KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

Transkript

1 KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE Northern bloty pracné a zdlouhavé Genové čipy nákladné; Semikvantitativní RT-PCR qpcr nepřesné metodiky real-time PCR vysoké dynamické rozpětí 1

2 problém: precizní kvantifikace mrna spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými fragmenty. nebo relativní stanovení pomocí qpcr control expt NORTHERN BLOT cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5 2

3 aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mrna nebo mikrorna mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami 3

4 princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot 4

5 chemismus 2) hybridizační sondy (TAGman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5-3 exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer srovnání TagMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká 5

6 kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsdna s inkorporovaným deoxyuracilem (dutp) termolabilní, 0% aktivita nad 55 C nereaguje s templátem (dttp) dutp v qpcr mixu místo dttp pracuje během nastavení PCR reakce pg2 chyby v pipetování templát (cdna) premix (primery, y,p proba,,polymerasa, dntp,,p pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX (Karboxy-X-Rhodamin) fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1) pufr, Mg 2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery 2) vzorek (cdna, genomická DNA) 6

7 Snímek 12 pg2 hořčík vyšší davky pro Tagman kvuli 5-3- exonucleasove aktivite galuszka; 22/02/2010

8 CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 AMOUNT OF DNA A A AMOUNT OF DNA lineární vynesení PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení PCR CYCLE NUMBER lineární ~20 do ~1500 7

9 C T hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky C T počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu) před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku threshold templát: 10x ředění buď přímo cdna, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme C T koncentrace templátu 8

10 PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995) Eff=10 (-1/slope) 1 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY , ,048 1, ,096 2,213 1, ,192 4,205 2, ,384 7,990 3,748 1, ,768 15,181 6,747 2, ,536 28,844 12,144 4, ,072 54,804 21,859 8, , ,127 39,346 14, , ,842 70,824 23, ,048, , ,482 40, ,097, , ,468 69, ,194,304 1,356, , , ,388,608 2,578, , , ,777, ,898, ,338, , ,554,432 9,307,650 2,408, , ,108,864 17,684,534 4,335, , ,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667, ,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835, ,870, ,298,220 25,287,311 4,819, ,073,741, ,466,618 45,517,160 8,193,466 MOUNT OF DNA AM %EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x 10,000,000,000 1,000,000, ,000,000 10,000,000 1,000, ,000 10,000 1, % EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% ± 3% 9

11 tolerance efektivity Chemismus SybrGreen Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota 10

12 REFERENČNÍ GEN musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1 TaqMan Human Endogenous Control Plate ΔC T 11

13 ΔC T = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cdna 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mrna byly popsány výkyvy mezi množstvím rrna a mrna nelze použít pokud se vychází z mrna vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mrna) přepis do cdna navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení č standardních d křivek k pro oba geny a stanovení efektivity it GAPDH GOI GAPDH GOI GAPDH GOI 12

14 vyhodnocení kalibrátor sample A kalibrátor sample B sample A sample B GAPDH GOI 1 vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda delta delta cé té 1. určíme C T pro všechny křivky 2. určíme C T GOI -C TGAPDH pro kalibrátor ΔC T kalibrátor 3. určíme C T GOI -C TGAPDH pro sample 1 ΔC T sample 1 4. ΔC Tsample 1 - ΔC Tkalibrátor ΔΔC T výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 -ΔΔCT 13

15 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích 14

16 příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cdna a provedeno qpcr s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cdna kalibrator C T 22,48 cdna silencing C T 22,3 GAPDH Eff 77% cdna kalibrator C T 20,05 cdna silencing C T 16,97 -ΔΔCT pkg2 cdna 2 kalibrator 2 (5,33-2,43) (1+0,86) 0,18 /(1+0,77) 3,08 1,1x10 4 kopií DNA 123 1,23x kopií cdna silencing GAPDH cdna kalibrator cdna silencing 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x 1,55x10 4 kopií 8,92x10 4 kopií pg1 navrhování primerů velikost amplikonu bp délka primerů ů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery) 15

17 Snímek 30 pg1 > An ideal primer has a stable 5'end and an unstable 3' end. If the > primer has a stable 3' end, it will bond to a site which is > complementary to it other than the target with its 5' end hanging off > the edge...[nice terminology BTW]...Stability of the 5' termini allows for efficient bonding of the > primer to the target site. This stable 5' region is called the GC > Clamp. It ensures adequate binding of the primer to the template... > Notice that the 3' end should not be very stable and the 5' end should > have a strong GC clamp. galuszka; 22/02/2010

18 délka proby navrhování proby bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C o 10 C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5 konci zháší fluorescenci FAM barvy 16

19 navrhování primerů a proby kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon 17

20 minor groove binding MGB PROBY stabilizuje vazbu proby na ssdna výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm 18

21 MGB PROBY využití pro alelické diskriminace kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 3X 6X 19

22 kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 27X instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System 20

23 halogenová lampa emisní filtry zesilovač ccd kamera excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku instrumentace 21

24 HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett (±0.02 C) 02 C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus) 22

25 HRM ANALYSA pro amplikony do 200bp 23