Teoretický úvod: ROSTLINNÁ BARVIVA PLASTIDOVÁ VAKUOLÁRNÍ. Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Teoretický úvod: ROSTLINNÁ BARVIVA PLASTIDOVÁ VAKUOLÁRNÍ Praktikum fyziologie rostlin

2 ROSTLINNÁ BARVIVA Rostliny obsahují mnoho rzných látek schopných absorbovat záení ve viditelné oblasti spektra elektromagnetické slunení radiace. Souborn se tyto látky oznaují jako barviva i pigmenty, protože psobí zbarvení rostlin. Chemicky i funkn jsou barviva velmi rznorodá. Jejich spoleným a charakteristickým rysem je vtší poet konjugovaných dvojných vazeb v molekule. Chemicky tyto látky patí nejastji do skupiny cyklických nebo lineárních tetrapyrol, karotenoid a flavonoid, asto se vážou s proteiny, s cukry nebo s ionty kov. Dle lokalizace v buce se barviva dlí na plastidová a vakuolární. 1. Plastidová barviva se nacházejí v plastidech, v nichž se také syntetizují. Charakter tchto barviv je lipoidní (lipochromy). Extrahují se nepolárními organickými rozpouštdly (acetonem, alkoholy, éterem). Chemicky patí mezi cyklické tetrapyroly (obr.1a) a karotenoidy (obr.1b). Obr.1a Cyklické tetrapyroly Látky s porfyrinovým skeletem - absorbují pedevším záení v oblasti fialové, modré a ervené, odrážejí a propouštjí svtlo zelené a jako zelené se tedy jeví. U vyšších rostlin se vyskytují chlorofyly a, b. (Pevzato z Taiz a Zeiger 2002) Fotosyntetická funkce chlorofyl a karotenoid Chlorofyly a, b, β-karoten a xantofyly jsou absorpní složkou svtlosbrných (anténních) komplex (LHC II a I, z angl. light harvesting complex), chlorofyl a je absorpní složkou v reakních centrech fotosystému I i II. Feofytin, cyklický tetrapyrol, který nemá centrální atom Mg (Mg je nahrazen dvma atomy H), se podílí na penosu elektronu z chlorofylu a na chinony v reakním centru fotosystému II (obr. 2 a box 1). 2

3 Obr.1b Karotenoidy Absorbují v modré a fialové oblasti spektra, odrážejí a propouštjí svtlo zelené, žluté, oranžové a ervené, jeví se jako žluté až oranžové. Jsou v chromoplastech kvt a plod, v chloroplastech a etioplastech. Nejastji se vyskytují β-karotén a xantofyly. Obr. 2 Zapojení plastidových barviv v penosu elektron v primární fázi fotosyntézy (popis procesu viz. Box 1) Necyklický penos elektronu fotosyntetickým aparátem v primární fázi fotosyntézy 3

