil svoji teorii tří alel, tzn. že pouze tři alely na jednom lokusu jsou nezbytné pro vyjádření AB0 dědičnosti. Thomsen a kol. později rozšířili tuto teorii o čtvrtou alelu, neboť zjistili, že někteří lidé skupiny A produkují protilátku (aglutinin), který aglutinuje krvinky skupiny A jiných lidí. Skupina A tak byla rozdělena na dvě podskupiny A 1 a A 2. Čtyři alely, které určují základní krevní systém AB0, jsou tedy A 1, A 2, B a 0. Dnes už jsou identifikovány další podskupiny v rámci skupin A a B (Daniels, 2002). K intenzivnímu studiu chemické struktury a biosyntézy AB0 systému došlo začátkem 50. let 20.století. Studie se prováděly hlavně na sekrečních glykoproteinech, neboť isolace aktivních antigenů z erytrocytárních membrán byl značně obtížný. Zejména studie (Morgan, 1960, Watkinsová, 1980, Kabat, 1956) prováděné se skupinovými substancemi izolovanými z tekutého obsahu lidských ovariálních cyst a z koňské a vepřové žaludeční sliznice, jasně formulovaly vztah mezi sekvencí cukrů v oligosacharidovém řetězci glykoproteinu a odpovídající skupinovou specifitou. Na základě těchto prací vyplynuly i dva důležité závěry a to, že mezi antigeny krevní skupiny H a A nebo B platí souvislost charakteru prekurzorkonečný produkt, a že primárním genovým produktem skupinového systému AB0 a Lewis jsou glykosyltransferasy, podílející se na biosyntéze skupinově specifického oligosacharidového řetězce. Enzymatický základ syntézy skupinových antigenů byl později potvrzen (Vaňák,1988). Koncem 50. a začátkem 60. let 20. století byla využita tenkovrstvá chromatografie k purifikaci glykolipidových komponent erytrocytárních membrán se skupinovou specifitou a tím objasňovány jejich chemické vlastnosti a struktura

8 Další zpřesnění analýzy antigenů přinesly metody jako mikrometylace s hmotovou spektrometrií či aplikace exo- a endoglykosidas specificky štěpících sacharidové řetězce. Od konce 80. let 20. století se používají monoklonální protilátky, které postupně nahradily používané polyklonální protilátky. Tyto protilátky se získávají hybridomovou technologií publikovanou v roce 1975 Köhlerem a Milsteinem (Vaňák, 1988). V posledních letech se uplatňují v různých odvětvích vědy, diagnostiky a léčby, téměř vytlačily polyklonální (přirozené) protilátky

9 2.2. KREVNÍ SKUPINY AB0 SYSTÉMU Jednotlivé krevní skupiny AB0 systému jsou charakterizovány přítomností antigenů na erytrocytech a tvorbou protilátek. Jejich antigenní vlastnosti se projevují již u plodu 37 dní starého, na jehož erytrocytech jsou už prokazatelné antigeny (aglutinogeny) A a B. K tvorbě vlastních protilátek (aglutininů) dochází až po narození. Specifita AB0 systému tedy spočívá na antigenech, které jsou přítomny na erytrocytech, a na protilátkách, které jsou přítomné v séru. Pokud smícháme dvě kapky krve, každou od jiného dárce s jinou krevní skupinou, dojde k tomu, že protilátky jedné skupiny budou shlukovat (aglutinovat) erytrocyty druhé skupiny na základě jejich antigenů. Každý krevní systém potřebuje ke svému určení specifická diagnostická séra. Jde o séra lidská (přirozená, nebo připravená imunizací jedince) nebo zvířecí séra. Využití diagnostických sér je jednoduchým postupem určování krevních skupin. Séra k určování AB0 systému se nazývají sanguitesty. Podstata reakce spočívá v tom, že na erytrocytech vázaný antigen je schopen tyto erytrocyty aglutinovat protilátkou krevního séra jiné krevní skupiny než je antigen. Na základě aglutinací vyšetřované krve pak zjistíme její krevně skupinovou charakteristiku (obr. 1) (Malaska, 1957). Obrázek 1 : Určování AB0 skupin pomocí diagnostických sér. (podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Diagnostická séra 0 A B AB Krevní skupina A B AB 0 vysvětlivky : proběhla aglutinace neproběhla aglutinace Sekretorství. Substance A, B a H nacházíme nejen vázané v membránách erytrocytů, nýbrž i volně v různých sekretech (jako jsou sliny) a v jiných tělních tekutinách (seminární tekutina).. Tyto substance mají povahu glykoproteinů a jsou v solubilní formě. Substance A, - 9 -

10 B a H se v sekretech nacházejí pouze u některých lidí, tzv. sekretorů ti tvoří asi 80% populace. Sekrece krevně skupinových substancí A, B a H je řízena genovým systémem Sese. Sekretoři mají genotyp SeSe nebo Sese, nonsekretoři pak sese (Strejček a Lokaj, 1985) Skupina A a její podskupiny Krevní skupina A je nejvíce zastoupenou krevní skupinou u evropské populace. Na jejich erytrocytech se nachází antigen A. Erytrocyty této skupiny jsou aglutinovány protilátkami anti-a, vyskytující se u skupin B a 0. A antigeny jsou cukerné determinanty glykoproteinů. Terminálním imunodominantním monosacharidem glykoproteinu antigenu A je N-acetylgalaktosamin. Sérum této skupiny obsahuje protilátky anti-b (Daniels, 2002). Bylo zjištěno, že někteří jedinci skupiny A produkují protilátky, které aglutinují erytrocyty jiných jedinců skupiny A. Vznikly tak dvě základní podskupiny, a to A 1 a A 2. Podskupina A 1 obsahuje vedle antigenu A ještě jeden antigen A 1 (viz tabulka 2) (Daniels, 2002). Tabulka 2 : Podskupiny A 1 a A 2. (podle Human Blood Groups, Daniels, 2002) Co se týká genotypu těchto podskupin, alela A 1 heterozygot A 1 /A 2 dá vznik podskupině A 1. je dominantní nad alelou A 2, takže Do současné doby bylo objeveno velké množství dalších podskupin. Jmenujme např.a 3, která aglutinuje s anti-a 1, či A x, A end a A m, které většinou neaglutinují s anti-a (Daniels, 2002). anti-a (sérum skupiny B) Podskupina Antigeny anti-a anti- A 1 A 1 A, A A 2 A

