UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE. Diplomová práce

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a toxikologie STANOVENÍ PLAZMATICKÉ VAZEBNOSTI NOVĚ VYVÍJENÝCH RADIODIAGNOSTIK ALZHEIMEROVY NEMOCI Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Prof. PharmDr. Ing. Milan Lázníček CSc Lucie Hyršová

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu

3 Velice děkuji především Prof. PharmDr. Ing. Milanu Lázníčkovi CSc. za odborné vedení, za jeho ochotu poradit mi při řešení jednotlivých úkolů, jakož i vzniklých problémů. Moje vřelé díky náleží i Doc. Ing. Alici Lázníčkové CSc. za označení látek 5C-2-BOC a 5C-5-BOC 99m Tc i užitečné rady při stanovování radiochemické čistoty. Jsem vděčná i všem ostatním pracovníkům z katedry Farmakologie a toxikologie za jejich vstřícnou pomoc.

4 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a toxikologie Studentka: Lucie Hyršová Školitel: Prof. PharmDr. Ing. Milan Lázníček CSc. Název diplomové práce: Stanovení plazmatické vazebnosti nově vyvíjených radiodiagnostik Alzheimerovy nemoci Abstrakt: Stanovení vazebnosti na bílkoviny krevní plazmy u nově zkoumaných léčiv patří mezi základní parametry, které se provádějí již v raných stádiích klinického testování. Vazebnost léčiv totiž ovlivňuje veškeré farmakokinetické parametry a samozřejmě má vliv i na farmakodynamiku. V této práci je zkoumána vazebnost látek 99m Tc-5C-2-BOC a 99m Tc-5C-5-BOC, které patří mezi potenciální radiodiagnostika Alzheimerovy nemoci. Testována je krevní plazma čtyř živočišných druhů (jmenovitě lidská, králičí, hovězí a potkaní plazma) a je provedeno jejich vzájemné porovnání. Vazebnost byla v obou případech stanovována pomocí dvou metod rovnovážné dialýzy a ultrafiltrace. S využitím metody rovnovážné dialýzy byla určena nejnižší vazebnost obou látek v lidské a hovězí plazmě. Vazebnost 99m Tc-5C-2-BOC stanovená metodou ultrafiltrace je nejnižší v hovězí plazmě a jenom o málo vyšší v lidské, vazebnost látky 99m Tc-5C-5-BOC je nejnižší v lidské plazmě. Z dosažených výsledků vyplývá, že vazebnost studovaných látek na plazmatické bílkoviny nebude výrazně ovlivňovat jejich farmakokinetické chování. Klíčová slova: Vazebnost léčiv na bílkoviny, rovnovážná dialýza, ultrafiltrace, mezidruhové srovnání, Alzheimerova nemoc.

5 CHARLES UNIVERSITY IN PRAGUE Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Lucie Hyršová Supervisor: Prof. PharmDr. Ing. Milan Lázníček CSc. Title of thesis: Determination of plasma protein binding of new radiopharmaceuticals for Alzheimer`s disease imaging Summary: Determination of plasma protein binding of new potential drugs belongs to basic parameters which are made at early stages of clinical trials. The drug-protein binding affects all the pharmacokinetic factors and it influences pharmacodynamics as well. The aim of this thesis is to examine binding of 99m Tc-5C-2-BOC and 99m Tc-5C-5-BOC which are potential radiodiagnostics of Alzheimer`s disease, is investigated in this work. Blood plasma of four species (namely human, rabbit, bovine and sewer rat`s plasma) is tested and findings are mutually compared. The binding in both cases is determined by means of two methods equilibrium dialysis and ultrafiltration. The binding of both substances is the lowest in human and bovine plasma with the use of equilibrium dialysis. The binding of 99m Tc-5C-2-BOC determined by ultrafiltration is the lowest in bovine plasma and a slightly higher in human one, the binding of 99m Tc-5C-5-BOC is the lowest in human plasma. These findings show that binding on plasma proteins will not have a significant impact on pharmacokinetic properties. Keywords: Drug-protein binding, equilibrium dialysis, interspecies comparison, Alzheimer`s disease.

6 1. Seznam zkratek Úvod Teoretická část Význam vazebnosti léčiv na bílkoviny krevní plazmy Distribuce a délka účinku Eliminace z organismu Interakce léčiv Dávkování léčiv Farmakodynamika Teoretický popis vazby mezi léčivem a bílkovinou Povaha chemických vazeb mezi proteinem a léčivem Van der Waalsovy vazby Hydrofobní vazby Vodíkové vazby Iontová vazba Plazmatické bílkoviny uplatňující se při vazbě léčiv Albumin α1-kyselý glykoprotein Lipoproteiny Haptoglobin Transferin Ceruloplazmin Thyroxine-binding globuline (TBG) Jednotlivé metody určování vazebnosti léčiv Separativní metody Neseparativní metody Radiochemická čistota m Technecium Alzheimerova nemoc Definice Epidemiologie, etiopatogeneze Klinický obraz Diagnostika... 44

7 3.8.5 Léčba Cíl práce Experimentální část Pomůcky a chemické látky Testované látky Vzorky krevní plazmy Chemikálie Použité pracovní pomůcky Zařízení a přístroje Pracovní postup Příprava krevní plazmy Rovnovážná dialýza Ultrafiltrace Radiochemická čistota Výsledky m Tc-5C-2-BOC m Tc -5C-5-BOC Radiochemická čistota Diskuze Závěr Použité zdroje Literatura Obrázky a tabulky... 82

8 1 1. Seznam zkratek ACH acetylcholin ACHE ACHEi AN ApoE BCHE CD CMP GF HPAC KE KE/FA KCH KT L LDL-R LR MA P PL PPR R acetylcholinesteráza inhibitor acetylcholinesterázy Alzheimerova nemoc apolipoprotein E butyrylcholinesteráza cirkulární dichroismus counts per minute gelová filtrace vysokoúčinná afinitní chromatografie kapilární elektroforéza kapilární elektroforéza/frontální analýza kapalinová chromatografie kalorimetrické techniky léčivo receptor pro LDL komplex léčivo-receptor vazba na mikrosféry albuminu protein komplex protein-léčivo zkoušky založené na povrchové plazmonové rezonanci receptor

9 2 RD ST TBG UC UM UF rovnovážná dialýza spektroskopické techniky thyroxine-binding globulin ultracentrifugace zkouška s paralelní umělou membránou ultrafiltrace

10 3 2. Úvod Úvodem bych ráda zdůraznila důležitost vazby léčivých látek na plazmatické bílkoviny. Vazba léčiv na plazmatické proteiny totiž ovlivňuje jak nástup a dobu účinku, biotransformaci tak i vylučování léčiv z těla tedy celou farmakokinetiku. Je však nutné vzít v úvahu četné aspekty, abychom mohli plně charakterizovat vliv vazby léčiva na proteiny na jeho farmakokinetiku a následně i farmakodynamiku. Vzhledem k rozsahu vlivu této vazby by se měření týkající se vazebnosti potenciálního léčiva měla provádět na počátku každé klinické studie. [23, 29] Znalost vazebnosti léčiv na bílkoviny krevní plazmy umožňuje farmaceutům předvídat některé lékové interakce, tím i možná rizika při použití nevhodné kombinace léčiv a přispět tak k větší bezpečnosti terapie. [19] V krevní plazmě se nachází velké množství různých bílkovin, avšak dvě bílkoviny jsou zde zastoupeny v relativně velké míře a váže se na ně řada léčiv. Jedná se v první řadě o albumin a o α 1 -kyselý glykoprotein. Ostatní proteiny se na vazbě léčiv podílejí podstatně menší měrou. [29] Existuje velké množství metod, pomocí kterých můžeme určovat stupeň vazebnosti léčiv. Lze je rozdělit do dvou skupin na postupy separativní a neseparativní. Za tradiční metodu při zkoumání vazebnosti se považuje rovnovážná dialýza, ale i ona má své nevýhody. Proto byly vyvinuty další metody, abychom se vyhnuli nedostatkům rovnovážné dialýzy. [29] Alzheimerova choroba patří mezi degenerativní mozková onemocnění. V poslední době byl zaznamenán prudký nárůst hospitalizací pro Alzheimerovu nemoc (o více než 20 %), vzrůstá ale i počet hospitalizací pro jiné druhy demencí. Alzheimerovu nemoc nelze kauzálně léčit, dají se pouze oddálit její příznaky, i když pouze po omezeně dlouhou dobu. [28] Diagnostika demencí je velmi obtížná a to platí zejména pro časné fáze nemoci, blízcí příbuzní i lékaři často první příznaky rozvíjejícího se onemocnění přisuzují fyziologickému procesu stárnutí. Přitom včasnou diagnostikou lze degenerativní proces do jisté míry zpomalit a tak prodloužit zatím ještě relativně dobrou kvalitu života pacientů. Zobrazení mozku s využitím radioaktivně značených indikátorů představuje

11 4 neinvazivní a citlivé metody, lze takto sledovat charakteristické změny v metabolismu mozku nemocného a také změny ve vazbách ligandů na receptory. Za naprosto nezbytné jsou v tomto ohledu považovány dvě metody a to PET a SPECT. [26]

12 5 3. Teoretická část 3.1 Význam vazebnosti léčiv na bílkoviny krevní plazmy Eliminace Inaktivní Metabolismus Aktivní metabolity metabolity Nevázaná frakce Léčivo Střevo Vázaná frakce Receptory Krev 1 Obr. 1 Vliv vazebnosti léčiv na farmakokinetiku Distribuce a délka účinku Potom, co se léčiva vstřebají z trávicího traktu, se dostanou do krve, kde se vážou na plazmatické bílkoviny. Tato vazba je reverzibilní, v krvi se neustále udržuje rovnováha mezi složkou volnou a vázanou. Pouze ty molekuly léčiv, které jsou v krvi volné, tj. nevázané na bílkoviny, mohou prostupovat stěnou kapilár ven z kapilárního řečiště do místa svého účinku. [29] Pokud je vazebnost příliš vysoká, nástup účinku bude pomalý, ale délka působení dlouhá. [3, 29] Velikost volné frakce léčiva může ovlivnit jeho distribuční objem Vd a tudíž i koncentraci v místě účinku a clearance látky. Nevázaný podíl je ovlivňován řadou faktorů fyziologických i patologických. Tento podíl je redukovaný např. při narození, v průběhu těhotenství a ve stáří. Poruchy ve vazbě se dále mohou vyskytnout třeba i při onemocnění ledvin, jater nebo štítné žlázy. [20] 1 Obr. 1 převzat z: VUIGNIER, Karine, et al. Drug-protein binding: a critical rewiev of analytical tools. Springer-Verlag. 8 April 2010, s. 2.

13 6 Aby léčivo vyvolalo kýžený farmakologický efekt, musí se dostat do tkání a zde se navázat na receptory. Pokud dojde ke snížení stupně vazebnosti u látek, které se silně vážou na plazmatické proteiny a mají omezený distribuční objem, způsobí to relevantní zvýšení distribučního objemu a tedy i koncentraci daného léčiva ve tkáních. [20] Léčivo se však nemusí vázat pouze na bílkoviny krevní plazmy, ale i na krevní buňky a také na jiné tkáně lidského těla. [4] Množství léčiva vázaného na tělesné tkáně bude podstatné, pokud stupeň vazebnosti bude velmi vysoký (více než 90 % v plazmě) nebo pokud tkáň obsahující vazebná místa zaujímá velkou část objemu těla např. svalová nebo tuková tkáň. Budeme-li uvažovat o člověku s hmotností 70 kg a přibližně 50 l celkové tělesné tekutiny, asi 5,5 l krve a 30 l svalové hmoty, můžeme potom určit, jaká část léčiva bude vázaná na tkáně. Volná část se u většiny léčiv distribuuje v celkové tělesné tekutině. Jestliže se látka váže čistě jenom na bílkoviny v plazmě resp. na svalovinu, můžeme její celkové množství vypočítat podle následující rovnice: [4] =[ ] 50 litrů+[ ] 5,5 litrů respektive =[ ] 50 litrů+[ ] 30 litrů kde D t znamená celkové množství léčiva v těle, [D f ] koncentraci nevázané látky na litr a [D a ] koncentraci komplexu léčivo-albumin v krvi resp. [D m ] množství léčiva vázaného na svalovou hmotu na kilogram svaloviny. Pokud tedy budeme předpokládat, že se léčivo v plazmě váže z 90 % na albumin, množství vázaného léčiva bude jenom zhruba 50 %. Naopak jestliže budeme uvažovat, že se látka váže taktéž z 90 % ale na svalovinu, celkové množství vázané látky bude činit přibližně 85 %. [4] Distribuční objem Distribuční objem V d představuje hypotetický objem, ve kterém by se látka rozpustila, kdyby byla v homogenním prostředí. Můžeme ho vypočítat podle následujících dvou vzorců, výběr závisí na původu vzorku, tedy jestli testujeme plnou krev nebo krevní plazmu: [23] = + = +!! "#$%= & + '(

14 7 kde znamená objem plazmy, ) * resp. ) * resp. ) *& nevázanou frakci v plazmě respektive ve tkáni respektive v krvi, objem tkáně (extravaskulárního prostoru + krevních buněk), + & resp. + koncentraci léčiva v krvi resp. v plazmě, & objem krve a '( objem extravaskulární tekutiny. Existují i jiné, složitější rovnice, které zahrnují ještě další faktory např. lipofilitu nebo ionizační stupeň. [23] Distribuční objem léčiva určuje poměr mezi volnou frakcí v plazmě a ve tkáni, např. dvě léčiva s podobnou vazebností na proteiny esprosartan (98 %) a flutikason propionát (90 %) mají značně odlišný distribuční objem esprosartan zhruba 13 l a flutikason l. Velikost změny distribučního objemu, která je vyvolaná právě změnou poměru frakcí, však záleží na i na původní hodnotě V d. Pokud léčivo špatně proniká do tkání a jeho V d je téměř shodný s objemem plazmy, změna poměru mezi volnou a vázanou frakcí distribuční objem téměř neovlivní (např. heparin, V d = 0,058l.kg -1 ). U látek s velkým V d je tomu jinak, změna v poměru frakcí vyvolá úměrnou změnu v distribučním objemu léčiva (např. amitriptilin V d = 15 l.kg -1 ). [23] Poločas léčiva Rovněž poločas léčivé látky je závislý na vazebnosti na plazmatické bílkoviny, znázorňuje to následující rovnice: [23],- / = 0* = 0* je tedy zřejmé, že poločas léčiva závisí na clearance a na svém distribučním objemu. [23] Vazbu léčiv na proteiny, musíme brát v úvahu u léčiv, která se eliminují pomocí renální filtrace nebo pomalu játry (více dále) a zároveň mají malý (V d V plazmy ) nebo až střední distribuční objem. Naopak u látek s vysokým V d (nad 30 l) vazba na proteiny nehraje při výpočtu poločasu léčiva žádnou roli. Také u léčiv, která se vylučují rychle játry a jejichž distribuční objem je středně velký (méně než 30 l) až velký, bychom měli počítat s tím, že změna vazebnosti ovlivní poločas těchto léčiv. [23] Eliminace z organismu Vylučování léčiv může být jak urychleno, stejně tak i zpomaleno vazbou na plazmatické bílkoviny. [4] To záleží na charakteru vazby léčiva na protein. Pokud slouží pouze jako transportní mechanismus, vyloučení látky bude urychleno polární