4 Cyklický penos elektronu fotosyntetickým aparátem v primární fázi fotosyntézy LHC II, I - svtlosbrné komplexy (z angl. light harvesting complex). hν - foton. P chlorofyl a v reakním centru fotosystému II, P 700 chlorofyl a v reakním centru fotosystému I. OEC - komplex rozkládající vodu a uvolující kyslík (z angl. oxygen evolving complex). Q A, Q B - chinony vázané na proteiny reakního centra fotosystému II. PQ - plastochinon (oxidovaná forma), PQH 2 - plastochinon (redukovaná forma). cyt b 6, cyt f - cytochromy b 6, f. Q p - vazebné místo pro redukovaný plastochinon, Q n - vazebné místo pro oxidovaný plastochinon, PC - plastocyanin. A 0, A 1 proteiny reakního centra fotosystému I. Fe-S - proteiny obsahující železo a síru v cytochromovém komplexu (Rieskeho protein) a ve fotosystému I. CF 0, CF 1 - peptidové složky ATP-syntázy. P evzato z Pavlová Fyziologie rostlin (2006, skriptum). Box 1. Dje primární fáze fotosyntézy (podle Pavlová 2006, Fyziologie rostlin) Energie fotonu (h) absorbovaná fotosyntetickými pigmenty fotosystému II (PS II) je penesena do reakního centra II, pedána jedné molekule chlorofylu a (P680) ze specifického páru a zpsobí její excitaci vzniká chlorofyl a*. Absorpcí energie se výrazn zmní redoxní potenciál molekuly chlorofylu a (stane se negativním, obvykle udávaná zmna je z +1,1V na 0,6V). V excitovaném stavu je jeden elektron na vnjším orbitalu vázán slab a pejde na molekulu feofytinu, která má k elektronu vyšší afinitu než excitovaná molekula chlorofylu a (chlorofyl a*). Dojde k separaci (oddlení) náboje, tj. k pedání elektronu z molekuly chlorofylu a (donoru) na molekulu feofytinu (akceptor). Molekula chlorofylu a se oxiduje na chlorofyl a +, molekula feofytinu se redukuje na feofytin -. V tchto reakcích se energie elektromagnetického záení mní na fotochemickou, dojde k uvolnní elektronu a energie se dále mní na energii chemických oxidan redukních reakcí. Tyto procesy lze schematicky znázornit následovn: (excitace) chlorofyl a + h chlorofyl a* (fotochemická reakce) chlorofyl a* + feofytin chlorofyl a + + feofytin - Tím je zahájena ada chemických reakcí redukn-oxidaního charakteru. Z feofytinu je elektron pedán na molekulu plastochinonu Q A, vázanou na protein D2, jejíž redoxní potenciál je kladnjší (mén záporný) než u feofytinu. Q A se redukuje na Q A -. Charakter interakce Q A s proteinem D2 umožuje penos pouze jednoho elektronu. Elektron je transportován dále na Q B (vázaný na D1), vzniká redukovaný semichinon Q B -. Q A pijímá od feofytinu další elektron, uvolnný z chlorofylu a, transportuje ho na Q B - a vzniká Q B 2-. K plné redukci plastochinonu jsou teba nejen dva elektrony ale také 2 protony (2H + ), které Q B 2- pijme ze strany stromatu, ímž se mní na PQH 2 (plastochinol). V redukované form je plastochinon vázán na D1 jen slab, z vazebného místa se uvolní do membrány. Vazebné místo na D1 se obsadí jednou z molekul PQ, které v nadbytku voln difundují membránou thylakoidu. PQ má k vazebnému místu silnou afinitu a molekulu PQH 2 vytsní. 4