11 Skupina B a její podskupiny Antigeny skupiny B aglutinují své erytrocyty aglutininy anti-b, vyskytující se u skupin A a 0. Cukernou determinantou antigenu B je na rozdíl od antigenu A galaktosa. Sérum této skupiny obsahuje protilátky anti-a. I u skupiny B existují podskupiny. Jejich výskyt je však na rozdíl od skupiny A vzácnější, a proto se i hůře klasifikují. Můžeme uvést např. B 3, B x, B m nebo B el. B podskupiny byly také definovány podle aglutinace s anti-b na B 60, B 20 a B 0, kde indexy odpovídají procentům aglutinace (Daniels, 2002) Skupina 0 Krevní skupina 0 je považována za původní krevní skupinu, z níž se v průběhu evoluce vyvinuly zbývající skupiny. Je charakteristická tím, že obsahuje ve svém séru jak protilátky anti-a, tak i anti-b. Tyto protilátky se vyznačují křížovou reaktivitou, a někdy se proto souhrnně označují jako anti-a,b.erytrocyty této skupiny obsahují antigen H, který je prekurzorem pro antigen A a B (Daniels, 2002) Skupina AB Krevní skupina AB je na rozdíl od skupiny 0 považována za nejmladší krevní skupinu, důkazem toho je její nejnižší zastoupení ve světové populaci. V séru nejsou obsaženy žádné protilátky, zato na erytrocytech nacházíme dva typy antigenů antigen A a antigen B. Díky těmto antigenům vznikají u skupiny AB podskupiny, mezi nejdůležitější patří A 1 B a A 2 B (Daniels, 2002) Substance A, B a H na trombocytech Substance A, B a H se také vyskytují na trombocytech (krevních destičkách). Myslelo se, že exprese AB0 antigenů na erytrocytech a trombocytech je stejná, ale Coolingová a jeho

12 kolegové zjistili, že to není pravda. Hustota antigenu A u skupiny A 2 je na erytrocytech nižší než skupiny A 1. Trombocyty skupiny A 2 dokonce tento antigen postrádají nebo je ho zde jen nepatrné množství. Trombocyty skupiny A 2 totiž postrádají prekursorový antigen H. Z toho vyplývá, že exprese AB0 antigenů na trombocytech je primárně determinována aktivitou H-glykosyltransferasy narozdíl od erytrocytů, kde jde o aktivitu A- nebo B-glykosyltransferasy (Cooling a kol., Stroncek, 2005) Distribuce krevních skupin V celosvětovém měřítku není distribuce krvních skupin rovnoměrná. Krevní skupina může být i charakteristickým znakem národa či kmene. Podle její distribuce lze, do jisté míry, usuzovat na příbuznost etnických skupin, které se během historického vývoje geograficky značně rozrůznily. Tabulka 3 : Zastoupení krevních skupin v populaci USA. (podle Základní a klinická imunologie, Stites a Terr, 1994) Frekvence výskytu (%) Krevní v populaci USA skupina Američtí Běloši Černoši indiáni Asiati A B AB Tabulka 4 : Výskyt AB0 skupin ve střední Evropě. (podle Imunohematologie a transfúzní lékařství, Eckstein, 1994) skupina výskyt (%) 0 39 A 48 B 9 AB 4 podskupina výskyt (%) 0 39 A 1 38 A 2 10 B 9 A 1 B 3 A 2 B

13 Tabulka 11 na konci tohoto pojednání udává současnou distribuci krevních skupin AB0 ve světě. Velká variabilita v rozložení se vyskytuje jak u obyvatel světadílů, tak i mezi jednotlivými národy. U některých národů, které žijí izolovaně, např. na ostrovech, a nedochází u nich tedy k míšení genů s jinými národy, se vyskytuje pouze skupina 0. Jde o národy Bororo, Shompen či o peruánské indiány. Krevní skupina 0 je považována za původní krevní skupinu, ze které se postupnými mutacemi a následným křížením národů vyvinuly ostatní skupiny. Nejméně zastoupenou a pravděpodobně nejmladší krevní skupinou je skupina AB, která má ve všech uvedených národech nejmenší zastoupení, snad s výjimkou japonských Ainu, kde odpovídá zastoupení krevní skupiny 0. Evropské národy jsou charakteristické nízkou distribucí skupiny B, ale naopak vysokou distribucí skupiny A. U asijských národů je vysoká distribuce jak A, tak i B skupiny. Krevní skupina také ovlivňuje náchylnost k různým nemocem. Antigeny krevního systému AB0 lze považovat za autoantigeny, tedy struktury tělu vlastní, na které je navozena imunologická tolerance. Imunitní systém tedy musí mít schopnost kvalitativně i kvantitativně omezit tvorbu protilátek proti původcům chorob s podobnými antigenními vlastnostmi jako mají jeho vlastní ABO antigeny. Jako příklad lze uvést virus neštovic, který svou antigenní strukturou napodobuje antigen A. Skutečně u nosičů krevní skupiny A je prokázáno, že mají signifikantně častější výskyt a horší průběh neštovic, než nosiči jiných krevních skupin. V indických centrech pro epidemii neštovic je krevní skupina A svými 10% nosičů skutečně řídká (Eckstein, 1994). Původce moru Jersinia pestis vykazuje antigenní příbuznost s krevním antigenem H. Je známo, že nosiči krevní skupiny 0 vykazují vyšší úmrtnost na mor a tato krevní skupina je vzácnější ve velmi starých centrech moru centrální a přední Asie, stejně jako severní Afriky (viz tabulka 5)

14 Tabulka 5 : Častost výskytu krevní skupiny 0 v centrech moru a v západní Evropě. (podle Imunohematologie a transfúzní lékařství, Eckstein, 1994) Častost výskytu krevní skupiny 0 v centrech moru v západní Evropě národ % národ % Burjati 33 Irové 52 Kirgizové 31 Islanďané 56 Kalmici 26 Sardini 50 Uzbeci 28 Welšani 60 Peršané 31 Norové 38 Arméni 31 Italové 40 Egypťané 32 Němci TVORBA PROTILÁTEK AB0 protilátky jsou označované jako isohemaglutininy nebo také přirozené protilátky. Vznikají jako odpověď na opakovaný styk s antigeny A a B ve střevě, neboť tyto substance se vyskytují u mnoha živočichů a rostlin, sloužících jako potrava. Rovněž jsou součástí mikrobiálních buněk. Většina novorozenců nemá při narození v séru žádné průkazné isohemaglutininy. Vytvářet se u nich začnou až během prvních měsíců života. Lze je poprvé zjistit u dětí ve věku 3 6 měsíců. Nejvíce isohemaglutininů je v těle kolem roku života, poté jejich množství s věkem klesá (Eckstein, 1994). Novorozenci mohou mít ojediněle protilátky anti-a nebo anti-b od matky, ale tyto protilátky jsou třídy IgG (imunoglobulin typu G). Protilátky IgG se do krve plodu dostávají při hemolytickém onemocnění novorozenců transplacentární cestou. Tvorba protilátek je přirozený důsledek činnosti specifických imunitních mechanismů. Erytrocyt obsahující antigen je rozeznán BCR-receptorem (jde o membránově vázaný IgM) zralého B-lymfocytu, na který se antigen naváže příčně. Touto vazbou se indukuje signál k úpravě antigenu na peptidové fragmenty, dále signál ke sdružení těchto peptidů s molekulami MHC II a k syntéze receptoru CD40. MHC II se zanořenými antigenními peptidy se vnoří do membrány B-lymfocytu, kde je rozeznán Th2 pomocným lymfocytem. Zde se antigen naváže na receptor TCR a dojde tak k aktivaci syntézy ligandu CD40L. Ten interaguje s receptorem CD40 na B-lymfocytu. To je podnět pro syntézu receptorů pro cytokiny na B-lymfocytu, které jsou produkovány Th2 lymfocytem. Jejich vazbou na