15 8 látky jsou rychle vylučovány ledvinami pomocí transportních systémů, rychlost se může až přiblížit rychlosti průtoku krve ledvinou. Také léčiva, která jsou rychle metabolizována jaterními enzymy, budou rychleji eliminována, pokud se budou vázat na bílkoviny krevní plazmy. Jestliže je vazba léčiva na proteiny typu depo, vylučování látky se naopak zpomalí. [4] Pokud chceme zjistit, zda krevní bílkoviny fungují jako přenašeč léčivé látky a ne jako depo, je třeba porovnat hodnoty zdánlivé clearance s rychlostí průtoku krve játry. Zdánlivá clearance se vypočítá jako podíl rychlosti vylučování léčiva (Q) a koncentrace volného léčiva v plazmě (c). Tedy podle vzorce: 8= 9 :. Pokud hodnoty takto vypočítané clearance přesáhnou hodnotu rychlosti průtoku krve játry a pokud je léčivo z těla eliminováno pouze játry, lze říci, že plazmatické proteiny, případně další složky krve fungují jako přenašeče. Pokud není známo, zda se léčivo eliminuje jenom játry, určíme, zda zdánlivá clearance překračuje minutový srdeční objem. Skutečná clearance ho totiž za žádných okolností překročit nemůže." 2 [4] Clearance udává, jaký objem plazmy se ireverzibilně očistí od daného léčiva za jednotku času. Většina léčiv je z našeho organismu eliminována pomocí jater a ledvin a to buď s využitím obou orgánů, nebo jen jednoho z nich. Pokud se bude látka vylučovat pouze pomocí ledvin, budeme moci clearance (Cl) vypočítat z této rovnice: [23] 8 ;'*á0*í = >-?@ A B C( 65( D E : FGHIG kde J K představuje frakci resorbovanou v tubulech, % resp. % L rychlost filtrace respektive sekrece a + 0M koncentraci léčiva v plazmě. Pokud je látka vylučována pouze pomocí glomerulární filtrace a procesy sekrece a reabsorpce se vůbec neuplatňují, lze rovnici zjednodušit do následujícího tvaru, kde GFR označuje glomerulární filtrační rychlost: 3 [23] 8 ;'*á0*í = N@K 2 GILLETTE, James R. Overview of drug-protein binding. Annals New York Academy of Sciences. 26 November 1973, 226, s SCHMIDT, Stephan; GONZALEZ, Daniel; DERENDORF, Hartmut. Significance of protein binding in pharmacokinetics and pharmacodynamics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 22 October 2009, s. 6.

16 9 Za předpokladu, že se léčivo bude z těla vylučovat jenom pomocí jater, můžeme jeho clearance spočítat následovně: [23] 8 O'á0*í = 9 PGQRí 30 S 9 PGQRí 5 30 S kde T U';*í značí průtok krve játry a 8 *V* vnitřní clearance, která je založená na koncentraci nevázané složky léčiva. U jaterní clearance je význam vazby léčiv na bílkoviny závislý na využití jaterních enzymů (Cl nint ). Léčiva lze obecně rozdělit do tří skupin, a to na látky, které se vylučují pomalu, středně rychle a rychle. Většina léčiv patří buď do první, nebo do třetí skupiny. Clearance pomalu se vylučujících látek je závislá na kapacitě enzymů a také je ovlivněna vazbou léčiv na bílkoviny. Naproti tomu je clearance rychle se vylučujících látek závislá pouze na průtoku krve játry, zjednodušeně se dá říci, že Cl hepatální = Q jaterní a vazba léčiv na bílkoviny krevní plazmy zde roli nehraje. [23] Interakce léčiv Pro jakéhokoliv pacienta může být nebezpečné, pokud se u něj vyskytne kombinace dvou a více léčiv s vysokou vazebností na krevní bílkoviny. [3] Může dojít ke vzájemnému vytěsňování a může tak stoupnout koncentrace volné frakce v krvi až na několikanásobek, což může mít pro pacienta závažné následky. Může totiž nastat zvýšení účinku léčiva, což je v některých případech vysoce nebezpečné samo o sobě např. u warfarinu, dále se mohou vystupňovat nežádoucí účinky. Látka může působit na organismus až toxicky a v krajním případě i usmrtit pacienta. [3] In vitro bylo prokázáno, že to, že se jedna anionická látka váže na určité vazebné místo na molekule albuminu, nemusí ještě znamenat, že bude vázat i jinou látku stejné povahy. Z tohoto důvodu, zdaleka ne všechna anionická vysoce se vázající léčiva se mohou navzájem vytlačovat ze své vazby na sérový albumin. 4 Např. indometacin může být nahrazen kyselinou salicylovou, ale už ne phenylbutazonem. Jedna molekula léčiva se ale může vázat na větší počet vazebných míst albuminu. Tudíž může tato látka vytlačovat z vazby molekuly vázané na jiných typech vazebných míst, které spolu však vzájemně neinteragují. Samozřejmě tato látka může být také vytlačena pouze z některých míst, zatímco na jiných zůstane vázaná. [4] 4 GILLETTE, James R. Overview of drug-protein binding. Annals New York Academy of Sciences. 26 November 1973, 226, s. 12.

17 10 Pokud má být interakce dvou současně podaných kyselých léčiv klinicky důležitá, látky se musí vázat na stejné vazebné místo a v podobném stupni. [19] Stupeň vazebnosti je závislý na pk a léčiva (aby vznikla iontová vazba) a schopnosti tvořit různé druhy vazeb s molekulou bílkoviny. [19] V lidské krvi jsou i jiné proteiny, některé fungují jako vysoce specializované transportéry endogenních látek jako je např. kortikosteron, estrogen nebo tyroxin. Je tedy zřejmé, že látky, které se těmto hormonům podobají, se rovněž mohou vázat na stejné transportéry. [4] Rovněž vylučování léčiv může být ovlivněno kompeticí o vazebná místa na molekulách bílkovin. Když totiž proteiny zastávají pouze funkci transportéru a ne depa, může se vzájemným vytlačováním dvou látek jejich vylučování výrazně zpomalit. Když se dvě látky sobě hodně podobají, může dokonce dojít i k tomu, že jedno léčivo znemožní tomu druhému aktivní transport v ledvinách nebo mu obsadí jaterní nebo jiné enzymy, které ho metabolizují a také tak prodloužit eliminaci látek z organismu. [4] O vazebná místa ale nemusí soupeřit jenom dvě molekuly různých léčiv, může to být i molekula léčiva s endogenními látkami např. warfarinu s mastnými kyselinami nebo salicyláty a indometacin s bilirubinem. Tato kompetice je však nebezpečná především pro nedonošené novorozence, protože hladiny bilirubinu a ostatních endogenních látek v plazmě jsou neobvykle vysoké, navíc ještě nemají dostatečně vyvinutý enzymový systém na detoxikaci svého organismu. Vyvíjí se u nich kernikterus, který může způsobit závažná poškození mozku. Bylo také zjištěno, že vazba některých léčiv může být do značné míry pozměněná u pacientů, kteří trpí nějakou chorobou, při níž jsou plazmatické hladiny endogenních látek značně odlišné od normálu. [3, 4] Dávkování léčiv Vazebnost léčiv na plazmatické proteiny může ovlivnit dokonce i dávkování. Když je pacientovi podaná jedna dávka léčiva, která téměř vysytí vazebná místa bílkovin, může se stát, že při podání druhé takové dávky (pokud mezi nimi nebude dodržen dostatečný časový odstup) se koncentrace volného léčiva v plazmě ne jenom zdvojnásobí, ale může vyskočit až na několikanásobnou hodnotu původní hladiny. To ovšem záleží i na individuálních rozdílech mezi jedinci jako je rychlost

18 11 metabolismu a absorpce látky nebo i množství albuminu případně jiných plazmatických bílkovin. [4] Farmakodynamika Jak jsem se již zmínila v úvodu své práce, vazba léčiv na plazmatické proteiny neovlivňuje pouze farmakokinetiku ale také farmakodynamiku, protože je to právě volná frakce, která je zodpovědná za vlastní farmakologický účinek léčiva. Je zde však příliš mnoho faktorů, které musíme vzít v úvahu, takže udělat obecné závěry o efektu této vazby by mohlo být spekulativní. Mezi tyto faktory patří třeba mechanismus působení léčiva, afinita léčiva ke svému receptoru a k bílkovině, počet vazebných míst jak v místě svého působení, tak i na molekule proteinu, umístění receptorů a také jaká je koncentrace bílkovin právě v místě účinku. [23] Pokud se místo účinku léčiva nenachází uvnitř centrálního kompartmentu, ale v periferním, musíme brát v potaz i fyzikálněchemické vlastnosti léčiva a také přítomnost transportních systémů. Jako příklad můžu uvést loperamid, který působí jako agonista opioidních µ-receptorů ve střevech a v mozku. In vivo se však dají využít pouze jeho antidiarhoické účinky. Není to kvůli jeho velké vazbě na plazmatické bílkoviny (97 %), ale protože efluxní transportér P-glykoprotein nepropustí molekuly loperamidu do lidského mozku. Pokud bychom tedy inhibovali P-glykoprotein, bude mít loperamid i centrální účinky, jak je tomu i u malých dětí, které ještě nemají plně vyvinutou hematoencefalickou bariéru a proto mohou molekuly loperamidu proniknout do jejich mozku. Transportní systémy jsou tedy odpovědné jak za míru, tak i za rychlost jakou dosáhne léčivá látka místo svého účinku. [23] Utváření komplexu mezi léčivem a receptorem závisí jak na množství volného léčiva (jeho množství může být sníženo vazbou na proteiny, které se nacházejí v místě účinku) a počtu neobsazených receptorů, tak i na jejich vzájemné afinitě. Intersticiální tekutina v místě účinku se svým složením může značně lišit od složení krevní plazmy, např. mozkomíšní mok obsahuje podstatně méně bílkovin, proto je vliv vazby léčiva na proteiny v tomto případě zanedbatelný. [23] Avšak vazba léčiv na plazmatické proteiny může být v určitých případech i výhodná. Vzhledem k tomu, že u silně se vázajících léčiv jen malá část může účinkovat, ale i jen tato malá část způsobuje nežádoucí účinky. Tohoto bylo využito u nejnovějšího inhalačního kortikosteroidu ciclesonidu. Je inhalován ve formě

19 12 proléčiva desisobutyryl-ciclesonid, které se mění na aktivní metabolit hned, jakmile se dostane do plic. Toto proléčivo se velmi silně váže na plazmatické bílkoviny (asi z 99 %), tím jsou velmi omezené nežádoucí systémové účinky kortikosteroidů. [23]

20 Teoretický popis vazby mezi léčivem a bílkovinou Vazbu mezi léčivem a proteinem můžeme považovat za reverzibilní, ačkoliv byly popsány i případy, kdy vazba byla ireverzibilní. Jak volná frakce přechází z krevního řečiště do místa svého účinku, dochází k poklesu koncentrace volné složky, který je však neustále kompenzován disociací komplexu protein-léčivo. Pokud budeme uvažovat, že jedna molekula léčivé látky se váže na jednu molekulu bílkoviny, pak lze vyjádřit rovnováhu podle následující rovnice: [23, 29] [P] + [L] & W [PL] & Y kde [P], [L] a [PL] označují koncentrace proteinu (P), volného léčiva (L) a komplexu protein-léčivo (PL), dále konstanta k 1 respektive k 2 udává rychlostní konstantu asociační resp. disociační. Tvorba i rozpad komplexu jsou procesy velmi rychlé, dochází k nim během několika mikrosekund a tudíž i rovnováha mezi volnými a vázanými frakcemi se rychle ustaluje. [23, 29] Když nastane rovnováha, rychlost asociace bude stejná jako rychlost disociace. Za těchto podmínek můžeme asociační konstantu (K a ) vypočítat podle vzorce: [29] [ = & W & Y = [\]] [\]5 []] Podle obdobné rovnice lze vypočítat i disociační konstantu (K d ), která představuje převrácenou hodnotu konstanty asociační tedy: [29] [ = & Y & W = [\]5 []] [\]] = -^G Dále je možné si spočítat celkový počet molekul léčiva vázaného na danou bílkovinu nebo její část (r): [29] # = [\]] [\]5 [\]] Rovněž podle následujících vzorců lze vypočítat, kolik procent léčiva se váže na plazmatické bílkoviny nebo kolik je volných za předpokladu, že se léčivo váže jen na jedno vazebné místo na proteinu: [23] % %á`éhc= : dáhgéef :!QF fdá 100= :!QF fdá?: dfféef :!QF fdá 100

21 14 % %c`éhc= : dfféef :!QF fdá 100= :!QF fdá?: dáhgéef :!QF fdá 100 kde c značí koncentraci příslušné složky. Koncentrace volné a vázané frakce nám vyjadřují následující rovnice: [23] + (h0*é = : dáhgé ^2 (;h'v*) i IGj?: dáhgé = : dáhgé ^2 (;h'v*) * \?: dáhgé + (ám*é = i IGj : dffé ^2 (;h'v*)5: dffé = * \ : dffé ^2 (;h'v*)5: dffé kde B max znamená maximální vazebnou kapacitu proteinu, n počet vazebných míst na mol proteinu a [P] molární koncentraci proteinu. [23] Rovnice popisující vznik komplexu mezi léčivem a receptorem, má stejný tvar jako rovnice vystihující vazbu léčiva na bílkovinu. Rovněž asociační konstantu lze obdobně vypočítat. [23] & W k+l kl & Y [ (#$+$,c#m)= & W & Y = ]K ] K = - ^2(;':'h;n) Symboly [L], [R] a [LR] označují množství léčiva, receptoru (R) a také komplexu mezi léčivem a receptorem (LR). [23]

22 Povaha chemických vazeb mezi proteinem a léčivem Léčiva se na bílkoviny mohou vázat různými vazbami, někdy se i jedno léčivo může vázat pomocí několika různých druhů vazeb na jedno jediné vazebné místo. Např. kyselina salicylová se na albumin váže pomocí hydrofobní a iontové vazby zároveň. [19] Van der Waalsovy vazby Jedná se o nejslabší typ vazeb, jsou realizovány pomocí nespecifických interakcí mezi nenabitými molekulami nebo jejich částmi. Vlivem pohybu elektronů se na kratičký okamžik vytvoří přechodný dipól a ten může vyvolat vznik druhého dipólu u jiné molekuly. Mohou se vyskytovat například mezi methylovými skupinami léčiva a bílkoviny, jak ukazuje obr. 2. Energie této vazby bývá nízká, mezi 4 až 20 kj.mol -1. [7, 19, 30] 5 Obr. 2 Van der Waalsovy vazby 6 Obr. 3 Hydrofobní vazby Hydrofobní vazby Stejně jako Van der Waalsovy vazby je tento typ vazeb poměrně slabý. Rozlišujeme dva typy hydrofobních vazeb mezi dvěma aromatickými kruhy (viz obr. 3) a mezi dvěma alkylovými řetězci. Pokud se dva planární aromatické kruhy dostanou vedle sebe, má to za následek restrukturalizaci okolní vody a interferenci mezi π-elektrony obou kruhů. Podobné slabé vazby se mohou utvořit i mezi jednoduchými alkylovými řetězci. Molekuly jsou orientovány tak, že utvoří hydrofobní oblast, která je 5 Obr. 2 převzat z: NILSSON, J. L. g. Chemical aspects of drug interaction. Pharma International. 1971, 1/1971, s Obr. 3 převzat z: NILSSON, J. L. g. Chemical aspects of drug interaction. Pharma International. 1971, 1/1971, s. 2.