5 PQH 2 putuje membránou thylakoidu k cytochromovému komplexu b 6 f (CK) a váže se na místo Q p. Jeden elektron pechází na Rieskeho protein, dále na cytochrom f a pohyblivý penaše plastocyanin (PC) lokalizovaný v lumenu. Druhý elektron redukuje cytochrom b l (z angl. low potential) a dále pechází na cytochrom b h (z angl. high potential). Rieskeho protein i cytochromy pijímají pouze po 1e - a 2H +, které plastochinon pijal ze stromatu pi redukci na D1 se uvolní do lumenu. Elektron, který byl penesen na cytochrom b h redukuje molekulu PQ, která se navázala na vazebné místo Q n. Vzniká semichinon PQ -, elektron z dalšího PQH 2 redukuje semichinon na PQ 2-. Dva potebné protony PQ 2- pijme plastochinon ze stromatu a vzniká PQH 2. Tato molekula se uvolní a vazebné místo Q n obsadí jiná molekula PQ. Uvolnná molekula pln redukovaného plastochinonu PQH 2 se naváže na vazebné místo Q p a celý proces se opakuje, protony jsou opt uvolnny do lumenu. Tak každý elektron, který byl z PQH 2 pedán cytochromu b l, penese ze stromatu do lumenu ješt jeden H +. Tato cesta elektronu pes cytochromy b na PQ vázaný v Q n a pemístní PQH 2 na vazebné místo Q p se nazývá cyklus Q (Q cyklus). Plastocyanin je donorem elektronu pro fotosystém I a zprostedkovává penos elektronu z cytochromového komplexu na PS I. Podobn jako ve fotosystému II, energie absorbovaná pigmenty v LHCI je penesena do reakního centra fotosystému I, zpsobí excitaci jedné molekuly chlorofylu a ze specifického páru (P700). Uvolní se elektron, který pejde na první akceptor v RCI akceptorovou molekulu chlorofylu a, znaenou A 0. Oxidovaná molekula chlorofylu a pijme elektron z plastocyaninu a vrátí se do základního stavu. Redukovaný akceptorový chlorofyl a A - 0 pedá elektron dalšímu penašei v RCI akceptoru A 1 (fylochinon, vitamin K1). etz oxidoredukních reakcí v RC I pokrauje penesením elektronu na protein se strukturou Fe-S. Pi tomto transportu se elektron v membrán pesune z oblasti bližší lumenu do oblasti piléhající ke stromatu. Z centra Fe-S pejde elektron na molekulu ferredoxinu, která se v redukovaném stavu uvolní do stromatu. Redukovaný ferredoxin je silné redukní agens, které ve stromatu redukuje adu dalších látek. Jednou z nejdležitjších je NADP +, redukcí vzniká NADPH + H +. Reakce je katalyzována ferredoxin-nadp + reduktázou (NFR). Pro redukci NADP + je teba dvou elektron. Redukovaný kofaktor NADPH hraje nesmírn dležitou roli v sekundární fázi fotosyntézy, zprostedkuje uložení energie do relativn stálých chemických vazeb sacharid a mastných kyselin. Vzniká pouze pi necyklickém penosu elektronu. Redukovaný ferredoxin poskytuje elektrony také pro redukci nitritového aniontu (NO - 2 ) na kation amonný a pro redukci iontu síranového (SO 2-4 ). Dalším reakním partnerem redukovaného ferredoxinu je thioredoxin, který hraje dležitou roli v aktivaci enzym Calvinova cyklu a inaktivuje enzym, který katalyzuje úvodní reakci cyklu pentózového. Také tyto procesy jsou spojeny pouze s necyklickým penosem elektronu. Pi necyklickém penosu elektronu stejn jako pi cyklickém penosu elektronu plastochinon penáší protony ze strany stromatu do lumenu. Oxidovaná molekula chlorofylu a (P 680) v RC II dopluje elektron z vody, k jejímuž rozkladu dochází v proteinovém komplexu (OEC). Tento komplex je asociován s RCII na stran lumenu. Pi rozkladu vody zstávají protony také v lumenu. Protože membrána thylakoidu je pro protony nepropustná, vzniká pi rozkladu vody a penosem proton plastochinonem rozdíl v koncentraci proton na opaných stranách membrány thylakoidu, tzv. protonový gradient. Rozdíl v koncentraci proton znamená také rozdíl v ph (ph). Na svtle je ph stromatu kolem 8, v lumenu až 5. Proton nese kladný náboj, vzniká tedy i rozdíl náboje ( ). Snaha po vyrovnání rozdílu koncentrací H + a rozdílu ph psobí potenciální protonmotorickou sílu, pmf ( H+ ), která je využita k syntéze ATP z ADP a anorganického fosfátu (Pi). pmf = H+ = ph + J.V -1. mol -1 Syntéza ATP z ADP a anorganického fosfátu (Pi) v chloroplastech se nazývá fotofosforylace a je katalyzována chloroplastovou ATP-syntázou (AS). 5

6 1.2. Ochranná funkce karotenoid Molekuly karotenoid vázané na vnitní obalovou membránu chloroplastu a na membrány thylakoid chrání fotosyntetický aparát ped poškozením (nap. fotooxidací) v situaci, kdy jsou hladiny ozáenosti tak vysoké, že absorbovaná energie nemže být pro nedostatenou funkní kapacitu fotosyntetického aparátu využita k tvorb ATP a redukovaných forem redukních agens (feredoxinu a NADPH). V tchto situacích probíhá deepoxidace violaxantinu na anteraxantin a zeaxantin - xantofylový cyklus (obr. 3). Tato ochrana je obzvláš v období deetiolace. dležitá Pi vysoké ozáenosti se výrazn hladina zvyšuje zeaxantinu, který má schopnost uvolovat absorbovanou (disipovat) energii ve form tepla. Zeaxantin vzniká z violaxantinu, který se nejprve deepoxiduje na anteraxantin, další deepoxidací se tvoí Obr. 3 Xantofylový cyklus (podle Pavlová 2006, skriptum) zeaxantin. Deepoxidace probíhá na lumenální stran membrány thylakoidu, reakce jsou katalyzovány deepoxidázami. Deepoxidázy jsou za neutrálního ph ve tm v lumenu mobilní, na svtle ph klesá, enzymy jsou aktivovány vysokou koncentrací proton, pipojují se k membrán thylakoidu a získávají pístup k substrátu. Kyslík, který se pi deepoxydaci uvoluje, tvoí vodu. Donorem vodíku je kyselina askorbová. Ve tm nebo po snížení ozáenosti na vyhovující úrove se hladina zeaxantinu snižuje. Epoxidaní reakce, které vedou ke vzniku violaxantinu, probíhají na stromatální stran membrány tylakoidu, jsou katalyzovány jinými enzymy, kofaktorem reakce je NADPH. 6