15 receptory vzniká signál k proliferaci a diferenciaci B-lymfocytů na plazmatické a paměťové buňky. Tvorba plazmatických je indukována cytokinem IL-1 (interleukin 1) a CD23. Plazmatické buňky poté produkují protilátky (Rosypal, 1999). Molekulární podstatou tvorby protilátek je přeskupování subgenů jednotlivých strukturních genů pro těžké a lehké řetězce imunoglobulinů (viz dále). Těmito subgeny jsou L,V, D, J a C subgeny. Geny kódující lehké a těžké řetězce imunoglobulinů se tvoří podle vývojového programu organismu během diferenciace B-lymfocytů v kostní dřeni přeskupováním subgenů do různých kombinací, které u genů pro těžké řetězce začíná v raných prob-lymfocytech a u genů pro řetězce lehké malých preb-lymfocytech. Přičemž každý B-lymfocyt obsahuje jeden strukturní gen pro lehký řetězec a jeden pro těžký řetězec (Rosypal, 1999) REAKCE ANTIGEN/PROTILÁTKA Pro vznik imunologické odpovědi, tj. obrany těla proti tělu cizím látkám, je důležitá reakce antigenu s protilátkou (nebo také uváděná jako reakce Ag/Ab). K této reakci může docházet jak in vivo, tedy uvnitř těla jedince, tak i in vitro, tedy v laboratorních podmínkách. Produkovaná protilátka proti danému antigenu nebo ta, která je již v krvi obsažena, jak je tomu u AB0 systému, nasedá svým vazebným místem ve variabilní oblasti na antigenní determinantu a spojuje se s ní nikoli vazbou kovalentní, ale silami Coulombovými, dále prostřednictvím vodíkových můstků, hydrofobní vazbou a silami van der Walsovými. Mezi antigenní determinantou a vazebným místem protilátky nemusí být naprostá shoda. Proti každé determinantě tělo tvoří totiž tzv. polyklonální protilátky, tj. řadu protilátek, které s ní korespondují více méně věrně. Protilátka se také může kombinovat s antigenem, který její tvorbu nevyvolal jde o tzv. zkřížené reakce, přičemž síla těchto vazeb je pochopitelně různá (Strejček a Lokaj, 1985) Interakce Ag/Ab in vivo Její biologický význam závisí především na specifické eliminaci antigenního materiálu. Protilátkové molekuly jsou schopny neutralizovat toxiny tím, že se vážou na antigenní determinanty uvnitř nebo v blízkosti aktivního toxického místa, a tím brzdí reakci toxinu

16 s jeho substrátem. Protilátky jsou tak schopny aglutinovat nejrůznější korpuskulární antigeny (např. antigeny cizí krevní skupiny) a usnadňovat tak jejich fagocytosu. Schopnost protilátek eliminovat antigen je často spjata s mechanismy nespecifické imunity, tím že antigenní materiál opsonizují a tím umožňují jeho fagocytosu. Po navázání protilátky na antigen dochází k aktivaci komplementu, a to klasickou cestou aktivace (Strejček a Lokaj, 1985) Interakce Ag/Ab in vitro Zde reakce probíhá ve dvou fázích. Primární fáze je reakce specifická a sekundární je vlastní reakce sérologická, která je určena fyzikálním stavem komplexu antigen/protilátka a jeho biologickými následky. Někdy se k této reakci využívá metoda imunoprecipitace. V tomto případě se smíchá antigen s protilátkou a za vhodných podmínek, jako je např. optimální kvantitativní poměr Ag/Ab, vznikají imunokomplexy, které nejsou dostatečně hydrofilní a proto jsou schopny precipitace, tj. tvorby nerozpustné sraženiny (Strejček a Lokaj, 1985) Průkaz reakce Ag/Ab Průkaz Ag/Ab je podstatou celé řady imunologických metod. Reakci Ag/Ab používáme pro určení neznámého Ag nebo pro průkaz přítomnosti známého Ag (v tomto případě musíme mít k dispozici známou Ab),a nebo pro určení neznámé Ab nebo pro průkaz přítomnosti známé Ab (v tomto případě musíme mít k dispozici známý Ag). Při určování krevních skupin se ke krvi jedince, obsahující příslušný Ag, přidá známá Ab. Vazbu Ag/Ab lze prokazovat přímo jestliže je viditelná prostým okem, a nebo nepřímo pak hodnotíme turbidimetricky, pomocí značení (např. značení fluoreskujícím barvivem či radioizotopem) jedné ze složek reakce nebo na základě druhotných jevů reakce. Při určování krevních skupin je tímto druhotným jevem aglutinace. K základním metodám přímého průkazu reakce Ag/Ab patří precipitace (tvorba nerozpustné sraženiny). Ta se provádí v gelu, roztoku nebo agaru. Při precipitaci v gelu lze analyzovat několik systémů Ag/Ab současně, neboť jednotlivé složky směsi difundují jedna po druhé (Strejček a Lokaj, 1985). Metodou přímé fluorescence lze za použití známé značené Ab přesně lokalizovat Ag ve tkáni nebo zjistit jeho přítomnost na povrchu buňky. K dalším metodám přímého průkazu

17 patří značení složek radioaktivními izotopy, jako je např. radiojód nebo tritium (metoda RIA), kompetice enzymaticky značeného a neznačeného Ag o vazbu na Ab (metoda EIA) nebo zakotvením Ag nebo Ab na pevnou fázi (metoda ELISA) (Strejček a Lokaj, 1985). Typickým nepřímým průkazem reakce Ag/Ab jsou aglutinační reakce. Při těchto reakcích se vazba Ag/Ab uskutečňuje na povrchu částic, např. erytrocytů. Protilátky mají dvě nebo pět vazebných míst pro antigen, závisí na typu těžkého řetězce (viz dále). Tak se může jedna molekula Ab navázat na dvě (respektive až pět) částice současně. Poté dochází ke shlukování částic, tedy k jejich aglutinaci. Při aglutinaci dochází k zesítění částic (erytrocytů) pomocí precipitovaných antigenů a protilátek, které se na antigen dané částice navázaly (viz obr. 2). Obrázek 2 : Aglutinace erytrocytů. (zdroj : Přímá aglutinace se používá k určování krevních skupin, ale také k diagnostice některých infekčních chorob. Při pasivní aglutinaci se antigeny uměle vážou na povrch erytrocytů, který byl pozměněn účinkem taninu (Boydova metoda), nebo na povrch částic z umělé hmoty prostou adsorpcí. Takové erytrocyty či jiné částice jsou pak aglutinovány specifickou