23 16 obklopená vodním prostředím. Platí, že čím větší je alkylový řetězec, tím více se bude látka vázat v porovnání s látkou stejné struktury, ale s kratším alkylovým řetězcem. [19] Vodíkové vazby Tvoří se mezi vodíky polárních skupin jako OH a NH 2 (donor) a atomy s volným elektronovým párem (akceptor), třeba kyslíkem nebo dusíkem. Vodíková vazba je tedy donor-akceptorového typu. Proteiny mají velké množství potenciálních míst, kde může vzniknout tato vazba, proto je tento typ nesmírně důležitý. Vodíková vazba je znázorněna na obr. 4, kde se váže fenolická skupina zbytku tyrozinu z bílkoviny na karbonylovou skupinu léčiva. Energie této vazby bývá mezi 8 až 42 kj. mol -1. [7, 19, 30] 7 Obr. 4 Vodíkové vazby Iontová vazba Iontové vazby jsou silnější než všechny předešlé, pro mnoho léčiv je tento typ vazby ten nejdůležitější, co se týče interakcí. Vznikají mezi opačně nabitými skupinami na léčivu a bílkovině. V případě proteinu se uplatňují negativně nabité karboxylové ionty a pozitivní amoniové, skupiny jsou vázány pomocí elektrostatických sil. Energie této vazby dosahuje až několik set kj. mol -1. [19, 30] 7 Obr. 4 převzat z: NILSSON, J. L. g. Chemical aspects of drug interaction. Pharma International. 1971, 1/1971, s. 2.

24 Plazmatické bílkoviny uplatňující se při vazbě léčiv Krevní plazma obsahuje asi 93 % vody, zbytek tvoří látky různé povahy, především jsou to proteiny, které se v plazmě nacházejí v koncentraci g.l -1. Tyto bílkoviny se dělí do tří hlavních skupin a to na albuminy, globuliny a fibrinogen. Spousta plazmatických bílkovin se v lidském těle vyskytuje ve více polymorfních formách (např. systém krevních skupin AB0). Naprostá většina proteinů jsou glykoproteiny, s výjimkou albuminu. [17a, 23, 27a] Byla prokázána existence a funkce více než sta různých druhů plazmatických bílkovin. Plazmatické proteiny jsou neustále obnovovány, většina jich vzniká v játrech, imunoglobuliny v B-lymfocytech. Při různých onemocněních dochází ke změnám v koncentraci jednotlivých proteinů, ale také ke změnám v aktivitě mnoha enzymů, tyto poznatky lze využít i při diagnostice. [17a, 27a] Hlavní složku plazmatických proteinů tvoří albumin, jenž představuje asi 5 % celkového objemu krevní plazmy, ostatních bílkovin obsahuje krevní plazma podstatně méně. [23] Patří mezi ně α 1 -kyselý glykoprotein, lipoproteiny a pak ještě bílkoviny, které fungují jako speciální přenašeče vázající kationty kovů nebo hormony, jako je např. transferin (ten na sebe váže železité kationty) a TBG (thyroxine binding globulin bílkovina vázající hormon štítné žlázy thyroxin). [23] Většina léčiv se reverzibilně váže na bílkoviny krevní plazmy, popř. i jiné struktury, jako jsou třeba erytrocyty. Hlavní podíl na interakcích mezi krevními bílkovinami a léčivy má albumin a α 1 -kyselý glykoprotein. [23] Obě bílkoviny jsou schopné vázat neutrální molekuly, kyselá léčiva preferuje albumin, zatímco bazická α 1 -kyselý glykoprotein. Pokud pacientovi podáme racemickou směs opticky aktivního léčiva, může se stát, že každý enantiomer bude upřednostňovat jinou bílkovinu. Přitom vyšší stereoselektivitu obvykle vykazuje sérový albumin než α 1 -kyselý glykoprotein. [23] Plazmatické bílkoviny mají spoustu funkcí, ty nejdůležitější jsou vyjmenovány v následujícím odstavci. Vytvářejí stálý onkotický tlak mmhg a tím udržují stálý objem krevní plazmy. Na svém povrchu reverzibilně vážou molekuly léčiv, minerálních látek, hormonů, vitamínů a barviv. Vzhledem k tomu, že lidský organismus nemá žádné proteinové zásoby, může při hladovění využít právě tyto bílkoviny. Imunoglobuliny

25 18 hrají důležitou roli při obranyschopnosti organismu. Mezi další funkce patří koagulace krve, fibrinolýza, tvorba komplementu a mnohé další. [27a] Následující tabulka přehledně znázorňuje množství a funkci hlavních bílkovin v krevní plazmě. 8 Tab. 1 Hlavní bílkoviny krevní plazmy Bílkovina Funkce Průměrná koncentrace (g. l -1 ) Prealbumin 0,3 Transport vitaminu A, thyroxinu a trijodtyroninu Albumin 42,0 Onkotický tlak; transport mastných kyselin, bilirubinu, léků; sekundární nosič pro hem, tyroxin, kortizol; rezervní bílkovina Apolipoproteiny (globuliny) 4,0 9,0 Transport triacylglycerolů, fosfolipidů, cholesterolu Haptoglobin 0,4 1,8 Váže hemoglobin uvolněný při (α 2 -globulin) intravaskulárním rozpadu erytrocytů Hemopexin (β 1 -globulin) 0,7 Váže hem (z hemoglobulinu) Transferin (β 1 -globulin) 2,9 Transport železa Ceruloplazmin 0,35 Transport mědi; enzym ferroxidáza (α 2 -globulin) Transkortin (α 1 -globulin) 0,04 Transport kortizolu Transkobalamin Transport vitamínu B 12 α 2 -makroglobulin 2,5 Inhibice plazminu a proteináz, nosič některých cytokinů a hormonů α 1 -antitrypsin 2,5 Inhibice proteináz (trypsinu, chymotrypsinu) Fibrinogen 4,0 Srážení krve Antitrombin III (α 2 -globulin) 0,2 Inhibice trombinu Protein vázající kovy 0,055 Transport barya, stroncia a niklu (α 1 -globulin) Imunoglobuliny (γ-globulin) Protilátky 8 Tab. 1 převzata z: TROJAN, Ivan, et al. Lékařská fyziologie. 4. Praha: Grada Publishing, Fyziologie krve, s ISBN

26 Albumin Lidský sérový albumin je protein s molekulovou hmotností okolo 69 kda, skládá se z 20 různých aminokyselin o celkovém počtu 585, obsahuje 17 disulfidických můstků. Jedná se o hlavní bílkovinu lidské plazmy, představuje zhruba 60 % celkového množství plazmatických bílkovin. Jeho schopnost vázat látky je umožněna díky rozdílným chemickým vlastnostem aminokyselin a jejich rozmístění v molekule. Koncentrace albuminu v plazmě se pohybuje v rozmezí g.l -1, může být ovlivněna různými patologickými stavy (hypoalbuminémie může nastat třeba při selhání ledvin, rozsáhlých popáleninách nebo podvýživě). Albumin je produkován játry, tvoří se zde přibližně 12 g každý den. [17a, 19, 23] Hlavním úkolem lidského albuminu je udržování správného onkotického tlaku, další jeho důležitou vlastností je schopnost vázat na svém povrchu molekuly léčivých látek. Zároveň je však schopný vázat i látky jiné povahy než jsou léčiva, mezi ně patří třeba volné mastné kyseliny, vápník, bilirubin a některé steroidní hormony. [17a, 27a] Různé aminokyseliny jsou schopné vázat léčiva různé povahy. Tyrozin, kyselina asparagová a glutamová mají kyselé vlastnosti a jsou tedy schopné vázat látky opačného charakteru tj. báze. Naopak arginin, histidin a lysin obsahují bazické skupiny a tudíž jsou schopné k sobě poutat kyseliny. Z tohoto tedy vyplývá, že molekula albuminu je schopná reverzibilně vázat na svém povrchu léčiva jak kyselá, tak bazická. Při fyziologickém ph 7,4 jsou kyselé i bazické skupiny ionizovány podle následujících rovnic: COOH COO - + H + NH 2 + H + NH 3 + =NH + H + =NH 2 + N + H + NH + Tyto skupiny tvoří kladně a záporně nabitá místa na molekule a jsou schopná vázat opačně nabité částice pomocí elektrostatických vazebných sil. [19] Bylo zjištěno, že se na lidském sérovém albuminu nachází struktura, která specificky váže negativně nabité molekuly tj. kyselé. [19] Spektroskopicky bylo určeno, že do této vazby je zapojen zbytek tryptofanu na molekule albuminu. Částečnou hydrolýzou a následnou sekvenací tohoto fragmentu Klotz a Swaney určili sekvenci

27 20 aminokyselin v místě okolo tryptofanu (viz obr. 5): lysin alanin tryptofan alanin valin alanin arginin [19] 9 Obr. 5 Struktura vazebného místa pro kyselá léčiva na molekule albuminu Tato struktura je velmi vhodná pro vazbu aniontů. Mohou se totiž vázat hydrofobní vazbou na aromatickou indolovou část molekuly tryptofanu a navíc ještě volné aminoskupiny lysinu a argininu jsou schopné přijmout proton a vytvořit tak s kyselým léčivem iontovou vazbu. Vazba je tedy dost stabilní a kyselé molekuly jsou i silně vázány na albumin. Za fyziologických podmínek se jedna až dvě molekuly kyselého léčiva silně vážou na jednu molekulu albuminu. Mezi běžná kyselá léčiva můžeme zařadit třeba kyselinu askorbovou a nikotinovou (zde zatím nebyly dokumentovány žádné případy lékových interakcí, ovšem teoreticky možné jsou, zvláště při podání vysokých dávek těchto látek), salicyláty, sulfonamidová chemoterapeutika, peniciliny nebo barbituráty (kyselé vlastnosti těchto látek jsou způsobeny díky oxo-enol tautomerii, kyselá je až enol forma). [19] Odpovídající místo pro bazická léčiva nebylo na molekule tohoto proteinu nalezeno a taková léčiva jsou vázána pouze slabou vazbou, ale na velký počet míst na albuminu. [19] Interakce mezi bazickými léčivy nemá často žádný význam. Lze tedy říci, že klinicky významné interakce se odehrávají hlavně mezi kyselými molekulami léčiv. [19] α1-kyselý glykoprotein α1-kyselý glykoprotein neboli orosomukoid je vysoce glykosylovaný protein krevní plazmy, skládá se ze 183 aminokyselin. Přibližně 45 % jeho molekulové hmotnosti je tvořeno cukernou složkou, která je velmi bohatě rozvětvená. Váže se na peptidický řetězec na N-konec asparaginu v pozicích 15, 38, 54, 75 a 85. [14] 9 Obr. 5 převzat z: NILSSON, J. L. g. Chemical aspects of drug interaction. Pharma International. 1971, 1/1971, s. 3.