7 2. Vakuolární barviva - hydrochromy Jsou syntetizována v cytoplazm a lokalizována ve vakuolách. Jsou to barviva kvt a plod, jsou však obsažena i ve stoncích a listech. Vyskytují se pedevším v povrchových vrstvách pletiv. Chemicky se jedná o flavonoidy - antokyany, flavonoly a flavony (obr.4). Antokyany jsou ervené a modré, flavony a flavonoly jsou blavé, žluté nebo nažloutlé. Flavonoidy absorbují pedevším ultrafialové záení, nkteré z nich absorbují i záení ve viditelné oblasti spektra (antokyany). Jejich funkce spoívá v ochran ped UV-záením. Souasn hrají uritou roli i v sexuální reprodukní strategii (iní kvty nápadnými a lákají hmyzí opylovae viz. obr.5). Tvorba antokyan je ovlivována více faktory, nap. svtlem a je zvýšena pi deficienci N, P a S a jiných stresových stavech. Obr. 5 Kvt Rudbeckia z pohledu lovka a vely. (Pevzato z Taiz a Zeiger Plant Physiology ) Obr. 4 Flavonoidy Literatura: Buchanan, B., Gruissem, W. and Jones, R. (Eds.) - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologist Pavlová L. Fyziologie rostlin (skriptum). Karolinum Taiz, L. and Zeiger, E. Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publichers

8 Zadání praktických úloh k tématu: ROSTLINNÁ BARVIVA Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Plastidová barviva 1a) Extrahujte plastidová barviva z list beanu 1b) Ovte schopnost extrahovaných pigment absorbovat svtlo, uvolovat elektron, pedávat ho akceptoru a pijímat elektron od donoru. Úkol 2: Vakuolární barviva 2a) V pipraveném extraktu rozdlte flavonoidy papírovou chromatografií a s pomocí piložené tabulky je zkuste zaadit do nkteré ze základních typ flavonoid. 8

9 Úkol. 1: Plastidová barviva Cíl: Demonstrovat pítomnost plastidových barviv a jejich význam v penosu elektron. Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Barviva je možné extrahovat, izolovat a zmit jejich absorpní spektra. V pítomnosti vhodného donoru a akceptoru elektron lze ovit jejich schopnost pedávat elektrony v závislosti na svtelné energii. Dílí úlohy: 1a) Extrahujte plastidová barviva z list beanu. 1b) Ovte schopnost extrahovaných pigment absorbovat svtlo, uvolovat elektron, pedávat ho akceptoru a pijímat elektron od donoru. Úkol 1a) Extrahujte plastidová barviva z list beanu Extrahovaná barviva rozdlte chromatografií na tenké silikagelové vrstv (Silufol, TLC). Zjistte Rf (retenní faktor) jednotlivých zón. Zmte absorpní spektra látek v jednotlivých zónách ve viditelné oblasti záení. Princip: Chlorofyly i karotenoidy se z rostlinného materiálu extrahují organickými rozpouštdly. Sms tchto látek lze na vhodném nosii ve vhodné vyvíjecí chromatografické smsi rozdlit. Chromatografie je metoda dlení smsí. Sms látek nanesená na stacionární fázi (papír, tenkou vrstvu silikagelu) je vymývána mobilní fází (vyvíjecí smsí). Jednotlivé látky postupují ve smru pohybu mobilní fáze rznou rychlostí (podle své rozpustnosti v mobilní fázi), oddlují se a vytváejí charakteristické zóny. Pozice jednotlivých zón na chromatogramu se udává jako Rf (retenní faktor). Za uritých podmínek, daných mimo jiné chromatografickým nosiem a vyvíjecí smsí, je Rf pro danou látku hodnota charakteristická. Jednotlivé látky lze z chromatogramu eluovat (vymýt) organickým rozpouštdlem. 9