18 protilátkou. Při reakcích inhibice aglutinace nedochází k aglutinaci účinkem specifické protilátky, jestliže tato Ab byla předem vysycena příslušným Ag obsaženém v použitém biologickém materiálu (Strejček a Lokaj, 1985) DĚDIČNOST AB0 SYSTÉMU Dědičnost všech dosud známých krevně-skupinových systémů, a tedy i AB0 systému, probíhá přesně podle Mendlových zákonů dědičnosti. Krevně-skupinové vlastnosti jsou pro každého člověka geneticky determinovány a po celý život se nemění, nedochází tedy u nich k žádným kvalitativním ani kvantitativním změnám. Přecházejí podle zákonů dědičnosti z rodičů na děti. Příklady dědičnsoti krevních skupin AB0 systému jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6 : Dědičnost krevních skupin z rodičů na děti. (podle Základy imunohematologie a krevní transfuse, Malaska, 1957) Matka Otec Dítě Fenotyp Genotyp Fenotyp Genotyp Genotyp Fenotyp A 1 A 1 A 1 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 0 A 1 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 0 A 1 A 2 A 2 A 2 A A 1 A 2 0 A 2 A 2 B B A 2 A 2 A 2 0 A 2 A 2 A 2 0 BB B0 BB B0 A 1 A 2 A 1 A 2 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 0 A 2 A 2 A 2 0 A 1 A 1 A 1 A 2 A 1 0 A 2 A 2 A 2 0 A 1 A 2 A 1 0, A 2 A 2 00, A 2 0 A 2 A 2 A A 1 B A 2 B A 1 0 A 2 0 B0 00 A 2 B A 2 0 B0, 00 A 1 A 2 0 A 2 0 A 1 B A 2 B A 1 A 2 B 0 A 2 B A 2 B,0-18 -

19 Známe čtyři základní alely : A 1, A 2, B a 0. Alely A 1, A 2 a B se dědí kodominantně, zatímco alela 0 je vůči nim recesivní. Gen 0 je tak nezasahuje do syntézy antigenních znaků. Pokud považujeme za základní alely pouze A, B a 0, pak máme šest základních genotypů (AA, A0, BB, B0, 00, AB), ale jen čtyři základní fenotypy (A, B, 0, AB). AB0 systém je podmíněn geny A 1, A 2, B a 0, které jsou na devátém chromosomu, a geny H a h, které jsou na chromosomu 19. Dále existuje vzájemný vztah genů Se a se, které jsou též na chromosomu 19. Nosiči genové kombinace SeSe a Sese vylučují AB0 substance ve svých tělních tekutinách (tzv. sekretoři, 80% všech lidí), zatímco sese homozygoti (20% všech lidí) jsou nonsekretoři (Eckstein, 1994). Antigeny krevních skupin jsou buď přímými (proteiny), nebo nepřímými (sacharidy) produkty alel, které se vyskytují na témže lokusu nebo na lokusech, mezi nimiž je crossing over extrémně vzácný, neboť jsou velmi blízko u sebe. Pro každý antigen tak platí, že v kódovacím lokusu je přítomna jen jedna alela (Daniels, 2002). Geny A a B řídí pouze poslední stupeň syntézy substancí A a B ze substance prekursorové, kterou označujeme H. Substance H je až na jedinou níže uvedenou výjimku obsažena ve všech lidských erytrocytech. Na její množství má vliv skupina AB0. Nejvíce je jí v erytrocytech 0 (protože gen 0 je amorfní, syntéza krevně-skupinových znaků se zastavuje u substance H, která se tudíž nespotřebuje), nejméně v erytrocytech A 1 B. Substance H vzniká z prekursorové substance vlivem genu H při genotypu hh se substance H nesyntetizuje vůbec a výsledek je vzácný genotyp 0 h (běžným vyšetřením zde diagnostikujeme skupinu 0, ale v erytrocytech chybí substance H, takže tyto erytrocyty nejsou aglutinovány sérem anti-h) (Strejček a Lokaj,1985). 19

20 3. SLOŽKY AB0 SYSTÉMU 3.1. ERYTROCYTY Erytrocyty jsou krevní elementy, které neobsahují jádro a mají bikonkávní tvar. Tento tvar jim nejlépe zajišťuje pružnost a umožňuje tak procházet kapilárami o menším průsvitu než je jejich průměr. Díky obsaženému krevnímu barvivu hemoglobinu jsou schopné vázat a přenášet kyslík a oxid uhličitý. Erytrocyty mají na základě jejich negativního náboje na své membráně dvojitou iontovou vrstvu. Vnitřní, tvořená positivními ionty, je pevně vázána na negativní vrstvu povrchu erytrocytu. Potenciál mezi těmito vrstvami tzv. zeta-potenciál způsobuje, že se erytrocyty vzájemně odpuzují a za normálních okolností zachovávají fyziologickou vzdálenost, která je určena právě jejich iontovými vrstvami. Tato vzdálenost může být překlenuta na základě velikosti molekul protilátek (Eckstein, 1994). Na svém povrchu mají sacharidové epitopy - antigenní struktury, které určují jejich krevně-skupinovou charakteristiku. Tím se podílí na imunitě organismu, neboť antigeny na povrchu jsou rozeznávány protilátkami jiných krevních skupin. K tomu může dojít pouze při krevní transfusi. Počet erytrocytů řádově převyšuje počet buněk imunitního systému. Na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů. Na povrchu je vedle antigenů krevního systému AB0 exprimováno mnoho jiných membránových molekul s rozmanitými funkcemi. Jde o molekuly, které mají adhezní funkci, která jim umožňuje prostup cévními vlásečnicemi. Tak zabraňují prostupu leukocytů z postižené tkáně a tím může dojít k jejich případné aktivaci. Dále jde o receptory pro chemokinové molekuly. Prostřednictvím membránových molekul mohou vstupovat do erytrocytu mnohá infekční agens (Krejsek a Kopecký, 2004). Erytrocyty jsou výsledkem diferenciace myeloidních elementů, zadaných do vývoje v červenou řadu krevních buněk. Vývoj začíná hemopoetickou kmenovou buňkou, která se diferencuje na progenitorovou myeloidní buňku. Na úrovni erytroblastu dochází ke ztrátě buněčného jádra. Zralé erytrocytární elementy již tedy neobsahují nukleové kyseliny. Pro diferenciaci erytrocytů i pro jejich funkce jsou důležité adhezní molekuly, které jsou ve značné míře na povrchu buněk červené řady vyjádřeny (Krejsek a Kopecký, 2004). Erytrocyty vznikají až do poloviny zárodečného života v játrech, poté se přidává slezina a kostní dřeň. Asi ve třetím týdnu po narození probíhá krvetvorba pouze v kostní dřeni. Krvetvorba (obr. 3) 20

