RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie, PřF UP Olomouc

Transkript

1 RNDr. Ivana Fellnerová, Ph.D. Katedra zoologie, PřF UP Olomouc Studijní materiály na:

2 Prezentace navazuje na základní znalosti Biochemie a cytologie. Bezprostředně navazuje na přednášku: Specifická imunita-úvod Specifická imunita-t a B lymfocyty Symboly označující animaci resp. video (dynamická prezentace daného fyziologického procesu). Plnohodnotné animace (videa) spolu s podrobným výkladem studenti uvidí na přednáškách popř. praktických cvičeních. Varianta pro tisk, která je k dispozici na internetu obsahuje jen statické popisy těchto procesů.

3 TOLERANCE VLASTNÍ NORMÁLNÍ BUŇKY A MOLEKULY IMUNITNÍ DOHLED VLASTNÍ, PATOLOGICKY ZMĚNĚNÉ BUŇKY Imunitní systém rozpoznává: CIZORODÉ ČÁSTICE Brání jejich vstupu do organismu. V těle pak cizorodé částice inaktivuje a ničí OBRANYSCHOPNOST

4

5 SPECIFICITA imunitního systému Základní vlastností adaptivního imunitního systému je Složky specifického imunitního systému od sebe rozpoznají dvě různé molekuly na základě velmi malých rozdílů v jejich molekulární struktuře

6 POLYMORFISMUS imunitního systému Složky (molekuly) imunitního systému, které rozpoznávají potenciální antigeny se vyskytují v obrovském množství variant (Greek: poly =many, morphe =shape, structure) Spektrum molekul stejné funkce, které se líší svojí strukturou označujeme jako

7 GENETICKÝ POLYMORFISMUS Široký repertoár molekul imunitního systému zajišťuje POLYMORFNÍ GENY U různých jedinců téhož druhu se vyskytuje mnoho forem téhož genu, tzv. alelické varianty, resp. alely NEPOLYMORFNÍ GENY Jsou reprezentovány jedinou sekvencí nukleotidů u všech jedinců daného druhu

8 Imunogenetika - interdisciplína na Obor zabývající se studiem GENŮ uplatňujících se při formování složek imunitního systému se nazývá: Studuje např.: geny imunoglobulinové rodiny ( superfamily ) mechanismy uplatňující se při formování polymorfních molekul HLA systém a geny, které je kódují Vazby HLA molekul na různá onemocnění

9 Membránový receptor B lymfocytu Membránový receptor T lymfocytu IMMUNOGLOBULINY [ protilátky ] membránové glykoproteiny

10 Receptory lymfocytů, imunoglobuliny Membránové receptory B lymfocytů IMMUNOGLOBULINY [ protilátky ] Membránové receptory T lymfocytů Při formování se uplatňují: Vysoce polymorfní geny Další specifické genetické mechanismy zvyšující polymorfismus: přeskupování genů alelická exkluze

11 Mechanismus dosažen ení bohatého ho repertoáru ru Každý specifický receptor (protilátka) nemůže být z kapacitních důvodů kódován samostatným genem. K odvození vysoce variabilních proteinů se evolučně vyvinuly speciální genetické mechanismy: ( gene rearrangement ) Mechanismy probíhají na genové úrovni během diferenciace lymfocytů

12 OBECNÉ ZNAKY VÝVOJE LYMFOCYTŮ Růst.faktory Inic.přeskupování genů Proliferace Exprese 1 řetězce receptoru Proliferace Exprese kompletního receptoru POZITIVNÍ a NEGATIVNÍ selekce Diferenciace efektorových lymfocytů APOPTÓZA APOPTÓZA Slabá vazba s vlastním antigenem Aktivace transkripčních regulátorů IL-7 ZRALÝ lymfocyt EFEKTOROVÁ buňka HSC PRO- B/T Lymfocyt (lymfoidní Prekurzor) PRE B/T Lymfocyt 1 řetězcový receptor NEZRALÝ lymfocyt Silná vazba s vlastním antigenem APOPTÓZA Vývoj na antigenu nezávislý Primární lymfatické orgány (kostní dřeň, thymus) VLASTNÍ antigeny CIZÍ antigeny Periferie