28 21 V plazmě se nachází v koncentraci podstatně nižší než lidský sérový albumin c = 0,4 1 g.l -1. Z toho tedy vyplývá, že bude mít i podstatně nižší vazebnou kapacitu. Jeho hladina v krevní plazmě ovšem není stálá a často se mění. Bývá zvýšená zejména při zánětlivých onemocněních a po úrazech. [23] Fyziologická úloha tohoto proteinu není doposud úplně zřejmá. Samozřejmě je schopný vázat bazická (např. chinin) i neutrální léčiva, ale mimo to má i jisté imunomodulační účinky na leukocyty a patrně i podporuje funkci endoteliální bariéry. Při akutní zánětlivé odpovědi se jeho koncentrace zvýší dvakrát až sedmkrát. U zvířecích modelů bylo dokonce prokázáno, že po podání 0,2 0,4 g α1-kyselého glykoproteinu na kilogram hmotnosti zvířete dochází k útlumu zánětlivé odpovědi a také ke snížení úmrtnosti na hypovolemii nebo septický šok. Jeho získávání z krevní plazmy ale je velmi náročné a to i po finanční stránce. [14, 24] Lipoproteiny Představují rozsáhlou skupinu látek, které slouží k transportu částic lipidů v krvi. Jsou to kulovité částice, které se skládají z pláště a jádra. Plášť obsahuje volný cholesterol, apoprotein a fosfolipidy, které vytvářejí dvojvrstvu a umožňují transport nepolárních látek v jádru. Jádro částice se skládá z esterů cholesterolu a triacylglycerolů. Podle své hustoty se dělí na několik tříd: s vůbec nejmenší hustotou jsou to chilomikrony, dále částice s velmi nízkou hustotou VLDL, se střední IDL, nízkou LDL a vysokou hustotou HDL. Částice se rovněž liší svojí bílkovinnou složkou, která se nazývá apoprotein. Pro každé částice je charakteristický jiný druh apoproteinu a také jeho procentuální zastoupení to se pohybuje zhruba od 1 % (chylomikrony) do 50 % (HDL). Většina lipoproteinů obsahuje více druhů apoproteinu. [9a, 27b] Chilomikrony vzhledem k tomu, že obsahují nejvyšší podíl lipidické složky hlavní podíl zde tvoří triacylglyceroly, mají i nejmenší hustotu ze všech výše jmenovaných lipoproteinových částic. Jejich hustota se pohybuje okolo 0,9 g.cm -3. Apoproteinem typickým pro tyto částice je B 48, dále pak E a C I-III. Vznikají ve střevní sliznici a mají za úkol transportovat lipidy do krevního a lymfatického oběhu a pak dále po těle. Chilomikrony se zachytávají v cévním endotelu, kde se nachází enzym lipoproteinová lipáza, který chilomikrony rozkládá, odštěpuje z triacylglycerolů neesterifikované mastné kyseliny, které se okamžitě vážou na albumin, ten je pak

29 22 transportuje dále po těle. Lipoproteinová lipáza také odštěpuje apoprotein C, který se následně stává součástí HDL. Zbytky chilomikronů, tzv. chilomikronová remnanta, jsou nakonec degradována v játrech. Poločas chylomikronů a VLDL je velmi krátký, tvoří zhruba jednu hodinu. [9a, 27b] VLDL (very low density lipoproteins) vznikají hlavně v hepatocytech, ale v malé míře i v enterocytech. Horní hranice hustoty VLDL částic je do 1,006 g.cm -3. Typickým apoproteinem pro VLDL je B 100, dále pak obsahují ještě E a C I-III. V lidském organismu slouží k transportu triacylglycerolů z jater do periferních tkání. Vlivem enzymů lipoproteinové lipázy a lecitincholesterol-acetyltransferázy dochází k postupné degradaci VLDL částice na IDL a LDL částici. Všechny tyto tři druhy částic obsahují pouze jednu molekulu apo-b 100. [9a, 17c, 27b] IDL (intermediary density lipoproteins). Tyto částice mají hustotu na rozmezí mezi 1,006 a 1,019 g.cm -3. Je možné, že tyto částice mohou v nepatrné míře vznikat i v játrech, ale naprostá většina těchto částic vzniká jako degradační produkt VLDL. IDL jsou vychytávány v játrech a zde jsou odbourávány nebo jsou přímo v krvi štěpeny na konečný produkt LDL. IDL má pravděpodobně vliv na přítomnost a dokonce i progresi aterosklerózy koronárních tepen. [5, 9a, 17c] LDL (low density lipoproteins). Jejich hustota se pohybuje v intervalu od 1,019 do 1,063 g.cm -3. Vznikají pouze jako konečné degradační produkty VLDL a IDL, nevznikají ani v játrech, ani v enterocytech. Charakteristickým apoproteinem pro LDL je B 100. Neobsahují již tak vysoký podíl TAG, jejich hlavní složkou jsou estery cholesterolu. Mají tedy za úkol dodávat cholesterol periferním tkáním. Může se ale stát, že buňky mají cholesterolu nadbytek, a tak dochází ke snižování vysoké hladiny LDL vychytáváním pomocí speciálních receptorů na makrofázích (tzv. scavenger receptorů). Takto začíná proces aterosklerózy, na němž se v nejvyšší míře podílejí právě LDL. [9a] HDL (high density lipoproteins) vznikají v játrech a v enterocytech. Tyto částice v sobě obsahují nejmenší podíl lipidických částic, a proto také mají nejvyšší hustotu, která je v rozmezí mezi 1,063 a 1,210 g.cm -3. Jejich převažující složkou jsou proteiny, typickým apoproteinem této skupiny je AI a II, v těchto částicích můžeme rovněž nalézt D, E a C I-III apoproteiny. HDL jsou schopné vázat cholesterol ze subendoteliálních prostor v cévách a transportovat ho zpět ze tkání do jater. V játrech probíhá přeměna

30 23 cholesterolu na žlučové kyseliny a tímto způsobem se lidské tělo zbavuje nepotřebného cholesterolu. Částice HDL mají antiaterogenní účinek, brání rozvoji aterogenního plátu. Jeho koncentrace v plazmě se pohybuje na rozmezí 1,0 1,3 g.l -1, přičemž u žen bývá hladina HDL vyšší než u mužů vlivem estrogenů. Za určitých podmínek pokud zrovna probíhá akutní fáze zánětlivého procesu může mít HDL prozánětlivé účinky. V této fázi je pohyb makrofágů na postižené místo podporován právě HDL. [9a, 12, 27b] Haptoglobin Jedná se o plazmatický glykoprotein o molekulové hmotnosti kolem 90 kda. V těle člověka se vyskytuje ve třech polymorfních formách. Stejně jako α1-kyselý glykoprotein patří mezi bílkoviny akutní fáze a jeho koncentrace se tedy zvyšuje v případě zánětlivého onemocnění. [9b, 17a] Haptoglobin je schopný vázat volný hemoglobin a tím mu zabránit vstupu do ledvin, jinak by mohlo dojít k precipitaci hemoglobinu v glomerulech. Vzniklý komplex mezi volným hemoglobinem a haptoglobinem je totiž obrovský a do glomerulů nemá šanci se dostat. Tímto způsobem si lidský organismus šetří železo, které by jinak bylo vyloučeno ledvinami pryč z těla. [9b, 17a] Transferin Transferin je jeden z dalších plazmatických glykoproteinů, jeho molekulová hmotnost se pohybuje okolo 80 kda. Jedna molekula transferinu je schopná na sebe navázat dva trojmocné ionty železa a přepravit je z trávicího traktu do míst, kde je naopak nezbytně důležité (v játrech a v kostní dřeni). A tímto způsobem také snižuje toxicitu volného železa. [9b, 17a]

31 Ceruloplazmin Tento modře zbarvený plazmatický protein na sebe váže více než 90 % volné mědi, zbytek je navázán na albumin. Ceruloplazmin v těle člověka slouží k transportu mědi, každá jeho molekula na sebe váže velmi pevnou vazbou šest dvojmocných iontů mědi, vazba mezi albuminem a mědí je podstatně méně pevná. Z tohoto důvodu se předpokládá, že při transportu mědi v lidském organismu slouží především právě albumin. [9b, 17a] Thyroxine-binding globuline (TBG) Jedná se o bílkovinu krevní plazmy, jejíž funkce spočívá ve vazbě hormonů štítné žlázy thyroxinu a trijodthyroninu. Vzhledem k tomu, že je jeho množství regulováno, může se jeho stanovení používat k diagnostice funkce štítné žlázy místo toho, aby se přímo měřila koncentrace hormonů. [17c]

32 Jednotlivé metody určování vazebnosti léčiv V následujících odstavcích se budu věnovat jednotlivým technikám zjišťujícím vazebnost a popsání jejich výhod a nevýhod. Univerzální doporučení na základě výhod a nevýhod těchto technik nelze jednoznačně udělat, výběr metody závisí na cíli studie, chemických i fyzikálně chemických vlastnostech zkoumaných látek a množství materiálu, které budeme mít k dispozici. Jakési vodítko nám mohou poskytnout i uvedená pozitiva a negativa jednotlivých metod. Také počet vzorků a jejich množství bychom při výběru měli vzít v úvahu. První pokusy by se měly provádět s využitím jednoduché a rychlé metody třeba ultrafiltrace a až poté použít nějakou citlivější techniku, ideální je rovnovážná dialýza. V pokročilém výzkumu je dobré použít nějakou kalorimetrickou a/nebo spektroskopickou techniku. [20, 29] Velikost nevázané frakce může být ovlivněna použitou metodou stanovení. Proto je potřeba, aby jednotlivé metody byly standardizovány a uvedeny všechny podmínky, za nichž měření probíhalo. Jako je například druh použité membrány nebo filtru, teplota, doba průběhu, druh plazmy a její koncentrace [20] Určování se provádí buď přímo s krevní plazmou, nebo se mohou použít roztoky albuminu, α 1 -kyselého glykoproteinu nebo lipoproteinu. Nepřítomnost mastných kyselin, které se běžně vyskytují v krevní plazmě, může vyvolat změny na molekule bílkoviny, konkrétně na jejím vazebném místě a může tak dojít ke změně poměru mezi volnou a vázanou frakcí léčiva. [20, 23] Koncentrace jednotlivých bílkovin v plazmě nejsou neměnné. Konkrétně hladina albuminu je snížená např. při onemocnění jater a ledvin, ale i za fyziologických stavů jako je těhotenství, stáří a u novorozenců. S α 1 -kyselým glykoproteinem je to poněkud jiné: jeho koncentrace je rovněž snížena u novorozenců, ale při ledvinných onemocnění je naopak zvýšena a zdá se, že jaterní choroby nemají na jeho koncentraci žádný vliv. [20] Při měření vázané frakce léčiva musíme brát v úvahu počet vazebných míst na molekule proteinu a samozřejmě také asociační konstantu komplexu léčivo-bílkovina, která vyjadřuje afinitu léčiva k proteinu. [23] Jednotlivé metody se dají rozdělit do dvou hlavních skupin podle způsobu detekce, jedná se o techniky separativní a neseparativní. V první skupině metod dochází

33 26 k oddělení frakce volné od vázané, potom lze přímo změřit koncentraci obou složek dle libosti. Zatímco ve druhé skupině detekce spočívá ve změně fyzikálněchemických vlastností buď léčiva, nebo proteinu díky vazbě léčiva na bílkovinu. Pro názornost uvádím toto rozdělení na následujícím diagramu. [29] Přehled metod používaných ke stanovování vazebnosti léčiv na plazmatické bílkoviny Separativní metody Neseparativní metody RD, UF, UC, GF, MA, KCH, KE, UM CD, ST, KT, PPR 10 Obr. 6 Schematické rozdělení metod používaných ke stanovení plazmatické vazebnosti léčiv Separativní metody Rovnovážná dialýza (RD) Rovnovážná dialýza je nejčastěji používanou technikou při zkoumání vazebnosti léčiv, je považována za jakýsi standard. Princip této metody je založen na oddělení molekul na základě rozdílné velikosti molekul. [29] Skládá se za dvou částí, které tvoří malé komůrky, které jsou od sebe odděleny semipermeabilní membránou. 10 Obr. 6 vytvořen podle: VUIGNIER, Karine, et al. Drug-protein binding: a critical rewiev of analytical tools. Springer-Verlag. 8 April 2010, s. 4.

34 27 Ta je zvolena tak, aby propouštěla jenom léčivo volné a nikoliv bílkoviny nebo vázané léčivo. [20, 29] Látky se mohou vázat na součásti dialyzační komůrky i na membránu, což má za následek pokles koncentrace dialyzovaného média. Naštěstí se většina látek váže jen v mále míře na jednotlivé součásti dialyzačního zařízení, což výsledky měření příliš neovlivní. Přesto by se mělo nejprve zjistit, jestli se daná látka na membránu a jiné části dialyzačního zařízení váže nebo ne. Pokud ano, je nutno zvolit co možná nejtenčí membránu, aby měly výsledky vypovídající hodnotu. [20] Doba, po kterou bude dialýza probíhat, závisí hlavně na molekulové hmotnosti léčiva, čím je větší, tím delší dobu bude probíhat. Také musíme vzít v potaz tloušťku membrány, velikost pórů a i dialyzační teplotu. Dialýza se často provádí za teploty lidského těla tj. 37 C, stupeň vazebnosti je totiž závislý na teplotě. Někdy se doporučuje membránu namočit na několik desítek minut do pufru. [20] První pokusy byly prováděny v kádince s roztokem albuminu už v roce 1946 Klotzem. Objemy, ve kterých dialýza probíhala, byly příliš veliké zhruba od 5 do 20 ml. Později se ukázalo, že je to velký problém, když se v rámci zkvalitnění výzkumu přešlo od roztoků albuminu ke krevní plazmě. Dostupnost plazmy je špatná, zejména pokud se používá plazma čerstvě narozených mláďat a pokud je potřeba provést mnoho pokusů. Colowick a Womack v roce 1969 navrhli komůrky o objemu 1ml na studium vazebnosti difuzibilních molekul. O dva roky později Ehrnebo et al. studovali vazebnost pomocí souboru malých komůrek, kde probíhala dialýza 0,5ml plazmy oproti stejnému objemu pufru. Časem byly navrženy a později i uvedeny do praxe miniaturní komůrky, kde se spotřebuje pouze 50 až 100 µl plazmy na jeden pokus. [20] Mezi silné stránky této techniky zahrnujeme: možnost testovat až 20 vzorků najednou, použití malých objemů krevní plazmy (pod 1 ml) a také to, že si můžeme regulovat teplotu, při které bude dialýza probíhat. Mezi slabiny rovnovážné dialýzy patří: dlouhá doba nutná k ustanovení rovnováhy, možnost degradace nestabilních proteinů, již zmíněná vazba zkoumané látky ale i proteinu na součásti dialyzačního zařízení (tato vazba může být dokonce i vyšší než 50 % celkové koncentrace složek), zředění plazmy (to lze potlačit použitím pufru s přídavkem chloridu sodného). Také před vlastním měřením musíme provést řadu předběžných stanovení, abychom správně stanovili dobu nutnou k dosažení rovnováhy. Další nevýhodou je, že při