21 je řízena hormonem erytropoetinem, který vzniká v ledvinách. Ten stimuluje proliferaci časných stádií erytroblastu i uvolňování zralých erytrocytů ze dřeně do krevního oběhu (Bičík, 1992). Změny v membránové struktuře jsou charakteristické pro stárnoucí erytrocyty, které jsou z oběhu odstraňovány retikulo-endotelovým systémem sleziny. Jejich identifikaci umožňuje velké množství na povrch adsorbovaných IgG. Obrázek 3 : Krvetvorba. (upraveno podle Klinická imunológia, Buc, 1997) 21

22 3.2. ANTIGENY Molekuly A, B a H jsou z imunologického hlediska antigeny. Jde o struktury fylogeneticky velmi staré, pravděpodobně přešlé z prokaryontů na eukaryonty. Tyto biologicky velmi konzervované struktury jsou hojně rozšířeny v přírodě. Jde o substance, které stimulují u cizího organismu imunitní systém (podle stupně cizosti a antigenní síly) k tvorbě specifických protilátek. Antigeny můžeme rozdělit na kompletní a nekompletní. Kompletní antigen neboli imunogen se skládá z nosiče, haptenu a epitopu. Hapten je specifický nosič, který způsobuje vlastní imunogenitu antigenu. Antigeny, které neobsahují epitopy, nejsou tedy imunogenní, plní pouze strukturní funkci a nazýváme je nekompletní antigeny. Právě epitop je na antigenu rozeznáván při jeho setkání s protilátkou. Podle původu můžeme antigeny dělit do pěti základních skupin. Xenogenní (heterologní) antigeny pocházející od jiného jedince jiného druhu. Allogenní pocházející od jiného jedince stejného druhu. Autologní pocházející od jednoho jedince. Isogenní pocházející od jiného jedince se stejnou genetickou výbavou, jedná se např. o jednovaječná dvojčata, a syngenní, které pochází z inbredních linií Struktura molekuly antigenu AB0 systému Základními antigeny AB0 systému jsou A, A 1, B a H. Antigeny A a A 1 jsou vlastní krevní skupině A 1, zatímco antigen A 1 jako samostatný je vlastní pro A 2. Antigen B se vyskytuje u krevní skupiny B, antigen H jako prekursor ostatních antigenů je vlastní skupině 0. Krevní skupina AB obsahuje jak antigen A, tak i B. AB0 antigeny jsou sacharidové struktury. Oligosacharidové řetězce jsou obecně spojeny s polypeptidy do formy glykoproteinů nebo s ceramidy do formy glykosfingolipidů. Oligosacharidy jsou syntetizovány kaskádovým způsobem, připojení každého monosacharidu je katalyzováno specifickou glykosyltransferasou. Nejméně 100 glykosyltransferas se podílí na syntéze známých lidských sacharidů. Geny produkující mnohé z nich jsou klonovány a sekvenovány, včetně těch pro krevní systém AB0 a pro sekreci H antigenu. Dvě hlavní třídy sacharidových řetězců na glykoproteinech AB0 antigenů jsou N- glykany (velice rozvětvené struktury navázané na asparagin N-acetylglukosaminem) a O-glykany (samostatné nebo komplexní struktury navázané na serin nebo treonin 22

23 N-acetylgalaktosaminem). Glykosfingolipidy obsahují sacharidové řetězce navázané na ceramid. Jsou klasifikované jako lakto-, globo- a nebo gangliosérie podle původu sacharidového řetězce (Daniels,2002). Obrázek 4 : AB0 antigeny. (podle Klinická imunológia, Buc, 1997) 23

24 3.3. PROTILÁTKY Charakteristika protilátek Protilátky (aglutininy) jsou součástí globulinové frakce séra. Protilátky systému AB0 řadíme k imunoglobulinům třídy M (IgM). Pro svou velkou molekulovou hmotnost je jejich výskyt omezen na krevní plasmu. Do tělních tekutin se dostávají velmi zřídka. Koncentrace IgM klesá v závislosti na věku či pohlaví. Protilátky systému AB0 se označují jako tzv.přirozené protilátky neboli isohemaglutininy (někdy také jen isoaglutininy). Jde o protilátky pravidelné, tzn. že se vždy vyskytují u dané krevní skupiny, a kompletní lze je prokázat ve fyziologickém prostředí, neboť jejich molekuly jsou dostatečně velké, aby překlenuly minimální vzdálenost mezi erytrocyty (danou jejich zeta-potenciálem) a tím umožnily jejich aglutinaci. Vzácně se mohou v séru objevovat tzv. nepravidelné protilátky, jako je např. anti-a 1 u nosičů skupiny A 2 nebo anti-h u nosičů skupiny A 1. Tyto protilátky jsou účinné pouze v chladu (tj. při nižší než pokojové teplotě). Výjimečně mohou způsobovat aglutinaci až do teploty 37 C (Daniels, 2002). Protilátky anti-a a anti-b způsobují aglutinaci erytrocytů, za přítomnosti komplementu mohou působit i jako hemolysiny. Pokud přirozená protilátka funguje jako hemolysin, je spouštěcí látkou k aktivaci komplementu, kterým jsou rozloženy aglutinované erytrocyty. (Průkazem proběhnutí hemolysy je vylití hemoglobinu z rozrušených erytrocytů.) Aglutininy úplně chybí u osob skupiny AB, často u novorozenců a jen velmi zřídka u zdravých jedinců ostatních skupin. Zde hovoříme o tzv. defektních krevních skupinách. S velmi nízkým titrem isohemaglutininů nebo s jejich úplným chyběním se setkáváme u agamaglobulinémií, které patří mezi tzv. imunodeficience (Strejček a Lokaj, 1985). 24

