Základy praktické Bioinformatiky

Transkript

1 Základy praktické Bioinformatiky PETRA MATOUŠKOVÁ 2018/2019 8/10

2 Základy praktické bioinformatiky Téma 8/10 Nukleotidová bioinformatika IV Cíle: Student bude schopen navrhnout primery pro kvantitativní stanovení vybraného genu (qpcr) a zkontrolovat zda primery uvedené v publikacích jsou v dostatečné kvalitě.

3 Bioinformatika nukleových kyselin IV Vyhledávání NK sekvencí Analýza vlastností sekvencí-složení, reverse complement, identifikace restrikčních míst Práce s kódující DNA=práce s proteiny / překlad DNA sekvence-otvírání čtecího rámce Klonování, návrh primerů pro PCR, mutační primery, rt-pcr, kontrola primerů Předpověď sekundárních struktur Porovnávání sekvencí, identifikace neznámé sekvence Vyhledání SNPs čtení sekvenačních dat a spojování fragmentů Vyhledávání hladin expresí jednotlivých genů mikrorna Celé genomy.

4 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) SYBR Green I (wiki)

5 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr)

6 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou (sekundární struktura) mfold-predikce sekundárních struktur DNA

7 Návrh primerů-predikce sekundárních struktur mfold: nastavit 60 C (Někdy lze vkládat jen 800nt)

8 Návrh primerů-predikce sekundárních struktur mfold: nastavit 60 C

9 Návrh primerů-predikce sekundárních struktur mfold: nastavit 60 C Pro NQO1: Případně: až 1440

10 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou (sekundární struktura) mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti

11

12 Vyzkoušejte si. -Vložit vaši sekvenci (CDS nebo jen část 800nt) do mfold a podívat se po vhodných oblastech pro návrh qpcr primerů

13 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast

14 Návrh primerů-predikce sekundárních struktur mfold: nastavit 60 C Pro NQO1: Případně: až 1440

15 Návrh primerů-primer3-na vybranou oblast =

16 Návrh primerů-primer3-na vybranou oblast Jiná nebo Větší oblast: 1080,340

17 Návrh primerů-primer3-na vybranou oblast left Jiná nebo Větší oblast: 1080,340 right

18 Vyzkoušejte si. Vložit vaši sekvenci do mfold a podívat se po vhodných oblastech pro návrh qpcr primerů Najít primery v těchto vhodných oblastech

19 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

20 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! right krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

21 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA left výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

22 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

23 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt left ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

24 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! < krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA > výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

25 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! < krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA > výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

26 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! < krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA > left výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

27 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt < ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA > výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > (Alt gr < Alt gr > )

28 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) > <

29 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > Někdy možné navrhnout primery kolem požadované oblasti [ ] (Alt gr < Alt gr > ) (Alt gr f Alt gr g )

30 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy možné navrhnout primery kolem požadované oblasti [ ] (Alt gr f Alt gr g )

31 Vhodná oblast:1080,340 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) left Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt [ ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA ] výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast right Někdy možné navrhnout primery kolem požadované oblasti [ ] (Alt gr f Alt gr g )

32 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) ] [ Nutné vhodně zvolit délku produktu

33 Vyzkoušejte si. Vložit vaši sekvenci do mfold a podívat se po vhodných oblastech pro návrh qpcr primerů Najít primery v těchto vhodných oblastech když to nejde < >,[ ]

34 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Primery: nezáleží kde v rámci sekvence leží! krátký amplikon =délka sekvence mezi primery (včetně):50-150nt ale: musí fungovat perfektně vyhnout se místům s vlásenkou mfold-predikce sekundárních struktur DNA výběr vhodné oblasti Primer3-omezit na vybranou oblast Někdy nutné maskování oblastí vlásenek: < > Někdy možné navrhnout primery kolem požadované oblasti [ ] Primer BLAST-kontrola specificity (Alt gr < Alt gr > ) (Alt gr f Alt gr g )

35 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Kontrola specifity: NCBI/Pick Primers (Primer BLAST)

36 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Kontrola specifity: NCBI/Pick Primers (Primer BLAST) Zkopírovat nalezené primery

39 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Kontrola specifity: NCBI/Pick Primers (Primer BLAST) ok Zkopírovat nalezené primery ok

40 Návrh primerů: kvantitativní (q)pcr (rt-pcr) Kontrola specifity: NCBI/Pick Primers (Primer BLAST) Dlouhý vedlejší produkt nevadí

41 Vyzkoušejte si. Vložit vaši sekvenci do mfold a podívat se po vhodných oblastech pro návrh qpcr primerů Najít primery v těchto vhodných oblastech Zkontrolujte specifitu nalezených primerů

42 Ověření qpcr primerů Funkce: cdna (+NTC)

43 Ověření qpcr primerů x Více produktů v jedné reakci různé produkty stanovené různými primery

44 Ct Ověření qpcr primerů Funkce: cdna (+NTC) 35,000 BRIX1-I Účinnost: ředící řada cdna 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 y = -3,3604x + 37,203 R² = 0,9994 5,000 0, Log quantity E=10 -(1/slope) -1 E=10 -(1/-3,3604) -1=0,98 98% (90-110%)

45 Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery.

48 Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery. NCBI:

49 Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery. Mutalin: (r-primer nutné obrátit (reverse complement)

50 mfold Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery.

52 Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery. X

53 Primery z publikací..? Kontrola primerů z publikací 1) Vyhledat sekvenci NCBI..(nebo přímo z článku) 2) Zkontrolovat pozice, délku amplikonu, kvalitu, specifitu Multalin, Primer3, mfold.. 3) navrhnout nové primery. X navrhnout nové primery.

54 DÚ8 1) Navrhněte primery programem Primer3 na váš gen, tak aby nebyly ve vlásenkových oblastech (specifické být nutně nemusí) 2) Zkontrolujte primery pro GAPDH z publikace: Multalin, Primer3, mfold, specifita? (sekvence k dispozici v článku v Supporting information

55 DÚ8-řešení