35 28 zkoumání může nastat tzv. Donnanův efekt, který se týká pouze elektricky nabitých iontů a ovlivňuje jejich difuzibilitu, může tedy ovlivňovat přestup iontů přes membránu a zkreslit tak výsledky. Na konec se ještě může vyskytnout problém, pokud chceme testovat látky, které jsou špatně rozpustné ve vodě vzhledem k tomu, že krevní plazma i pufr jsou vodné roztoky. [20, 29] Ultrafiltrace (UF) Ultrafiltrace byla navržena jako rychlá alternativní metoda k rovnovážné dialýze. Můžeme ji provádět na základě jednoho ze dvou možných principů a to buď centrifugací, nebo za použití pozitivního tlaku. [20,29] Centrifugace Jedná se o jednoduchou a velmi široce používanou metodu, která využívá sílu gravitačního pole země. K plazmě se přidá roztok léčiva a promísí se, poté se zkoumaná látka umístí do centrifugy a stáčí se. Volná frakce léčiva přejde přes filtr, ale bílkoviny ani komplex léčivo-bílkovina přes póry neprojdou. [20] Rychlost stáčení vzorku se udává v jednotkách rpm, což znamená revolutions per minute neboli počet obrátek za minutu. Také při této metodě je zapotřebí dát si pozor, aby se zkoumaná látka nevázala na ultrafiltr, vedlo by to ke zkreslení výsledků. [20] Zjevná výhoda této techniky je rychlost, s jakou měření probíhá. Už za několik málo minut máme od sebe oddělené frakce, které se vážou a které nikoliv. Jako další pozitivum bych mohla uvést i cenu centrifugace je levná technika. Na druhou stranu má i řadu nevýhod. Kromě již zmiňované možnosti vazby testované látky na filtr, je to obtížné regulování teploty a tudíž je nutná obezřetnost při hodnocení termolabilních látek, rovněž se zde můžeme setkat s Donnanovým efektem. Vyšší teplota také může ovlivnit vazebnost léčiva na bílkovinu, jak již bylo popsáno výše. Dále tato metoda není vhodná pro léčiva s příliš vysokou vazebností na plazmatické bílkoviny, aktivita v ultrafiltrátu u těchto látek bude příliš malá a hodnocení látky bude obtížné až téměř nemožné. Měla by trvat co nejkratší dobu, protože během ultrafiltrace dochází ke zvýšení koncentrace plazmatických bílkovin a to má vliv na rovnovážnou konstantu mezi ligandem a jeho vazebnými místy. [20, 29]

36 29 Ultrafiltrace s využitím pozitivního tlaku Jak už z názvu vyplývá, tato metoda využívá k rozdělení frakcí pozitivní tlak v rozmezí zhruba 1 až 3 kg/cm 2. Protože se jedná o velmi jednoduchou metodu, stále se hojně používá při vývoji nových léčiv, jako orientační zkouška vazebnosti léčiv na bílkoviny. Dále se s touto technikou můžeme setkat i v klinické praxi a to při terapeutickém monitorování léčiv, farmakokinetických i farmakodynamických klinických studiích. V minulosti se tato technika používala třeba k určování vazebnosti antibiotik na sérové proteiny. [20, 29] Nevýhody této metody jsou obdobné jako u centrifugace, můžeme se setkat s Donnanovým efektem, prosakováním proteinů přes filtr, ale také i s nespecifickou vazbou sloučenin na filtr. Někteří vědečtí pracovníci dokonce spekulují o negativním vlivu pozitivního tlaku na ustanovení rovnováhy. [29] Ultracentrifugace (UC) Ultracentrifugace je jistou obdobou centrifugace s tím rozdílem, že tato technika vyžívá mnohem větší sílu k rozdělení frakcí a nepoužívá žádné filtry. Opět smísíme roztok léčiva s krevní plazmou a umístíme je do centrifugy. Na vzorky působí obrovská síla, která způsobí usazení bílkovin a komplexu léčivá látka-protein, volnou frakci léčiva pak můžeme detekovat v supernatantu, protože jeho sedimentační koeficient je v porovnání se sedimentačním koeficientem proteinů a komplexu značně menší. Po dobu několika hodin na vzorky působí obrovská síla v řádu g, kde g značí gravitační zrychlení. Byla takto zkoumána např. vazebnost ibuprofenu. [20, 29] Velkou výhodou této techniky je, že se nemusíme obávat nežádoucí adsorpce látky na filtrační membránu ani Donnanova efektu. Ale na druhou stranu je zase pořízení vybavení nutného pro realizaci této metody finančně náročné v porovnání s rovnovážnou dialýzou nebo ultrafiltrací. Navíc existují i další nevýhody spojené s touto metodou jako např. možná sedimentace léčiva a zpětná difúze. V porovnání s rovnovážnou dialýzou jsou výsledky odlišné, u léčiv s velkou molekulovou hmotností (nad 1000 Da) se mohou lišit až o 40 %. [29] Gelová filtrace (GF) Vzhledem k četným nevýhodám je tato technika v praxi používaná jen velmi zřídka. Jde o metodu poměrně dost složitou a časově náročnou, na druhou stranu nám k provedení měření stačí malé objemy krevní plazmy. [20]

37 30 Na chromatografickou kolonu naneseme testovaný vzorek plazmy a necháme ho protékat. Na konci eluce změříme koncentraci vzorku v eluátu. Disociaci komplexu léčivo-bílkovina v koloně je zabráněno tak, že je ligand v koloně neustále udržován v rovnováze. Komplex je vymýván roztokem ligandu, jakmile se začne eluovat nenavázané léčivo, zaznamená se to na chromatogramu jako rostoucí pík. [20] V minulosti se pomocí této metody určovala vazebnost např. benzodiazepinů, salicylátů nebo bilirubinu u novorozenců. [20] Metoda využívající vazbu léčiv na mikrosféry albuminu (MA) Jedná se o nenáročnou metodu, která však neposkytuje precizní výsledky. Z tohoto důvodu se používá spíše k ověření, zda se požadované léčivo na albumin váže nebo jestli můžeme očekávat nějakou interakci mezi látkou a vazebným místem. Další nevýhodou je, že můžeme zjistit, jak se léčivo váže pouze na molekulu albuminu, dále tato technika nesimuluje fyziologické podmínky v těle. [20] Při vlastním měření se pak postupuje tak, že se připraví suspenze albuminových mikrosfér v pufru a ta se následně přenese do injekční stříkačky, která má na jednom svém konci klasický píst a na druhém porézní kotouček. Suspenze se nechá po určitou dobu inkubovat, aby se ustanovila rovnováha. Až je vše připraveno, protlačíme suspenzi skrz kotouček a ve vyteklé tekutině potom změříme koncentraci léčiva. Albuminové mikrosféry zůstanou zachycené na filtru. [20] Zkouška s paralelní umělou membránou (UM) Tato metoda byla původně vyvinuta pro zkoumání, zda jsou látky schopné pasivní difúze přes biologické membrány. Zařízení se skládá ze dvojice desek po 96 jamkách pokrytých umělou membránou, aby se od sebe obě desky oddělily. Jamky jedné desky jsou naplněné pouze pufrem a jamky druhé pufrem s látkami, které se mají otestovat. Princip této metody spočívá v tom, že pouze nevázané léčivo může prostupovat skrz tuto membránu, zatímco bílkoviny ani jejich komplexy s léčivem nemohou. Semipermeabilní membrána nemusí být pevná, může to být i kapalina (třeba 1-oktanol). [29] Zkouška s paralelní umělou membránou má několik výhod: v porovnání s klasickou rovnovážnou dialýzou je tato metoda rychlejší a nedochází ke změnám objemů pufru v jamkách (umělá membrána totiž není schopná propouštět vodu). [29]

38 31 Techniky kapalinové chromatografie (KCH) Tyto metody dělíme do dvou hlavních skupin a to podle toho, jestli obě látky (tj. bílkovina a léčivo) jsou v koloně volně nebo je jedna látka zakotvena ve stacionární fázi. V prvním případě se jedná o rozdělení podle hmotnosti molekul nebo přesněji podle hydrodynamického objemu a v tom druhém o afinitní chromatografii. U obou postupů můžeme ke stanovení asociační konstanty použít jak zonální eluci (kde využíváme buď retenční čas, nebo plochu píku), tak frontální analýzu. [29] Chromatografie rozdělující složky na základě molekulové hmotnosti Jak již bylo řečeno při použití této metody, jsou molekuly v roztoku rozděleny podle své velikosti. Roztok zkoumaných látek tedy léčiva a bílkoviny nastříkneme na kolonu a necháme eluovat. Kolona je naplněna částicemi s malými otvůrky, do kterých se mohou dostat jenom ty molekuly, jejichž velikost je menší než průměr otvoru. Jinak řečeno u správně zvolené kolony se dovnitř částic dostanou pouze molekuly léčiva. Bílkoviny a komplexy léčivo-bílkovina jsou větší než póry a tudíž dovnitř neproniknou. Budou se tedy eluovat jako první a samotné léčivo až v další fázi. [29] Tato technika je v současnosti využívána pouze zřídka hlavně pro své nevýhody, jako je např. nízká účinnost, špatné obnovení proteinu a nízká životnost chromatografických kolon. [29] Na obr. 7 je zjednodušeně znázorněn princip chromatografie rozdělující jednotlivé složky na základě jejich velikosti. Bílé kuličky představují porézní výplň kolony, zeleně je vyobrazeno léčivo, které může pronikat póry a také se může vázat na povrchu bílkovin a žlutě jsou vybarveny bílkoviny. První obdélník znázorňuje stav hned po nástřiku a druhý v pokročilém stádiu rozdělování, zde je patrné pozdržení molekul léčiva, které nejsou vázané na proteiny.

39 32 Obr. 7 Princip chromatografie rozdělující jednotlivé složky na základě jejich velikosti Vysokoúčinná afinitní chromatografie (HPAC) Kolona je u této metody naplněna nosičem se zakotvenými molekulami proteinu a vstřikují se roztoky léčiv. Ta léčiva, která mají k bílkovině afinitu, se na ni navážou a budou se z kolony eluovat později než látky, které mají afinitu nižší nebo dokonce žádnou. [29] Velkou výhodou HPAC techniky je nízká spotřeba bílkoviny. Na provedení testů je potřeba pouze malé množství a navíc můžeme otestovat vzorků bez nutnosti výměny proteinu, můžeme zkoumat i oba enantiomery u opticky aktivních látek. Také je zde možnost automatizace procesu. [29] Ale i tato metoda má i své limity. Asi nejdůležitějším omezením je právě imobilizace proteinu, protože nesimuluje fyziologické podmínky v organismu. Přestože mezi různými způsoby ukotvení jsou podstatné rozdíly, nikdy si nemůžeme být zcela jisti, zda se bude zkoumaná bílkovina chovat stejně, když bude v roztoku, jako tomu je v krvi, a když bude ukotvena v koloně. Může být ovlivněna prostorová orientace proteinu, některá vazebná místa mohou být imobilizací stericky zablokovaná a také může dojít až k denaturaci proteinu. Kromě toho imobilizace bílkoviny může ovlivnit i afinitu léčiva k bílkovině, ať už pozitivně nebo negativně. Protože i látky, které se používají k ukotvení bílkovin, mají schopnost nespecificky vázat léčiva, což zkresluje výsledky vazebnosti slabě se vázajících látek. Ale ani se silně se vázajícími látkami to není úplně jednoduché, protože při testování se používají speciální

40 33 organické látky, které ovlivňují vazbu léčiva na protein změnou jeho konformace. Tím se opět zkreslují výsledky. [29] Naprostá většina takovýchto pokusů se provádí s využitím lidského sérového albuminu. Už byly navrženy a optimalizovány postupy i pro α 1 -kyselý glykoprotein a slibné výsledky mají vědci i s HDL. [29] HPAC se provádí nejčastěji jako zonální eluce, kdy zaznamenáváme retenční čas zkoumaného léčiva (t r ) a retenční čas látek, které nejsou zadržovány (t m ). S jejich využitím jsme potom schopni vypočítat retenční faktor (k ) podle vzorce: [29] " = R? I I Mezi vztahem & -5 & a procenty vázaného léčiva byla objevena silná korelace, pokud tedy sestrojíme křivku s pomocí několika známých údajů, můžeme pak snadno vypočítat procento vazebnosti u zkoumané léčivé látky. [29] Frontální eluce se provádí tak, že kolona neustále promývá roztokem ligandu a monitoruje se množství vyteklého léčiva. Saturace proteinu se projeví na křivce jako její prudký vzestup. Pokud jsou pokusy prováděny s různou koncentrací léčiva, lze potom vypočítat asociační konstantu, protože existuje korelace mezi koncentrací ligandu, množství bílkoviny v koloně a asociační konstantou. [29] Metody kapilární elektroforézy (KE) Obecně můžu výhody kapilární elektroforézy shrnout takto: vysoká specifita a efektivita, malé nároky na množství materiálu, vysoká rychlost analýzy, možnost automatizace a možnost pracovat za podmínek blízkých fyziologickým (co se týče ph a iontové síly). [29] Tyto metody nemají jen kladné stránky, existují i nějaké nevýhody: riziko adsorpce bílkovin na stěnu kapiláry a nízké limity pro detekci u běžně používaných UV detektorů. To ovšem lze obejít, pokud použijeme jiný typ detektoru a to takový, který funguje na principu laserem indukované fluorescence, ale jen malé množství látek je schopné fluorescence a proto se musí předem označit. To ale může zkreslit výsledky měření. Další možností detekce je hmotová spektrometrie. [29]

41 34 Stejně jako v případě kapalinové chromatografie i tyto techniky se dají provést několika způsoby. Prvním z nich je frontální analýza, kde vstřikujeme velké množství roztoku bílkoviny a léčiva. Mezi další způsoby řadíme zonální eluci, kde máme několik možností realizace. Můžeme si vybrat z těchto postupů: do kapiláry, kde je čistý pufr, vstříkneme směs bílkoviny a léčiva, nebo v kapiláře už může jeden z vazebných partnerů být a druhý je v pufru, nebo v kapiláře může být jak testované léčivo, tak protein a používá se pak jen čistý pufr. Mezi nejčastěji využívané postupy kvůli své jednoduchosti a spolehlivosti patří kapilární elektroforéza/frontální analýza (KE/FA) a afinitní kapilární elektroforéza. [29] U KE/FA se postupuje tak, že se nejprve v roztoku smísí protein a léčivo, počká se do ustálení rovnováhy a pak se vstříkne dostatečné množství roztoku do kapiláry. Když se mobilita proteinu rovná mobilitě komplexu protein-léčivo, výška ustálené hladiny volného léčiva je přímo úměrná koncentraci volného léčiva v původním vzorku. Pokud takováto měření několikrát zopakujeme s různým množstvím bílkoviny a léčiva, můžeme pak z grafu nelineární regrese zjistit asociační konstantu i stechiometrii reakce. [29] Při použití afinitní kapilární chromatografie je kapilára naplněná pufrem s proteinem a dovnitř je vstřikováno léčivo. Opět provedeme několik měření s různým množstvím léčiva a bílkoviny, abychom mohli sestrojit graf nelineární regrese, z něj potom lze vypočítat asociační konstantu, avšak stechiometrii reakce pomocí této techniky neurčíme. [29]