10 Laboratorní postup: Poteby pro pípravu extraktu: listy beanu aceton tecí miska písek CaCO3 odmrný válec filtraní nálevka (frita) kádinka na filtrát vývva Píprava extraktu: v této fázi musí být veškeré používané sklo naprosto suché!!! Asi 8 list beanu nastihejte co nejjemnji do tecí misky, pidejte trochu písku a na špiku nože CaCO 3 pro neutralizaci prostedí (nízké ph mže barviva pi extrakci poškodit), pidejte asi 5 ml acetonu a rozetete. Po dkladné homogenizaci pidejte ješt asi 15 ml acetonu a homogenát pefiltrujte za sníženého tlaku pes fritu do suché kádinky (použijte vývvu). Schéma pípravy extraktu je na obr.. 1. Poteby pro úkol 1a: chromatografická komora baka na pípravu chromatografické smsi odmrné nádobí (válec, pipeta a mikropipeta) chromatografická deska Silufol obyejná tužka kapilára na nanášení chromatogramu benzin izopropanol dest. voda mítko nžky spektrofotometr s možností mit absorpci látek pi plynule se mnící vlnové délce Provedení úkolu 1a: 1. Ve vzdálenosti asi 2 cm od svislých okraj chromatografické desky vyryjte rýhu asi 1 mm širokou pevným pedmtem tak, abyste chromatografickou vrstvu silikagelu porušili a odstranili ji až na nosnou hliníkovou vrstvu. Omezíte tím okrajové nepravidelnosti chromatogramu. 2. Asi 2 cm od dolního okraje obyejnou tužkou jemn naznate linii startu, nesmíte však narušit kontinuitu chromatografické silikagelové vrstvy. Na tuto linii kapilárou naneste 10

11 asi 6 až 8 vrstev extraktu. Mezi nanášením jednotlivých vrstev nechte chromatogram zaschnout. 3. Píprava vyvíjecí smsi : V bace smíchejte: 50 ml benzinu + 5 ml izopropanolu + 0,125 ml dest. H 2 O (dávkujte mikropipetou). 4. Pipravenou chromatografickou sms vlijte na dno chromatografické komory, desku postavte do komory co nejsvisleji - opete ji o stnu komory zadní, t.j. hliníkovou stranou - a komoru uzavete. Pibližn za min. dostoupí vyvíjecí sms - elo chromatogramu - asi 2 cm od horního okraje desky. 5. V tomto stadiu desku vyjmte, tužkou oznate elo chromatogramu a stanovte Rf jednotlivých barevných zón, t.j. pomr vzdáleností, které urazily jednotlivé zóny k celkové délce chromatogramu (vzdálenost start - elo). Rf = vzdálenost start - zóna vzdálenost start - elo 6. Jednotlivé zóny vystihnte, rozstíhejte na malé kousky a v oznaených zkumavkách barviva eluujte 2 ml acetonu. Promte absorpní spektra extrahovaných barviv na spektrofotometru Helios γ ve viditelné oblasti. Do protokolu zapište, v kterých oblastech viditelného záení jednotlivá barviva absorbují (použijte tab. 1). Tabulka 1 vlnová délka (rozsah v nm) oblast (barva) UV-A fialová modrá zelená žlutá oranžová ervená 740 a více infraervená 11