13 Náhodná somatická úprava genů zajišťující maximální diversitu podloženou relativně malým počtem genů v zárodečné DNA Probíhá v primárních lymfatických orgánech Probíhá ve dvou fázích: Přeskupení a exprese genů pro tězký řetězec (B-lymfocyt) resp. βřetězec (T-lymfocyt) Přeskupení a exprese genů pro lehký řetězec (B-lymfocyt) resp. α řetězec (T-lymfocyt)

14 GENY KÓDUJÍCÍ ŘETĚZCE IMUNOGLOBULINŮ (BCR) a TCR Chromozomy č. 2, 7, 14 a 22 Variabilní oblast Konstantní oblast B Lymfocyt Ig (BCR) těžký řetězec (μ) Ig (BCR) lehký řetězec (κ a λ ) CHROMOZOM č. 14 V D J C CHROMOZOM č. 2 ( ) a 22 ( ) V J C Chromozomy obsahují genové segmenty V, D, J a C T Lymfocyt TCR řetězec TCR řetězec CHROMOZOM č. 7 V D J C CHROMOZOM č. 14 V J C

15 STRUKTURA GENOVÝCH SEGMENTŮ H-řetězce Segment V kóduje AMK č Segment D kóduje AMK č Segment J kóduje AMK č variabilita > 100 diversita ~ 50 joining 9 Geny kódující konstantní část V D J C 5 konec 3 konec Charakteristické sekvence nukleotidů na konci jednotlivých úseků Jsou rozpoznávány enzymy provádějícími přeskupování

16 PŘESKUPOVÁNÍ GENOVÝCH SEGMENTŮ variabilita > 100 diversita ~ 50 joining 9 Geny kódující konstantní část V D J C D J přeskupení V D přeskupení Sestříh intronů (splicing) V D J přeskupená DNA, která slouží k trankripci do mrna a translaci do proteinu

17 G G G A A A T T C A SPOJOVACÍ VARIABILITA G G G A A A T G T C C G G A A A T C T A G G A T C T C A C T A G G A T C T C A A T Lymfocyt-specifický enzym rekombináza (recombination-activating gene Rag-1, Rag-2) odstřihne část DNA mezi určitými úseky C T A G G A T C C T T C A C T G A G V případě asymetrie je podle delšího vlákna DNA syntetizováno vlákno komplementární tzv. P úsek Další nukleotidy (bez komlementárního vlákna) můžou být náhodně vloženy meri spojované části zárodečné DNA tzv. N úsek (TdT terminal deoxynucleotidyl transferase) V segment D segment

18 TĚŽKÝ ŘETĚZEC LEHKÝ ŘETĚZEC Zárodečná DNA Vyštěpení úseku D - J Vyštěpení úseku V - D Primární RNA transkript Sestřih intronů (splicing) mrna Translace Polypeptidický řetězec

19 Proces umožňující expresi jen jedné z rodičovských alel kódujících řetězce receptorů T a B lymfocytů Zajišťuje existenci výhradně jedné varianty receptoru u jednoho klonu lymfocytů

20 ALELICKÁ EXKLUZE Přeskupování genových segmentů kódujících řetězce imunoglobulinů probíhá současně na obou homologních chromozomech STOP Čitelná V-D-J-C sekvence Přeskupování na párovém genu se zastavuje Po dosažení čitelné sekvence u jedné alely, dochází k zastavení procesu u homologního chromozomu (proteinový produkt první úspěšně rekombinované alely zastavuje rekombinaci na homologním chromosomu)

21 Testování síly vazby lymfocytu s vlastními antigeny a MHC molekulami Eliminace potenciálních autoreaktivních resp. nefunkčních klonů lymfocytů

22 SELEKCE během b zrání lymfocytárn rních receptorů Sekvence variabilních oblastí BCR resp. TCR vznikají Aby byly z repertoáru vyloučeny případné autoreaktivní kombinace, probíhá během zrání přísná NEGATIVNÍ a POZITIVNÍ SELEKCE Většina nově vzniklých lymfocytů zaniká ještě v primárních lymfatických orgánech (jejich receptor je testován buď jako autoreaktivní nebo nefunkční)

23 Negativní a pozitivní selekce B a T lymfocytů Neváže vlastní antigeny Silná vazba s vlastním antigenem Negativní selekce Žádná vazba s vlastní MHC a antigenem Negativní selekce Slabá vazba s vlastní MHC a antigenem Pozitivní selekce Silná vazba s vlastní MHC a antigenem Negativní selekce EFEKTOROVÁ buňka APOPTÓZA Eliminace autoreaktivních klonů APOPTÓZA Eliminace nefunkčních klonů APOPTÓZA Eliminace autoreaktivních klonů