42 Neseparativní metody Spektroskopické techniky (ST) Spektroskopické metody jsou založeny na detekci změn energetických hladin. Existují různé druhy těchto technik: UV-VIS, IR, fluorescenční, nukleární magnetická rezonance, optická rotační disperze a cirkulární dichroismus. Tyto metody jsou v současné době poměrně oblíbené, často se spolu s výpočetními metodami používají k přesnému odhadu interakcí. [29] Umožňují nám představit si trojrozměrnou strukturu bílkoviny, a jaké změny ve struktuře vyvolá navázání ligandu. Změny v UV/VIS spektru si lze vyložit jako změny v polaritě vazebných míst na molekule. IR se používá ke studiu sekundární struktury proteinu. S využitím fluorescenční spektroskopie můžeme odhalit některá vazebná místa a také vypočítat vzdálenost mezi léčivem a chromatoforem na bílkovině. Nukleární magnetická rezonance nám zase může poskytnout informace o tom, jaké struktury se zapojují do vazby mezi léčivem a proteinem. [29] Spektroskopické techniky se používají hlavně při určování vysoce se vázajících se látek. Jejich nevýhodou je nízká citlivost, musí se proto používat relativně vysoké koncentrace, což muže mít za následek problémy s rozpustností a mohou se rovněž vyskytnout i nespecifické agregace. [29] Cirkulární dichroismus (CD) Cirkulární dichroismus neboli kruhová dvojbarevnost je metoda založená na měření změn absorbance nebo fluorescence opticky aktivního léčiva vázaného na molekule albuminu. Právě vazba léčiva na albumin vyvolá změnu Cottonova efektu a tím dojde ke změně absorbance nebo fluorescence normálního kruhového spektra bílkoviny na eliptické. Tato technika nám poskytuje informace o trojrozměrné struktuře vazebného místa. [20, 29] Takto byla zkoumaná např. vazebnost různých benzodiazepinů, u některých včetně vlivu ph na jejich vazebnost. [20] Kalorimetrické techniky (KT) Co se týče kalorimetrických metod, používají se dvě hlavní techniky a to izotermická titrační kalorimetrie a diferenciální skenovací kalorimetrie. Tyto techniky nám poskytují termodynamický přehled o průběhu celé reakce. Můžeme pomocí nich

43 36 změřit spoustu termodynamických parametrů jako je změna Gibbsovy energie, entalpie a entropie, dále také asociační konstantu a stechiometrii reakce. Právě s využitím termodynamických dat jsme schopni odvodit interakční mechanismus. [29] Izotermická titrační kalorimetrie Jedná se o nejvíce používanou techniku ke zkoumání interakcí mezi látkami. V podstatě jde o to, že se monitoruje změna tepla. Postupuje se tak, že se do měřící cely dá roztok bílkoviny a postupně se přidává roztok léčiva. Po každém přidání se pečlivě zaznamená, kolik tepla se uvolnilo. Jak se formují komplexy mezi léčivem a bílkovinou, dochází k uvolňování tepla. [29] Jako každá metoda i izotermická titrační kalorimetrie má svá pozitiva i negativa. K silným stránkám patří např. to, že můžeme takto měřit látky libovolné velikosti, proteiny nemusí být nijak upravené, ani nemusí být ukotvené. Mezi negativa pak řadím to, že takto nelze stanovovat vazebnost léčiv, která se vážou příliš málo nebo naopak příliš hodně, dále spotřeba materiálu je poměrně vysoká a provedení přesné titrace trvá i několik hodin. [29] Tato technika patří mezi oblíbené i v chemických laboratořích zabývajících se výzkumem nových léčiv. Např. se vědci snaží vyvinout nové vysoce účinné inhibitory HIV-1 proteázy. [29] Diferenciální skenovací kalorimetrie Tato technika byla původně navržena ke stanovení stability proteinů, dá se však pomocí ní měřit i vazebnost léčiv na bílkoviny. Používané zařízení je velmi podobné tomu, jaké se používá při izotermické titrační kalorimetrii. Do reakční cely se však nalije roztok bílkoviny a léčiva, směs se pomalu zahřívá. Zahříváním dochází k denaturaci proteinu. Ligandy však preferují vazbu na nativní struktury, čímž je i stabilizují, a tak dochází k tomu, že přechodový střední bod nastává při vyšší teplotě než v nepřítomnosti molekul léčiva. Tento bod nám udává teplotu, při které je 50 % bílkovin v nativní a 50 % v denaturované formě. Při tomto postupu tedy můžeme asociační konstantu pouze nepřímo odhadnout podle denaturace proteinů. [29] Výhodou tohoto druhu kalorimetrie je možnost stanovit i vysoké asociační konstanty, které jiným způsobem nestanovíme. Nevýhodou však je nízký výkon a vysoká spotřeba materiálu. [29]

44 37 V praxi není diferenciální skenovací kalorimetrie příliš využívaná. Studie však prokázala, že existují rozdíly mezi vazebností plazmatických bílkovin u zdravého a nemocného člověka. Plazma zdravého člověka má vždy stejný termogram, odlišný od termogramu nemocného. Proto by se tato metoda dala do budoucna využít jako screeningový nástroj. [29] Zkoušky založené na povrchové plazmonové rezonanci (PPR) Při této technice je bílkovina pevně ukotvená a přes její povrch je přeléván roztok s léčivem. Měří se změny v refrakčním indexu, které nastávají díky tomu, jak se tvoří nebo zanikají komplexy mezi proteinem a ligandem. Z výsledných křivek se pak dá určit, zda se komplex formuje, je dosažena rovnováha nebo dochází k jeho rozpadu. Také lze zjistit stabilitu vzniklého komplexu a stechiometrii reakce. [29] Silné stránky této techniky spočívají v tom, že není nutné zkoumané látky nijak označovat, můžeme získat kvantitativní informace o vazbě (tj. asociační a kinetickou rychlostní konstantu) a také nízká spotřeba použitého materiálu. Navíc můžeme pomocí této techniky stanovit široký rozsah afinitních a rychlostních konstant. [29] Změna refrakčního indexu je lineárně závislá na molekulové hmotnosti zkoumaného léčiva. Proto není příliš rozumné pomocí této metody stanovovat vazebnost příliš malých molekul, výsledná data by nebyla dokonale spolehlivá. K dalším nevýhodám této techniky lze zahrnout průměrný rychlostní výkon a tedy nevhodnost při analýze většího množství sloučenin. U zařízení s vyšším výkonem je zase problém s údržbou a vysokými náklady na pořízení zařízení. [29]

45 Radiochemická čistota Radiochemická čistota je v Českém lékopise 2009 definována takto: Radiochemická čistota je poměr radioaktivity daného radionuklidu přítomného v radiofarmaku v určité chemické formě a celkové radioaktivity tohoto radionuklidu, vyjádřené v procentech. Radiochemická čistota musí být stálá a vyhovovat po celou dobu použitelnosti radiofarmaka. [16] Radiochemické nečistoty se mohou v přípravku nacházet už od výroby, v důsledku následných chemických postupů třeba díky působení rozpouštědla, světla a tepla. Další důvody jsou nedokonalá separace látek nebo kvůli možným chemickým změnám během skladování. [8a, 16] Stanovení radiochemické čistoty se provádí pomocí libovolné analytické separace. Lze využít jak plynovou, tak kapalinovou, tenkovrstvou nebo i papírovou chromatografii. Při použití posledních dvou výše jmenovaných metod lze detekci aktivity provést pomocí vhodného detektoru, kterým se měří aktivita podél celé délky chromatogramu. V případě papírové chromatografie můžeme vysušený proužek papíru nastříhat a aktivitu změřit u každého kousku zvlášť. Papírová a tenkovrstvá chromatografie jsou používány nejčastěji vzhledem k rychlosti a jednoduchosti zkoušky. [8a, 16] Pro stanovení radiochemické čistoty léčiv značených 99m Tc se používá zpravidla tenkovrstvá chromatografie. Technecium se může v přípravku vyskytovat v požadované formě komplexu, dále jako technecistan a jako redukované hydrolyzované technecium. Při vývoji chromatogramů se dá použít jak vodná, tak organická fáze. Pokud použijeme vodnou fázi, s čelem chromatogramu se nám bude pohybovat technecistan a komplex s léčivem, redukované technecium zůstane na startu. Pokud ale použijeme organickou fázi, s čelem se bude pohybovat technecistan a 99m Tc-komplex a redukované hydrolyzované 99m Tc zůstanou na startu. Po změření aktivity příslušných částí, můžeme radiochemickou čistotu vypočítat podle následující rovnice: [8a] lpqc+h$q+"á čqs,c, = 100 %u ww ww v+ x y % v+x.

46 m Technecium 99m Technecium je čtyřicátý třetí prvek periodické tabulky prvků, který patří do VII. B skupiny. Jedná se o jeden z nejčastěji používaných radionuklidů v medicíně. Je vhodné hlavně díky svému ideálně dlouhému poločasu, který je v tomto případě šest hodin. Další jeho výhodou je nízká energie γ záření pouze 140 kev. Absorbovaná dávka radiace je tedy relativně nízká. Podléhá radioaktivní přeměně γ, typu izomerický přechod. Předchozí radioaktivní přeměnou 99 Mo vzniká energeticky vzbuzené jádro 99m Tc, které přebytek energie vyzáří a přejde tím do svého základního stavu 99 Tc. Znázorňuje to následující rovnice, dále je zde vidět rozklad 99 Tc -β přeměnou na již stabilní 99 Ru. Hodnoty pod šipkou znamenají poločasy přeměny jednotlivých radionuklidů. [1, 8c] ww Mo β 67h wwƒ Tc IP 6h ww Tc β 2,12 10 let ww Ru 99m Tc se získává z molybdenotechneciového generátoru, jehož základ tvoří kolonka s oxidem hlinitým a adsorbovaným molybdenanem amonným ( 99 Mo). V této kolonce dochází k radioaktivní přeměně molybdenanu na technecistan ( 99m Tc) podle níže uvedené rovnice. [8b, 8c] R 99 2 MoO 4 R + + R 99m TcO 4 Uvolněné technecium je z kolonky vymýváno pomocí elučního činidla, což je izotonický roztok chloridu sodného. Získané technecium je v oxidačním stupni VII a právě tento stupeň je nejstabilnější. Z toho důvodu je nutné technecistan zredukovat na reaktivní formu nejčastěji v oxidačním stupni IV. Redukce se provádí pomocí solí kovů (typicky SnCl 2. 2H2 O). Lze použít některé hydridy nebo halogenvodíkové kyseliny. Následující rovnice ukazuje průběh redukce technecistanu s pomocí nadbytku cínatých kationtů v kyselém prostředí. [8b] 2 99m TcO H + + 3Sn m Tc Sn H 2 O Technecium se na námi požadované organické látky váže především s využitím bifunkčních chelátů (nejčastěji se k tomu účelu používá EDTA), které jsou schopné vázat jak organické léčivo, tak i technecium. Ve vodných roztocích podléhá volné 99m Tc 4+ hydrolýze a vzniklé produkty představují spolu s technecistanem možné radiochemické nečistoty. Radiochemická čistota bývá zpravidla kolem 95 %. [8b]

47 Alzheimerova nemoc Definice Alzheimerova nemoc patří do skupiny degenerativních onemocnění centrální nervové soustavy. [13, 15, 18] Poprvé byly symptomy nemoci popsány v roce 1907 německým lékařem Aloisem Alzheimerem, odtud i název v současnosti tolik obávané choroby. Při tomto onemocnění dochází k postižení kognitivních funkcí (jako je vnímání, úsudek a myšlení) a spíše krátkodobé než dlouhodobé paměti, někdy mohou být postiženy i funkce motorické a pacient může působit dojmem jako by trpěl Parkinsonovou chorobou. [13] Nemocní postupně čím dál více zapomínají, těžko hledají slova i pro běžné předměty, hůře rozumí řeči. U pacientů může také docházet ke změnám v chování. Nedochází k poruchám vědomí. [2, 13, 15, 18] Epidemiologie, etiopatogeneze Jedná se o nejčastější typ demence vůbec, tvoří asi 60 % případů. [18] Alzheimerova nemoc je čtvrtou až pátou nejčastější příčinou úmrtí pacienta. Ve vyspělých zemích se vyskytuje asi u 2,5 % pacientů mezi 65 a 70 lety, s postupujícím věkem pacientů přibývá (po 85. roce života je až % postižených lidí). Přitom degenerativní proces začíná už zhruba let před tím, než se objeví první klinické příznaky nemoci. Choroba se však může objevit i před 65. rokem věku to bývá podmíněno genetickou zátěží u nemocných můžeme objevit poruchy určitých genů na chromozomech 1, 12, 14, 19, nebo 21. U lidí s Downovým syndromem tedy s trisomií 21. chromozomu se už po 35 letech života začnou rozvíjet chorobné změny jako u pacientů s Alzheimerovou nemocí (AN). Mezi rizikové faktory patří již zmíněný věk, dále ženské pohlaví (AN tvoří až 70 % demencí u žen), kde je výskyt až 2 častější a rodinná zátěž, na rozvoj onemocnění mají pravděpodobně vliv i faktory z vnějšího prostředí jako např. stres, viry a toxiny. [10, 13, 15, 18, 25, 26, 28] Obr. 8 Srovnání mozku zdravého člověka s mozkem člověka postiženého Alzheimerovou nemocí U pacientů s Alzheimerovou chorobou nacházíme dobře patrnou atrofii mozku. Zmenšují se gyry