25 Struktura protilátek Molekuly protilátek se nazývají imunoglobuliny (Ig). Jde o hybridní molekuly, jejichž systém je pod kontrolou několika genů. Exprese imunoglobulinových genů je omezena vždy na jednu alelu chromozomového páru. Proto v příslušném B-lymfocytu se vyjádří syntézou imunoglobulinového řetězce jen jedna alela pro těžký řetězec a jen jedna alela pro řetězec lehký. Tento jev se nazývá alelická exkluze. Kromě toho existuje ještě izotypická exkluze, což znamená, že v každém klonu B-lymfocytů se syntéza řetězců typu κ a λ (viz dále) vzájemně vylučuje, tj. tvoří se v něm jen jeden typ lehkého řetězce (Rosypal, 1999). Všechny Ig mají stejnou základní strukturu (viz obr. 5). Jsou složeny minimálně ze čtyř polypeptidických řetězců ze dvou lehkých řetězců L o stejné primární struktuře a ze dvou těžkých řetězců H také o stejné primární struktuře. Vzájemné spojení těchto řetězců je umožněno kovalentními disulfidickými vazbami a vodíkovými můstky. Těžké řetězce obsahují přibližně 430 aminokyselinových zbytků, zatímco lehké asi jen 214 aminokyselinových zbytků. Každý řetězec sestává ze dvou oblastí konstantní C a variabilní V. Ve variabilních úsecích se těžké nebo lehké řetězce navzájem liší. Těžké i lehké řetězce vytváří tzv. globulární domény (Rosypal, 1999). Proteolytickými enzymy lze molekulu imunoglobulinu rozštěpit. V případě štěpení papainem se tvoří na dva fragmenty Fab (s protilátkovou specificitou, tj. schopností vázat se na antigen) a jeden fragment Fc, který je tvořen zbývající částí těžkého řetězce. Při štěpení pepsinem vznikají také Fab fragmenty, ale ty zůstavají spojené, označují se jako F(ab) 2, protože pepsin štěpí pod místem disulfidických vazeb mezi oběma těžkými řetězci. Místo Fc fragmentu tak vznikjí pouze peptidové fragmenty (Buc, 1997). 25

26 Obrázek 5 : Základní struktura molekuly imunoglobulinu. (upraveno podle Základy molekulární biologie, Rosypal, 1999) Variabilní úseky. U variabilních úseků se primární sekvence aminokyselin liší podle specificity protilátek. Pouze asi 15 aminokyselin se podílí na vlastním vazebném místě pro antigen. Celé variabilní úseky se přitom skládají asi ze 100 aminokyselin. Každý tento úsek je složen ze tří hypervariabilních úseků = CDR (complementarity determining regions) a čtyř úseků základní struktury = FR (framework region, kostrové úseky). Hypervariabilní úseky jsou v primární struktuře značně proměnlivé, a jsou tedy základem specificity protilátky, tvoří vazebné místo pro antigen. Více aminokyselinových zbytků vázajících se na antigen je ve variabilních doménách těžkých řetězců (Rosypal, 1999). Konstantní úseky. Část konstantního úseku těžkého řetězce je flexibilní. Jde o tzv. pantovou oblast, která umožňuje změnu konformace imunoglobulinu vzhledem k determinantám na molekule antigenu. U polymerního IgM, kam patří protilátky AB0 systému, a IgA se tato pantová oblast nevyskytuje. Místo ní je zde specifický J-řetězec. Ten se skládá ze aminokyselin a ze 7 8 cukerných zbytků, přičemž je zde nápadná přítomnost cysteinu. Je nazýván také spojovacím polypeptidem, neboť spojuje dva těžké řetězce. Sám je zpevněn jednou disulfidickou vazbou. Gen, který J-řetězec kóduje, je u 26

27 člověka na chromosomu 4 a u myši na chromosomu 5. Do Ig se dostává posttranslačně ještě před sekrecí z buňky (Rosypal, 1999). Konstantní úseky, především Fc fragment, se neúčastní přímé vazby na antigen, zato zajišťují zapojení nespecifických mechanismů imunity. Na Fc fragmentu je např. místo, které je schopno vázat a aktivovat komplement či místo, které se komplementárně váže na Fc receptor fagocytů. Struktura Fc fragmentu také umožňuje transplacentární přestup protilátek (především třídy IgG). Imunoglobuliny jsou také často glykosylovány, tzn. připojují se na ně oligosacharidy N-glykosidovou vazbou. Tato glykosylace probíhá na různých místech těžkého řetězce. Lehké řetězce. Existují dva typy lehkých řetězců typ κ a λ. Jejich poměr v zastoupení u člověka je asi 60% : 40%. Ig se stejným typem těchto řetězců se liší ve variabilních úsecích, ale jejich konstantní úseky jsou stejné. Tyto úseky se označují V κ, V λ, C κ a C λ, přičemž se vždy spojuje V κ a C κ nebo V λ a C λ. Molekulární hmotnost lehkých řetězců je asi Těžké řetězce. Rozlišujeme pět základních typů těžkých řetězců - γ, α, µ, δ a ε. Typ γ má čtyři podtypy a typ α má dva (platí u lidí). Ig se stejným typem těchto řetězců se liší ve variabilních úsecích, ale jejich konstantní úseky jsou stejné. Podle typu těžkých řetězců rozdělujeme Ig do pěti základních tříd třídy IgG, IgA, IgM, IgD a IgE (viz tabulka 7). Každá tato třída nebo její podtřída přitom může obsahovat buď lehký řetězec typu κ nebo typu λ (Buc, 1997). 27

28 Tabulka 7 : Klasifikace lidských a myších imunoglobulinů. (upraveno podle Úvod do molekulární biologie, Rosypal, 1999) Třída Podtřída Lehký řetězec (L) Těžký řetězec (H) Počet H a L řetězců v molekule člověk myš člověk myš člověk myš člověk myš IgG1 IgG1a γ1 γ1 IgG IgG2 IgG2a γ2 γ2a IgG3 IgG2b γ3 γ2b L 2 H 2 IgG4 IgG3 γ4 γ3 IgA IgGA1 κ nebo λ α1 L - α 2 H 2 nebo L 2 H 2 IgGA2 α2 (L 2 H 2 ) 2 IgM IgGM - µ µ (L 2 H 2 ) 5 IgD - - δ δ L 2 H 2 IgE - - ε ε L 2 H 2 Domény. Těžké a lehké řetězce vytvářejí tzv. domény. Ty sestávají z β-skládaných listů, které jsou navzájem antiparalelní a jsou spojeny různě dlouhými smyčkami. Celá struktura domény je stabilizována vodíkovými vazbami, které přes skupiny NH a CO spojují sousední řetězce skládaného listu. V řetězcích se střídají hydrofobní a hydrofilní aminokyselinové zbytky, jejichž postranní řetězce jsou seřazeny kolmo k rovině β-skládaného listu tak, že hydrofobní aminokyseliny jsou orientovány dovnitř a hydrofilní vně (Rosypal,1999). Lehký řetězec je tvořen jednou konstantní a jednou variabilní doménou. Těžký řetězec tvoří jedna variabilní doména a tři domény konstantní. U tříd IgM a IgE jsou čtyři konstantní domény těžkého řetězce. Typy řetězců, ať už těžkých nebo lehkých, můžeme označit jako izotypové determinanty, jež jsou právě podkladem pro rozdělení Ig do tříd. Mimoto můžeme na Ig rozlišit ještě další dva typy determinant, a to determinanty allotypové, přítomné u některých jedinců na řetězcích typu γ, α a κ., a determinanty idiotypové, které jsou výrazem unikátního uspořádaní aminokyselin ve vazebném místě protilátky. IgM. Protilátky AB0 systému patří do třídy IgM (tabulka 10), která tvoří asi 5 10% z celkového obsahu imunoglobulinu v krevním séru. Jako monomer se váže na B-lymfocyty, kde funguje jako receptor pro antigen. V séru se pak ale vyskytuje jako pentamer obsahující J-řetězec, v této podobě funguje jako protilátka (obr.6). Každá podjednotka polymerního IgM je tvořena dvěma lehkými řetězci typu κ nebo λ a dvěma těžkými řetězci 28