24 Probíhá u zralých B lymfocytů v periferii (lymfoidních folikulech) Preference mutantů s vysokou afinitou k antigenu

25 SOMATICKÁ MUTACE (jen u BCR) Probíhá v lymfoidních folikulech, pokud dojde ke styku zralého B lymfocytu s antigenem na povrchu folikulárních dendritických buněk. Aktivací indukovaná cytidin deamináza (AID) během transkripce úseku genů kódující variabilní část Ig řetězců Odstraňuje v transkribovaném vláknu DNA aminoskupiny Tato změna vede finálně k náhradě páru C-G za pár T-A Během tohoto mutačního procesu jsou selektovány mutanty s vysokou afinitou k danému antigenu

26 NAVÝŠENÍ VARIABILITY BCR a TCR Růst.faktory Inic.přeskupování genů Proliferace Exprese 1 řetězce receptoru Proliferace Exprese kompletního receptoru POZITIVNÍ a NEGATIVNÍ selekce Diferenciace efektorových lymfocytů Somatická Mutace (B cell) APOPTÓZA APOPTÓZA Slabá vazba s antigenem Aktivace transkripčních regulátorů IL-7 ZRALÝ lymfocyt EFEKTOROVÁ buňka HSC PRO- B/T Lymfocyt (lymfoidní Prekurzor) PRE B/T Lymfocyt 1 řetězcový receptor Přeskupování genových segmentů Spojovací variabilita Alelická exkluze Vývoj na antigenu nezávislý Primární lymfatické orgány (kostní dřeň, thymus) NEZRALÝ lymfocyt VLASTNÍ antigeny Silná vazba s antigenem CIZÍ antigeny Periferie APOPTÓZA

27 IMUNOGLOBULINY TCR ( ) CELKOVÁ DIVERZITA ~ ~ 10 18

28

29 = ajor istocompatibility omplex Skupina genů na 6. chromozomu (u člověka) Kódují membránové glykoproteiny, tzv. MHC molekuly, MHC molekuly jsou u člověka označované také jako HLA systém (= Human Leukocyte Antigens) VÝSKYT MHC rep. HLA molekuly se u člověka vyskytují na všech jaderných buňkách v těle Typy MHC molekul MHC glykoproteiny I. třídy MHC glykoproteiny II. třídy

30 AtraktivníBiologie I.Fellnerová, PřF UP Olomouc Funkce MHC molekul Vázat peptidové fragmenty proteinů Prezentovat je (vystavovat) na buněčný povrch, kde je analyzují T lymfocyty imunologický dohled MOLEKULY MOLEKULY Váží proteiny endogenní, syntetizované buňkou (normální, patologické, virové) Aktivují cytotoxické T c lymfocyty, které mají CD8 koreceptor Váží proteiny exogenní fagocytované buňkou (proteiny patogenů) Aktivuji pomocné T h lymfocyty které mají CD4 koreceptor

31 Stavba MHC molekul MHC I Transmembránový řetězec se třemi doménami ( ) a řetězec 2 mikroglobulinu MHC II Transmembránový řetězec (domény 1 2 ) a transmembránový řetězec (domény 1 2 ) 2 1 Místo pro vazbu s antigenem Každá jaderná buňka Antigen prezentující buňka

32 T lymfocyty: prezentace antigenu APC (Antigen prezentující buňka) Zprostředkování imunitní odpovědi Sekrece cytokinů Komplex MHC-antigen T cell T cell T cell T cell T cell T cell T cell ANTIGEN ZPRACOVÁNÍ antigenu PREZENTACE antigenu STIMULACE T lymfocytu PROLIFERACE T lymfocytů

33 T-lymfocyt se váže s antigenním determinantem peptidu T lymfocyt Receptor T lymfocytu Polymorfní oblast MHC molekuly PEPTID Část peptidu vážící ho se s MHC molekulou Vazebné místo pro antigenní peptid na MHC molekule MHC protein antigen prezentující buňka