48 41 a naopak se rozšiřují rýhy, ubývá mozková kůra a zvětšují se mozkové komory, snižuje se objem bílé hmoty. [13] Nejvíce degenerativních změn nacházíme v lalocích frontálních, temporálních a parietálních, mozeček a mozkový kmen nebývají postiženy. Tato degenerace je přehledně znázorněna na 11 obr. 8, kde je vyobrazen průřez zdravým mozkem (vlevo) a mozkem pacienta s Alzheimerovou nemocí (vpravo). Váha takto postiženého mozku může klesnout až pod 900 g, přičemž normální hmotnost je kolem 1300 g u žen a 1400 g u mužů. [13, 22] Také mikroskopicky můžeme pozorovat v nervových buňkách řadu změn. Jsou to v první řadě tzv. senilní drúzy, dále pak v cytoplazmě neuronů můžeme také objevit neurofilbrily z fosforylací změněného τ-proteinu (ten za normálních okolností stabilizuje neurony), které se mohou omotávat kolem jádra buňky a Hiraniho tělíska, což jsou vakuoly s jemně granulovaným útvarem ve svém středu. [10, 13, 15] Hiraniho tělíska se objevují hlavně u neuronů, které produkují acetylcholin, dochází k poškození hipokampu a spánkového laloku. Někdy můžeme pozorovat i tzv. Lewyho tělíska, která jsou však typická pro Parkinsonovu nemoc. Jedná se o koncentricky vrstvené eozinofilní inkluze, které se nacházejí v cytoplazmě některých nervových buněk. [10, 13, 15] Senilní drúzy nebo také senilní plaky se mohou vyskytovat i u osob bez Alzheimerovy nemoci, ale právě jejich četnost je pro nemocné charakteristická. Jedná se o okrouhlá, neostře ohraničená ložiska dystroficky pozměněných dendritů a axonů o průměru asi 100 µm. Základ těchto ložisek tvoří patologický protein β-amyloid, ten však lze u postižených nalézt i na jiných místech v těle (třeba v měkkých plenách nebo v cévách parenchymových orgánů). Prekurzor β-amyliodu je odbouráván různými druhy enzymu sekretázy. S využitím α-sekretázy se tvoří rozpustný protein s neuroprotektivními vlastnostmi. Působením β- a γ-sekretázy na prekurzor dochází ke vzniku β-amyloidu, který v rozpustné formě nevykazuje neurotoxické účinky. Zřejmě díky genové mutaci se začne tvořit místo rozpustné formy forma vláknitá, která rozpustná není a poškozuje nervové buňky. Vznik těchto tzv. senilních plaků bývá předstupněm zániku nervové buňky. Fibrily β-amyloidu mohou reagovat s některými 11 Obr. 8 převzat z: TopNews [online] [cit ]. Health News and Updates. Dostupné z WWW: <

49 42 povrchovými receptory na neuronech, které mohou vyvolat vnitrobuněčné zvýšení koncentrace Ca 2+ a tím dochází k podpoře apoptózy neuronů. V mikrogliálních buňkách vazba fibril na tyto receptory vyvolá tvorbu prozánětlivých působků a vzniklý zánět opět poškozuje neurony. [13, 15, 22, 25] Bylo zjištěno, že přítomnost viru herpes simplex v mozku lidí, kteří mají genetické predispozice pro rozvoj Alzheimerovy choroby, výrazně zvyšuje riziko vzniku nemoci. Právě v přítomnosti viru dochází k hromadění jak β-amyloidu, tak τ-proteinu. Navíc byl virus detekován i v amyloidních placích. Nabízí se tedy možnost, že nasazení antivirotik může postup onemocnění zpomalit. Proto byl zkoumán in vitro účinek několika antivirotik fungujících na principu narušení syntézy virové DNA. Nakonec se ukázalo, že v přítomnosti antivirotik byla akumulace obou proteinů menší. Takže ve výsledku jsou antivirotika pro určitou skupinu pacientů s Alzheimerovou chorobou novými nadějnými léky na zpomalení postupu choroby. [21] Na chromozomu 19 se vyskytuje gen kódující apolipoprotein E (apoe), tento gen je nejnáchylnější k mutaci, defektní se vyskytuje u běžného typu AN s pozdním nástupem. V současné době se hromadí poznatky o tom, že různé izoformy apoe mají různý vliv na agregaci β-amyloidu a mají tudíž veliký vliv na patogenezi Alzheimerovy nemoci. ApoE se váže na protein 1 spojený s LDL receptorem (LDL receptor-related protein 1) a také na receptory pro LDL, které regulují metabolismus LDL cholesterolu, jejich role v CNS je však zatím stále nejasná. [6] Výsledky studií na myších jsou rozporuplné, v jedné studii bylo dokázáno, že nedostatek LDL receptorů nemá žádný vliv na vznik plaků, přitom výsledky druhé studie byly přesně opačné. Větší počet studií se však přiklání k názoru, že existuje korelace mezi počtem LDL receptorů (LDL-R) a tvorbou senilních plaků. Řečtí badatelé v nedávno provedené studii potvrdili, že nedostatek LDL-R má za následek vyšší výskyt depozit β-amyloidu v oblasti hipokampu. [6] V mozku nemocného Alzheimerovou chorobou ubývají nervové buňky a dochází tak i poklesu tvorby neurotransmiterů, především acetylcholinu (ten vzniká působením acetylcholintransferázy z acetylkoenzymu A a cholinu). [10, 15, 25] V hipokampu a mozkové kůře nacházíme až o 90 % méně acetylcholintransferázy, dochází i k poklesu počtu cholinergních receptorů. Ale klesají i koncentrace ostatních neurotransmiterů jako např. noradrenalinu, serotoninu nebo somatotropinu. [10, 15, 25]

50 43 Rozlišujeme dva druhy esteráz, které rozkládají acetylcholin (ACH) a to acetylcholinestrázu (ACHE) a butyrylcholinesterázu (BCHE). Obě esterázy jsou schopné rozložit až molekul acetylcholinu za sekundu. ACHE nacházíme především v neuronech a selektivně hydrolyzuje ACH (schéma je znázorněno níže). Zatímco BCHE se nachází hlavně v gliových buňkách a může rozkládat i jiné substráty ne jen acetylcholin. Podle nových poznatků bylo zjištěno, že BCHE hraje důležitou roli v transformaci rozpustného β-amyloidu na nerozpustný. V mozku zdravého člověka se BCHE podílí pouze na 20 % cholinesterázové aktivity, kdežto u jedinců s Alzheimerovou nemocí to může být až 45 %, progrese onemocnění se pak dá určit s poměru aktivit obou esteráz. [15] Klinický obraz Ještě než se začnou objevovat typické znaky choroby, nemocní procházejí bezpříznakovým obdobím, kdy jsou využívány mozkové rezervy. Později se začnou projevovat kognitivní poruchy, poruchy paměti a postupný rozpad osobnosti nemocného. Progrese onemocnění bývá různě rychlá, většinou po 5 15 letech jsou pacienti v tak pokročilém stádiu nemoci, že nezvládají ani jednoduché úkony a jsou plně odkázaní na pomoc svého okolí. [13, 18] V počátečním stádiu jsou nemocní zapomětliví zapomínají jména, méně obvyklá slova, nevědí, kam si položili své věci a podobně. Špatně se učí nové věci, ale starší informace si vybavují relativně bez obtíží. Pacienti jsou však ještě plně samostatní. [18] Ve středně těžkém stádiu onemocnění je na tom pacient poněkud hůře. Je postižena i dlouhodobá paměť, nemocní si pamatují jen velmi dobře vštípené znalosti, nepoznávají dobře známá místa, jsou dezorientovaní a často ani jména svých známých si nevybavují. Už téměř nejsou schopni naučit se novým věcem, vstřebat nové informace, pokud se jim to přeci jen povede, je to pouze chvilková záležitost. Pacientova samostatnost je velmi vážně omezená. [18] V pozdním stádiu všechny předcházející symptomy dále progredují. Nemocný trpí úplnou ztrátou paměti, není schopen se naučit vůbec žádné nové věci, nepoznává ani své blízké. Pacienti jsou tak plně odkázáni na pomoc svého okolí, nejsou schopni se o sebe sami postarat. [18]

51 44 Progrese a výskyt poruch ostatních kognitivních funkcí bývá různá, u některých pacientů se mohou vyskytnout již na počátku nemoci, jindy až v pokročilejším stádiu nemoci. Mezi tyto symptomy patří plynulost řeči a její porozumění a zrakoprostorová orientace. Postupně je omezena i cílená činnost, řešení problémů a schopnost pracovat. Nemocní jsou emočně labilní, může se u nich objevit i deprese, úzkost s agresivitou, jindy zase apatie. V pokročilejších stádiích se mohou přidat i psychotické projevy jako halucinace, paranoidita a bludy. Dále se mohou objevit také symptomy extrapyramidové jako třeba poruchy chůze nebo svalové záškuby. [18] Diagnostika Diagnóza Alzheimerovy choroby je velmi náročná a doposud nebyla objevena žádná metoda, která by toto onemocnění dokázala spolehlivě potvrdit. [15] Klinické vyšetření Při diagnostikování Alzheimerovy nemoci je nutné vyloučit ostatní možné příčiny demence, to může být např. Huntingtonova choroba, Parkinsonova nemoc a mnohé další. K orientačnímu vyšetření pacienta se používá jednoduchý test, kdy se nemocnému kladou jednoduché otázky, které jsou zaměřené na paměť pacienta, jeho orientaci jak prostorovou, tak i časovou, poznávání běžných předmětů. Aby bylo možné pacientovo postižení považovat za demenci, jeho nález musí být jednak objektivní, jednak se musí prokázat, že nemocného omezuje v běžném životě a při práci. Symptomy musí u pacienta přetrvávat nejméně šest měsíců. Podezření musí být potvrzeno pomocí testu kognitivních funkcí tzv. MMSE (Mini Mental State Examination), v němž pacient odpovídá na řadu otázek a jednoduchých úkolů týkajících se orientace v čase a prostoru, krátkodobé paměti, pozornosti a schopnosti komunikace. Diagnóza se zakládá na standardizovaných diagnostických kritériích, které jsou uvedeny v následující tabulce (tab. 2). [15, 18]

52 45 12 Tab. 2 Diagnostická kritéria Demence je syndrom globálního kognitivního úbytku tvořený 1. poruchou paměti a 2. nejméně jednou z následujících funkčních poruch: porucha abstraktního myšlení (např. určení podobností a rozdílů mezi slovy, definice pojmů), porucha úsudku a plánovité činnosti, afázie, apraxie, agnózie, porucha zrakoprostorových funkcí, změna osobnosti, 3. kognitivní úbytek je natolik závažný, že narušuje denní činnosti, profesní nebo společenské aktivity nemocného a 4. znamená pokles oproti předchozí vyšší funkční úrovni. V další fázi se určuje, jak pacient zvládá aktivity z běžného života, zahrnuje to např. plnění pracovních úkolů a slibů. V pokročilejších stádiích nemoci se pak zkoumá schopnost pacienta provádět naprosto běžné denní činnosti, jako je samostatná hygiena, oblékání a dokonce i schopnost sám se najíst. [15] Existují samozřejmě i další metody diagnostiky, ty nám umožňují odhalit léčitelné příčiny nemoci. Mezi ně patří biochemická a hematologická vyšetření, zobrazení mozku, EEG, vyšetření možných dědičných chorob, EKG, biopsie a mnohá další. [18] Zobrazovací metody Zobrazovací metody jsou neinvazivní, jejich nález však není příliš specifický. S využitím těchto metod lze identifikovat dysfunkce mozku a neuronální degeneraci. Pomocí CT můžeme určit, zda se v mozku pacienta nalézá nějaká morfologická změna. Zobrazení pomocí magnetické rezonance nám umožňuje studovat cerebrální morfologii, bílou hmotu a také cévní patologii, rovněž jsme schopni s využitím této technologie rozlišit mezi jednotlivými druhy demence. Pokud nalezneme atrofii mozku především v oblastech hipokampu nebo temporálního laloku, je pravděpodobnost Alzheimerovy choroby vysoká. [15, 18, 26] 12 Tab. 2 převzata z NEVŠÍMALOVÁ, Soňa, et al. Neurologie. 1. Praha: Galén, Alzheimerova nemoc a jiné demence, s. 189.

53 46 Použití radiofarmak je při diagnostice Alzheimerovy choroby velmi důležité, je totiž možné zaznamenat patologické náznaky ještě dříve, než se objeví první klinické příznaky nemoci. [15] Díky tomu lze zpomalit progresi onemocnění a prodloužit dobrou kvalitu života pacientů. Nukleární magnetická rezonance funguje na principu pohlcení elektromagnetického záření (o frekvenci mhz) jádrem atomu, který díky tomu rezonuje tedy pokud se jedná o atomové jádro s magnetickým momentem. [15] Pomocí technik PET a SPECT jsme schopni najít místa s odlišným metabolismem v mozku včetně metabolismu neuromediátorů. U Alzheimerovy nemoci můžeme totiž pozorovat snížené prokrvení mozku a tím i snížený metabolismus glukózy a kyslíku v temporálním a frontální laloku a další abnormality v průtoku krve mozkem. [15, 18, 26] K diagnostice pomocí PET a SPECT metod se pacientům podávají malé dávky radioaktivních izotopů, nejčastěji to bývají 131 I, 201 Tl, 67 Ga a 99m Tc u metody SPECT. Léčivé látky, které se k takovému vyšetření používají, musí pronikat přes hematoencefalickou bariéru, musí tedy být dostatečně lipofilní, aby mohly proniknout do mozku a aby bylo možné s jejich pomocí odhalit přítomnost patologických oblastí. SPECT se nejčastěji používá u pacientů s podezřením na demenci, která ještě není diagnostikovaná. S využitím PET a SPECT jsme rovněž schopni odhalit přítomnost β-amyloidu a dokonce i určit jeho množství. [15, 18, 26] Za účelem zjištění průtoku krve mozkem se používají látky dimer L,L-ethylcysteinátu (ECD) a hexamethylpropylenamin oxim (HMPAO, exametazim), obě léčiva jsou značená 99m Tc. 99m Tc-HMPAO se už po dvou až pěti minutách po intravenózním podání dostává do mozku a zde vykreslí oblasti jak patologické, tak nepostižené. V patologických oblastech je zaznamenán snížený průtok krve a podle toho lze určit i rozsah postižení. Jako další se používá látka 123 I-IMP (N-isopropyl-p- [ 123 I]-jodamphetamin). [26] Metoda PET funguje na tom principu, že radioaktivně značené léčivo emituje pozitron, který spojí s opačně nabitým elektronem za současného vyzáření fotonu, je citlivější než SPECT. S využitím této metody můžeme také sledovat distribuci značené látky v těle, používají se fyziologické látky nebo jejich metabolity, které jsou značené pomocí prvku, který je důležitý pro metabolické procesy jako např. 11 C, 15 O, 18 F nebo 10 N. [15, 26] Používají se mimo jiné látky označené glukózou, slouží jako spolehlivé indikátory úrovně metabolismu v orgánech, konkrétně jde