29 typu µ. Vyznačuje se tak sice deseti vazebnými místy, ale díky sférické zábraně se na něj může navázat maximálně pět antigenů. Těžký řetězec obsahuje čtyři konstantní domény. Právě čtvrtá konstantní doména CH4 je místem pro vazbu komplementu. Díky své velikosti není schopen přecházet přes placentu a je přítomen pouze intravaskulárně. IgM je časově první jak v ontogenezi tak i fylogenezi. Obrázek 6 : Pentamer IgM. (upraveno podle Immunobiology, Janeway a kol., 2005) Tabulka 8 : Porovnání vlastností lidských IgM a IgG. (upraveno podle Imunologie v klinické praxi, Strejček a Lokaj, 1985) IgM IgG J-řetězec + - Molekulární (µ 2 κ 2 ) 5 -J γ 2 κ 2 formule (µ 2 λ 2 ) 5 -J γ 2 λ 2 Molekulová hmotnost % cukrů 12 3 Poločas 5 21 v plasmě (dny) Prostup - + placentou Aktivace + + komplementu Koncentrace 1,0 11,0 v séru (g/l) Anti-A a anti-b Anti-A a anti-b protilátky se většinou vyskytují v séru jedinců, kterým chybí odpovídající antigen na jejich erytrocytech. S výjimkou novorozenců jsou odchylky od tohoto pravidla velmi vzácné. Velmi zřídka může již plod produkovat protilátky typu IgM. Isohemaglutininy jsou třídy IgM, ale mohou být i třídy IgG či IgA. IgM je však plně dominantní. Titr IgG narůstá po stimulaci lidskými antigeny A a B. IgA se objevuje až postimunizačně. Následující tabulka podává charakteristiku AB0 protilátek (tabulka 9) (Daniels, 2002). 29

30 Tabulka 9 : Charakteristika IgM, IgG a IgA AB0 protilátek. (upraveno podle Human Blood Groups, Daniels, 2002) Charakteristika IgM IgG IgA výskyt v séru neimunizovaných donorů ANO NĚKDY VZÁCNĚ výskyt v séru imunizovaných donorů ANO OBVYKLE OBVYKLE aglutinované erytrocyty ANO ANO ANO zvýšený titr v antiglobulinovém testu NE ANO ANO teplotní optimum 4 C 4-37 C výskyt v kolostru NĚKDY NE ANO Z pohledu krevní transfuse je krevní skupina 0 obvykle považována za tzv. universálního donora a transfuse krve skupiny 0 příjemcům skupiny A a B (tedy s protilátkami anti-b a anti- A) se považuje za kompatibilní transfuzi. Anti-A a anti-b jsou příčinou rejekce ledvin, jater a srdce při inkompatibilních transplantacích Anti-A,B Séra krevní skupiny 0 neobsahují protilátky anti-a a anti-b jako oddělené, ale jako křížově reagující protilátku zvanou anti-a,b. Když je eluát vyroben z erytrocytů skupiny A (nebo B) inkubovaných v séru skupiny 0, protilátky v eluátu budou aglutinovat erytrocyty skupiny A i B. Takovýto efekt nezískáme, pokud pro vytvoření anti-a,b použijeme oddělené protilátky anti-a a anti-b a smícháme je. Tato křížová reaktivita je však často asymetrická. U jedinců skupiny 0, kteří byli imunizováni erytrocyty skupiny A nebo A-substancí, křížově reagující protilátka obvykle pro aglutinaci preferuje erytrocyty skupiny A než skupiny B. Bylo prokázáno, že protilátky produkované donory krevní skupiny 0 závisí jak na antigenu A, tak i na antigenu B (Daniels, 2002) Anti-H Protilátky anti-h detekují prekursor A a B antigenů, tzv. H-antigen. 30

31 Charakteristicky více aglutinují erytrocyty skupiny 0 a A 2 než erytrocyty skupiny A 1 a B. Anti-H nejsou u sekretorů, vyskytují se obvykle v séru nesekretorů s H-deficientem. Pokud ale produkujeme monoklonální anti-h, toto anti-h často nebývá inhibováno sekretory, jako je tomu v případě polyklonálního ( přirozeného ) anti-h. Protilátky anti-h se produkují na mnoha zvířatech (jako jsou myši či kuřata) imunizací erytrocyty skupiny 0 nebo purifikovanými substancemi H (Daniels, 2002). 4. MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY AB0 SYSTÉMU 4.1. CHARAKTERISTIKA MONOKLONÁLNÍCH A POLYKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK Převratnou změnou v imunologii, imunohematologii i dalších biologických oborech, zejména pak v medicíně, vyvolala možnost přípravy monoklonálních protilátek. Protilátky, které vznikají jako přirozená odpověď organismu na antigen, jsou polyklonální. Jsou zaměřené proti různým epitopům antigenu, vznikají polyklonální imunitní odpovědí na komplexní antigen. Jsou tvořeny mnoha klony B-lymfocytů. Z hlediska svých vlastností jsou tedy heterogenní. Naproti tomu monoklonální protilátky (MoAb) jsou produktem pouze jednoho klonu B-lymfocytů a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu antigenu (proti jednomu antigenu tak může existovat několik různých MoAb). Jsou tedy čistě homogenní ve svých vlastnostech. To z nich činí nástroj přesné diagnostiky a následně i cílené léčby. Homogennost MoAb je způsobeno strukturou protilátek, jejichž domény existují a fungují relativně samostatně. Tyto jsou připravovány pomocí hybridomové technologie (viz dále). Tělo produkuje i jakési přirozené monoklonální protilátky. Jde o monoklonální Ig, které se v těle vyskytují při nádorovém bujení a jsou považovány za nejdůležitější nádorový marker, který je analyzován v klinických laboratořích. Jde o tzv. paraproteiny neboli myelomové proteiny. Předpokládá se, že všechny monoklonální imunoglobuliny mají protilátkovou aktivitu. Je jisté, že jsou produktem jednoho klonu proliferující B-lymfocytové řady a jsou homogenní. Mohou to být celé Ig nebo jen fragmenty Ig (Tichý, 1997). 31