12 Obr. 1: Schéma pípravy a zpracování extraktu 12

13 Úkol 1b: Ovte schopnost extrahovaných pigment absorbovat svtlo, uvolovat elektron, pedávat ho akceptoru a pijímat elektron od donoru. Princip: Charakteristickou vlastností chlorofyl je schopnost absorbovat energii fotonu a uvolnit elektron. Systém, v nmž bychom mohli pozorovat tento jev, musí obsahovat vedle chlorofylu, který uvoluje a pijímá elektron, akceptor elektronu, který pijme elektron uvolnný z chlorofylu, a donor elektronu, který poskytne chlorofylu chybjící elektron. V našem experimentu bude donorem kyselina askorbová, akceptorem metylerve, která pi zmn redox stavu mní barvu (v redukované form je žlutá). Laboratorní postup: Poteby pro úkol 1b: 5 zkumavek ve stojánku pipety (2x 5 ml, 1x 1ml) lžika kyselina askorbová aceton lampa alobal na zatemnní jedné z kontrolních variant 0,04% metylerve v etanolu Provedení úkolu 1b: 1. Do zkumavek napipetujte dle tabulky 2. Zkumavku.5 zatemnte (obalte alobalem). 2. Do všech zkumavek pidejte kyselinu askorbovou (jako substanci) v takovém množství, aby byl roztok nasycen (na dn zkumavky bude zstávat nerozpuštná látka). 3. Zkumavky.1-4 vystavte svtlu lampy (schéma obr.. 1). Pozorujte, za jak dlouho dojde v jednotlivých zkumavkách ke zmn barvy z ervenohndé na zelenou (odbarvení metylerven). as zaznamenejte. Tabulka 2. zkumavky acetonový extrakt (ml) aceton (ml) metylerve (ml) 1 5, ,5 2, ,0 4, , ,

14 Úkol. 2: Vakuolární barviva Otázka: Jaká vakuolární barviva jsou pítomná v extraktu kvt? Hypotéza, kterou v prbhu práce ovíme: Zastoupení vakuolárních barviv s rznými absorpními spektry koresponduje s barvou kvtu. Dílí úloha: 2a) V pipraveném extraktu rozdlte flavonoidy papírovou chromatografií a s pomocí piložené tabulky je zkuste zaadit do nkteré ze základních typ flavonoid. Poteby: extrakt - dostanete pipravený od vedoucího praktika (rozdrcené kvty (Corydalis, Pelargonia, Salvia) se pes noc vyluhují v 0,2M HCl, výluh se zfiltruje) chromatografický papír Whatman III obyejná tužka nžky kruhová chromatografická komora s nádobkou na vyvíjecí sms n-butanol 2M HCl 2 odmrné válce (50 ml) dlicí nálevka UV-lampa Provedení úkolu 2a: 1. Na 1/3 linie startu na chromatografickém papíru naneste kapilárou alespo 6 vrstev (asi 0,2 ml) pedem pipraveného extraktu. Mezi nanášením jednotlivých vrstev použijte k sušení fén. Schéma papírové chromatografie je na obr Pipravte vyvíjejí sms: 30 ml n-butanolu a 30 ml 2M HCl protepte v dlicí nálevce a vykejte oddlení fází. Spodní vrstvu (HCl nasycená butanolem) vypuste a vylijte do nádob na odpad. Vrchní fázi (butanol nasycený HCl) pevedete do nádobky pro vyvíjecí sms v chromatografické komoe. 3. Z proužku papíru stoíte knot, který prostríte otvorem ve stedu chromatogramu a jeho spodní ást umístte do misky s vyvíjecí smsí a komoru uzavete. Až elo chromatogramu bude asi 1 cm od okraje komory, chromatografii ukonete a obyejnou tužkou oznate elo. 14

15 4. Chromatogram usušte v digestoi a oznate polohu viditelných barevných skvrn. Pak prohlédnte chromatogram ve svtle UV-lampy, zóny oznate. Vypotte Rf jednotlivých zón a pokuste se látky zaadit k jednotlivým typm s pomocí tabulky Do protokolu zaznamenejte poet a charakteristiky jednotlivých flavonoid. Tabulka 3 zbarvení zóny typ flavonoidu svtlo UV-záení maximum absorpce (nm) antokyany flavony ervené, ržové modré bezbarvé šedé, svtle fialové ervené šedé, šedomodré jasn modré flavonoly žluté, oranžové žluté Obr. 2: Schéma papírové chromatografie 15

16 Vyhodnocení experiment: Vypracujte protokoly, ve kterých zdokumentujete a vyhodnotíte získaná experimentální data. Zamyslete se nad jejich významem, pomoci Vám mohou následující otázky. Otázky : Podailo se ovit hypotézy formulované na poátku experiment? Ve kterých oblastech viditelného záení mají absorpní maxima karotenoidy a cyklické tetrapyroly (chlorofyly a feofytin)? Které faktory jsou nezbytné pro penos elektronu v extraktu? Jaká vakuolární barviva se podailo izolovat v extraktu kvt? Korespondují s barvou kvtu? 16