34 Geny kódující MHC (HLA) glykoproteiny jsou vysoce U člověka leží na 6. chromozomu

35 Struktura lidských MHC genů MHC II lokus MHC I lokus MHC III (izotypy DP, DQ, DR) lokus (izotypy A, B, C) proteiny DP DQ DR komplementu B C A a cytokiny A 20 B 107 A 25 B 56 A 3 B Počty alelických forem na jednotlivých lokusech

36 Genes coded MHC class II molecules Genes coded complement proteins Genes coded proteasomes (proteins involved in antigen processing and presentation) Class I molecules Class I-like molecules Genes induced in response to cellular stres (heat shock proteins)

37 Identifikační kód d HLA molekul LOKUS HLA-B ALELICKÁ VARIANTA (sekvence AMK) HLA-B*1301 HLA-B*1302 HLA-B*1303 HLA-B*1304 HLA-B*1305 HLA-B*1306 PROTILÁTKA použitá pro detekci HLA-B13 Lokus HLA-B* Číslo sekvence První dvojciferné číslo udává sérologickou specificitu Více alelických variant HLA molekul může mít shodnou sérologickou specificitu

38 Extrémní polymorfismus lidských MHC genů Srpen 2000 (Nomenclature Committee for Factors of HLA system) Zdroj: CH. A. Janeway & all.: IMMUNOBIOLOGY, the immune system in health and disease 5 th eddition, 2001 Říjen 2009: Úplný seznam HLA alel HLA 1. tř. : HLA 2. tř. :

39 Jen jednovaječná dvojčata zdědí shodnou kombinaci MHC molekul MHC moleculy jsou kódovány obrovským množstvím alel Lidé se od sebe liší spektrem (kombinací) MHC proteinů Statisticky je vysoce nepravděpodobné aby dva nepříbuzní měli stejnou kombinaci MHC proteinů

40 Příbuzenské křížení značně zvyšuje podobnost jedinců v MHC molekulách vznikají tzv. Jedinci jsou považovaní za geneticky shodní u myší po 20ti generacích Využití ve výzkumné praxi jako snadno definovatelný experimentální materiál

41

42 PRAKTICKÝ VÝZNAM MHC MOLEKUL Konkrétní formy MHC molekul exprimované jedním člověkem mohou být druhým vnímány jako cizorodé proteiny antigeny proti kterým je iniciována imunitní odpověď (jsou rozpoznány T lymfocyty) DÁRCE NESHODA PŘÍJEMCE HLA-A1 HLA-A7 HLA-B12 HLA-B26 A7 B12!! B18 A39 HLA-A3 HLA-A39 HLA-B18 HLA-B26 B26 A1! A3 B26 MHC jsou zodpovědné za postransplantační reakce

43 ZÁKLADNÍ POJMY TRANSPLANTACE je přenos buněk, tkání nebo orgánů (tzv. ŠTĚP), mezi DÁRCEM a PŘÍJEMCEM AUTOLOGNÍ štěp Štěp transplantovaný z jednoho místa na jiné místo téhož jedince SYNGENNÍ štěp Štěp transplantovaný mezi geneticky identickými jedinci (jednovaječná dvojčata, imbrední linie) ALLOGENNÍ štěp Štěp transplantovaný mezi dvěma jedinci téhož druhu XENOGENNÍ štěp Štěp transplantovaný mezi dvěma jedinci různých živočišných druhů

44 MHC jako ALOANTIGENY Molekuly alogenního štěpu, které jsou příjemcem rozpoznány jako cizorodé jsou označovány jako Aloantigeny stimulují jak buněčnou, tak humorální imunitní odpověď

45 Rozpoznání cizích MHC molekul Cizorodé MHC molekuly (alogenní molekuly dárce) jsou prezentovány imunitnímu systému příjemce dvěma způsoby: PŘÍMÁ prezentace Cizorodé MHC proteiny (pocházející ze štěpu dárce) spolu s navázaným proteinem přímo stimulují T lymfocyty příjemce. Alogenní MHC molekuly dárce s navázaným peptidem napodobují (imitují) v tomto případě antigenní determinant formovaný vlastními MHC molekulami příjemce vázanými na cizorodý protein. NEPŘÍMÁ prezentace Cizorodé MHC molekuly dárce jsou fragmentovány a prezentovány antigen prezentujícími buňkami příjemce. Cizorodé MHC glykoproteiny Jsou prezentovány T lymfocytům příjemce jako běžný cizorodý protein.