32 4.2. VÝHODY MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK Výraznou výhodou MoAb oproti polyklonálním protilátkám je jejich specifita proti jen jednomu epitopu daného Ag. Výhodou je tedy samotná monoklonalita těchto protilátek. Není to však jen jejich monoklonalita, která může někdy být i nevýhodou, ale fakt, že jsou produkovány in vitro. Hybridomová technologie umožňuje spojit výhodné vlastnosti nádorových buněk (rychlý růst, nesmrtelnost) s potřebnými funkcemi (produkce protilátek dané specifiky). Klony hybridomů tak můžeme relativně neomezeně pěstovat v in vivo i in vitro podmínkách. Odstraňuje se tak nutnost imunizace lidských dobrovolníků z důvodů získání potenciálních reagentů (Vaňák, 1988) PŘÍPRAVA MONOKLONÁLNÍCH PROTILÁTEK Monoklonální protilátky se připravují metodou hybridomové technologie. Jde o somatickou hybridizaci buněk produkujících protilátky s buňkami nádorových linií. Tato metoda byla popsána v roce 1975 Köhlerem a Milsteinem. Tímto způsobem můžeme získat protilátky prakticky v neomezeném množství, které mají danou specifiku. Hybridomy lze připravit fúsí buněk nádorové linie se splenocyty (buňkami sleziny) nebo lymfocyty získanými od imunizované myši nebo krysy (obr. 7). Nádorová buněčná linie vybraná pro fúsi s buňkami produkujícími protilátky je charakterizována dvěma významnými vlastnostmi nemá vlastní produkci Ig a nemá aktivitu hypoxantin fosforibosyl transferasy. Vlastní fúse jednotlivých buněk se provádí působením polyetylenglykolu. Po fúzi zůstávají v kultuře tři různé populace buněk : splenocyty, myelomové buňky a buňky hybridní (Stites a Terr, 1994). 32

33 Obrázek 7 : Tvorba hybridomu a monoklonálních protilátek. (zdroj : Hybridní buňky jsou po fúsi kultivovány např. v médiu HAT, které obsahuje hypoxantin, aminopterin (jde o antagonistu kyseliny listové) a thymidin. Splenocyty a myelomové buňky v průběhu této kultivace odumírají. Hybridní buňky velmi rychle rostou, jejich počet se zdvojnásobuje v průběhu hodin, dochází k rychlé tvorbě buněčných kolonií. Ty se pak klonují metodami limitního ředění a v supernatantech se testuje protilátková aktivita (metodami RIA nebo ELISA). Reklonací je získána skutečná monoklonální linie, hybridom, jehož produkty protilátky jsou imunochemicky a fyzikálně-chemicky charakterizovány (Stites a Terr, 1994). Hybridomová technologie umožňuje při imunizaci použít komplexní antigeny, které obsahují množství determinant. Tato skutečnost je využívána i v přípravě MoAb proti AB0 skupinám, kdy častým imunogenem jsou intaktní erytrocyty. Vzhledem ke složitosti erytrocytární membránové struktury, kdy není překvapující silná imunitní odpověď pokusných zvířat proti dalším, vysoce frekventovaným Ag, se obvykle používají i jiné imunizační materiály sekreční glykoproteiny, purifikované membránové glykolipidy a syntetické oligosacharidy. Tvorbu protilátek proti AB0 antigenům vyvolává rovněž imunizace nádorovými buňkami, na jejichž membránách jsou tyto skupinové determinanty nezřídka exprimovány (Vaňák, 1988). 33

34 Nyní se provádí i přípravy lidských či mezidruhových hybridomů. Značná pozornost je věnována právě těm lidským tzv. humanizovaným protilátkám HUMANIZOVANÉ MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY MoAb jsou ve své podstatě myší protilátky, imunitní systém je jako cizí rozpoznává a začne si proti nim vytvářet vlastní (anti-myší) protilátky. To zejména při opakované aplikaci MoAb snižuje jejich účinnost, vyvolává riziko navození přecitlivělosti. Dalšími problémy myších MoAb jsou : afinita pro Ag může být nízká, jednotlivé typy MoAb neochotně aktivují komplement nebo aglutinují Ag in vitro a je složité využít je in vivo u lidí. Vyhnout se tomuto problému je možné tak, že zavedeme in vitro zpracovaný gen pro Ab do myelomových buněk. Tento proces se nazývá transfekce a získané hybridomy pak transfektomy. Jde o integraci donorové DNA do buněčných chromosomů. Postrádají-li recipientní buňky genetický rys zakódovaný v DNA donora, tak tento rys získají. Mohou se tak produkovat zcela nové rodiny přizpůsobených MoAb, které nazýváme chimerické nebo také rekombinantní MoAb (Elgert, 1996). Cílem tohoto procesu je především získat tzv. humanizované MoAb. Připravují se tak, že se z molekuly myší protilátky izoluje pouze část variabilní oblasti lehkého řetězce, komplementární k epitopu (vazebné místo protilátky). Ta je spojena s konstantní částí molekuly lidského Ig. Podíl lidské bílkoviny v protilátce je pak asi 95%, podíl myší je velmi malý. Proti takto humanizované MoAb pak lidský imunitní systém odpovídá jen slabě (redukuje se tedy jejich imunogennost), jejich specifičnost je zachována a mohou se tak lépe využívat v terapeutické praxi (URL 1) MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY SYSTÉMU ABO První MoAb v rámci AB0 systému byla protilátka anti-a. Tato protilátka vznikla z imunizované myši a lidských lymfocytů tonsil. Předpokládalo se, že tato anti-a může být užitečná v určování krve, ale později bylo prokázáno, že postrádá dostatečnou potenci k A 2 a A 2 B buňkám (Daniels, 2002). Množství dalších monoklonálních anti-a brzy následovalo : některé byly produkovány záměrně pomocí imunizovaných myší s erytrocyty krevní skupiny A nebo purifikované látky, jiné náhodně pomocí imunizace s rakovinnými buněčnými liniemi, jinými buňkami nebo epidermálním růstovým faktorem. Některé MoAb chovající se jako anti-a 1 byly poté zveřejněny. 34