54 47 o 18 F-deoxyglukózu. Ve výzkumu je použití radioaktivně značeného tacrinu nebo donepezilu při monitorování průběhu nemoci. [15, 26] Pomocí metod PET a SPECT můžeme také sledovat zvýšený influx Ca 2+ v postižených oblastech a odhalit tak jejich ložiska, najít poškozenou mozkovou tkáň nebo odumřelé mozkové buňky. [26] Jak již bylo řečeno výše, Ca 2+ se může hromadit v poškozených neuronech a urychlovat tak jejich zánik. Pacientům se podávají analogy Ca Co u SPECT vyšetření a 55 Co u PET. [26] Běžné použití těchto metod je omezeno vysokou cenou vybavení, zejména generátorů radioizotopů. [15] Neuropatologické nálezy Specifickým nálezem pro potvrzení Alzheimerovy nemoci jsou neurofibrilární klubka (ta jsou nejspecifičtější), senilní plaky, amyloidová angiopatie a úbytek neuronů. Vyšší výskyt β-amyloidu v mozkomíšní tekutině pouze diagnózu podporuje, není však specifickým. [18] Diagnostické markery Alzheimerovy nemoci informují o stavu a stádiu nemoci. Celkové množství τ-proteinu nám poskytuje informace o intenzitě neuronálního poškození a degeneraci. Markery stádia informují o pokročilosti degenerativního procesu. Sem lze zařadit zobrazení rozsahu atrofie hippokampu pomocí magnetické rezonance nebo počítačové tomografie. [26] Plaky β-amyloidu lze také zobrazit pomocí pozitronové emisní tomografie radioaktivně značené sloučeniny se navážou na nerozpustný β-amyloid. Takto je možno od sebe odlišit Alzheimerovu nemoc od frontotemporální demence a od nepostižených lidí. S využitím PET technologie lze za použití některých látek odhalit i chuchvalce τ-proteinu. [26] Léčba Kauzální léčba Alzheimerovy nemoci prozatím nebyla objevena. [15] Ve vývoji zatím jsou velmi nadějné skupiny léčiv, které fungují na principu inhibice tvorby toxického β-amyloidu. Slibné jsou i látky, které podporují metabolismus prekurzoru β-amyloidu pomocí α-sekretázy, nebo látky, které stimulují muskarinové M 1 receptory, což má za následek zvýšení tvorby rozpustného β-amyloidu a zároveň potlačení aktivity škodlivé β-sekretázy. Další možností je vývoj léčiv specificky inhibujících sekretázy β

55 48 a γ nebo látek, které působí proti agregaci β-amyloidu. Zatím všechny výše jmenované skupiny léčiv jsou stále ve výzkumu. [15] Inhibitory acetylcholinesterázy (ACHEi) Jedná se o skupinu léčiv, která zlepšuje hlavně paměťové funkce nemocných díky své cholinomimetické aktivitě. Tyto látky se v léčbě Alzheimerovy nemoci nejlépe osvědčily. Léčiva fungují na principu zablokování enzymu, který je zodpovědný za degradaci acetylcholinu, čímž zvyšují jeho koncentraci v synaptické štěrbině. [15] Látky této skupiny nejlépe fungují v počátečních stádiích nemoci. Inhibitory ACHE můžeme rozdělit do dvou základních skupin a to na reverzibilní a ireverzibilní podle toho, zda se enzym z komplexu vzniklého mezi léčivem a ACHE může obnovit. Třetí skupinu tvoří inhibitory quasiireversibilní k rozpadu komplexu sice dochází, ale je to až po dlouhé době. [10, 15] Následující rovnice (viz obr. 9) popisuje rozklad acetylcholinu na cholin a acetylovanou acetylcholinesterázu. Enzym se následně deacetyluje a může hydrolyzovat další molekulu ACH. Tento děj je velmi rychlý, trvá pouze několik milisekund. Pokud však použijeme inhibitor ACHE typu physostigminu, dojde ke karbamoylaci acetylcholinesterázy a tím k její několikahodinové obnově. [11] Obr. 9 Rovnice rozkladu acetylcholinu na cholin a acetylovanou acetylcholinesterázu Léčivé látky této skupiny nemají jednotou chemickou strukturu, mechanismus účinku ani selektivitu vůči ACHE a BCHE. [15]

56 49 První generace ACHEi Dříve byl hojně využívaný alkaloid physostigmin, izolovaný z rostliny Physostigma venenosum z čeledi Fabaceae, můžeme ho zařadit do skupiny quasiireverzibilních inhibitorů. Pro své hepatotoxické účinky se tato látka dnes již nepoužívá. U pacientů také vyvolával nežádoucí účinky neklid, úzkost a četné další nežádoucí účinky. [10, 15] Dalším léčivem této skupiny je tacrin. Patří mezi reverzibilní inhibitory s vyšší selektivitou právě k butyrylcholinesteráze. Ani tacrin se dnes nepoužívá z důvodu závažných vedlejších účinků jako je poškození kardiovaskulárního systému a také hepatotoxicita. [15] Druhá generace ACHEi Dnes mnohem více využívaný rivastigmin (derivát karbamové kyseliny) funguje na stejném principu jako physostigmin, ale je čtyřikrát účinnější na G1-formu acetylcholinesterázy, kterou nacházíme ve zvýšené míře u nemocných s Alzheimerovou chorobou. Inhibuje také butyrylcholinesterázu. Vzhledem k tomu, že rivastigmin (viz obr. 10) působí selektivně na mozkovou kůru a na hipokampus, nezpůsobuje žádné výrazné vedlejší účinky. [10, 15] 13 Obr. 10 Rivastigmin Ve fázi klinických studií jsou i jiné deriváty physostigminu jako třeba fenserin. Tento derivát vykazuje vysokou selektivitu k ACHE a dlouhou dobu účinku. Působí především na zlepšení paměti nemocných. Testovány jsou i látky odvozené od fenserinu např. cymserin, který působí specificky na BCHE. Právě tato látka může být do budoucna pro pacienty velmi prospěšná, když uvážíme, že při Alzheimerově nemoci dochází ke zvýšení aktivity BCHE. [15] 13 Obr. 10 upraven podle: In Wikipedia: the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida): Wikipedia Foundation, 29 November 2005, last modified on 28 October 2011 [cit ]. Dostupné z WWW: <

57 50 Donepezil (viz obr. 11) funguje jako reverzibilní, ale nekompetitivní inhibitor ACHE. V současnosti je nejvíce využívaným léčivem ve středním stádiu nemoci. Je 1250 krát selektivnější k ACHE než k BCHE, tato látka má vysokou afinitu k mozku a specificky stimuluje cholinergní systém. Pacienti jsou méně podráždění ve srovnání s těmi, kteří užívali tacrin a také se u nich méně často vyskytují depresivní epizody. Vedlejší účinky se projeví až po dlouhodobém užívání nebo při užívání vysokých dávek léčiva. [10, 15] 14 Obr. 11 Donepezil V klinických studiích jsou látky, které jsou odvozené od donepezilu, některé vykazují slibné výsledky při testování na zvířatech. [15] Galantamin je alkaloid izolovaný z rostlin Galanthus nivalis a Galanthus woronowii z čeledi Amaryllidaceae. Galantamin působí jako reverzibilní a kompetitivní inhibitor acetylcholinesterázy, navíc funguje jako alosterický modulátor nikotinových receptorů, což ještě prohloubí účinek acetylcholinu na ně. Tento alkaloid rovněž zvyšuje hladinu i kyseliny glutamové a γ-aminomáselné v CNS. U nemocných, kteří užívají galantamin, dochází ke zlepšení kognitivních funkcí a k pozdějšímu zhoršování běžných denních činností. Esterové deriváty galantaminu fungují jako proléčiva, která podléhají hydrolýze a výsledný produkt je mnohem účinnější než samotný galantamin. [10, 15] Dále byl zkoumán alkaloid huperzin a izolovaný z rostliny Huperzia serrata z čeledi Huperziaceae. Tato látka vykazuje neuroprotektivní účinky a velmi nízkou toxicitu. Huperzin a byl po velmi dlouhou dobu používán v tradiční čínské medicíně jako lék na poruchy centrálního nervového systému. [15] Vědci se snaží vyvinout nová ještě účinnější léčiva pomocí zdvojování nebo kombinací aktivních částí molekul tacrinu, huperzinu a a galantaminu. [15] 14 Obr. 11 upraven podle: In Wikipedia: the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida): Wikipedia Foundation, 16 June 2004, last modified on 22 November 2011 [cit ]. Dostupné z WWW: <

58 51 Nootropika Nootropika jsou léčiva používaná v širokých indikacích od Alzheimerovy a Parkinsonovy nemoci přes poruchy vědomí, pozornosti a paměti až po mentální retardace, dyslexie a delirium tremens. Tyto látky dobře pronikají přes hematoencefalickou bariéru do mozku, kde zvyšují obrat glukózy a kyslíku v neuronech. Dále příznivě ovlivňují vasospazmy v mozkové cirkulaci a zlepšují tak krevní průtok. Navíc mohou mít jednotlivá léčiva ještě další na nemoc pozitivně působící účinky (např. cholinergní). [10] Mezi nejvýznamnější látky této skupiny lze zařadit piracetam, což je cyklický derivát kyseliny γ-aminomáselné a jeho deriváty (např.aniracetam, pramiracetam), dále pak meclofenoxát a pyritinol. Pro dobré terapeutické výsledky je nutná dlouhodobá terapie těmito léčivy. Někteří autoři do skupiny nootropik řadí i látky, které způsobují vazodilataci mozkových cév, jako je např. cinnarizin, naftydrofuryl, pentoxifylin nebo i dihydroergotoxin. [10] Adjuvantní léčba Adjuvancia se používají především k terapii demence, pomáhají také do určité míry zlepšit ostatní tělesné funkce. Mezi tato adjuvancia řadíme: memantin, který způsobuje inhibici NMDA receptorů, jejich nadměrná stimulace škodí neuronům, muže až způsobit jejich odumírání; selegilin jakožto inhibitor monoaminooxidázy zvyšuje hladinu dopaminu v CNS a díky tomu zlepšuje kognitivní funkce u nemocných; vitamíny E a C, které neutralizují volné radikály; dále extrakt z rostliny Ginkgo biloba z čeledi Ginkgoaceae, ten funguje jako antioxidant a zároveň mírně zpomaluje progresi demence; poslední možností jsou protizánětlivá léčiva, která podle určitých studií potlačují zánět v mozku pacientů a současně snižují hladinu β-amyloidu. [10, 15] Další možnosti léčby Bylo také zkoumáno, jak pacienti reagují na podávání přímo cholinu nebo lecitinu jakožto prekurzoru acetylcholinu, dále byly nemocným podávány látky, které zvyšují uvolňování ACH (jde o látky ze skupiny blokátorů draslíkových kanálků) a také látky, které zlepšují vstup prekurzoru ACH do nervové buňky. [10, 15] Dokonce se zkoušelo i přímo stimulovat cholinergní receptory. Bylo zjištěno, že nikotin jakožto stimulátor všech známých podtypů nikotinových receptorů, zlepšuje paměť, má však řadu vedlejších účinků, pro které se stal v praxi nepoužitelným.

59 52 Agonisté muskarinových receptorů zvyšují koncentraci ACH v CNS. Vzhledem k tomu, že muskarinové M 1 receptory hrají velmi důležitou roli v zapamatovávání, snaží se vědci vyvíjet látky, které specificky stimulují právě tyto receptory. Žádná z těchto metod zatím nemá praktické využití. [10, 15]

60 53 4. Cíl práce 1. Vypracovat literární přehled o vlivu plazmatické vazebnosti léčiv na jejich osud v organismu a o metodách stanovení této vazebnosti; 2. Stanovit vazebnost na plazmatické bílkoviny u dvou nově vyvíjených radiodiagnostik Alzheimerovy choroby u několika živočišných druhů; 3. Posoudit možný význam plazmatické vazebnosti studovaných látek na jejich farmakokinetické chování.

61 54 5. Experimentální část 5.1 Pomůcky a chemické látky Testované látky 5C-2-BOC a 5C-5-BOC, obě látky jsou značené pomocí 99m Tc. Obr. 12 5C-2-BOC Obr. 13 5C-5-BOC Obě studované látky byly připraveny na oddělení farmaceutické chemie a analýzy léčiv, Medical University, Lodz, Polsko (P. Szymanski) Vzorky krevní plazmy Jedná se o krevní plazmu získanou od čtyř různých živočišných druhů. Jmenovitě jde o lidskou, králičí, hovězí a potkaní plazmu Chemikálie Fosfátový pufr o ph 7,41 Destilovaná voda 0,9 % roztok NaCl CH 3 CN Použité pracovní pomůcky Mikrozkumavky s filtrem Injekční stříkačky o objemu 1ml Injekční jehly Celofán Kádinky

62 55 Skleněné tyčinky Stojan na zkumavky Lahvičky na odebírání vzorků Automatické pipety Špičky Teploměr Ochranné pracovní rukavice Polštářky z buničiny Filtr ISO-Disc PVDF Zařízení a přístroje Dialyzační kotouče Přístroj na otáčení kotoučů Termostat TCH100, Laboratorní přístroje Praha Centrifuga U-32R, Biotech Gama counter Wallac 1480 Wizard 3 Kapalinový chromatograf Agilent 1100 series s řídícím programem clarity Radiometr Polon

63 Pracovní postup Příprava krevní plazmy Plastový vak s lidskou plazmou se musí nejprve celý rozmrazit a vylít do kádinky. Poté je třeba odebrat si potřebné množství plazmy a stočit ji na centrifuze po dobu asi 5 minut. S takto připravenou plazmou se již pracuje. Plazma králičí, hovězí a potkaní byla připravená předem a stačilo pouze příslušné lahvičky vyjmout z mrazáku a rozmrazit. Pouze v případě, že by při práci plazma pěnila, bylo by nutné ji znovu stočit Rovnovážná dialýza Na začátku práce si do kádinky napipetuji 15 ml fosfátového pufru a přidám 150 µl zkoumané látky značené 99m Tc. Sestavím si dialyzační kotouče tak, že mezi dvě k sobě pasující poloviny vložím do kulata zastřižený kousek celofánu dialyzační membránu a obě části sešroubuji k sobě. Do očíslovaného kotouče poté injekční stříkačkou plním z jedné strany krevní plazmu a z druhé roztok pufru se zkoumanou látkou po 0,45 ml. Postupovat musím opatrně, abych si nenamočila kapilárku vedoucí do komůrky, protože by mohlo dojít k jejímu ucpání a komůrku by se mi již nepodařilo naplnit. Z tohoto důvodu si musím po každém natažení jak plazmy, tak pufru injekční jehlu otřít do sucha polštářkem z buničiny. Každý živočišný druh testuji vždy ve čtyřech komůrkách, musím si tedy takto připravit dva kotouče, každý po osmi komůrkách. Po naplnění kotouče umístím do otočného zařízení a zajistím je. Zapnutý otočník vložím do termostatu spolu s teploměrem pro lepší kontrolu teploty. Teplotu v něm nastavím na 37 C a nechám probíhat dialýzu po dobu čtyř hodin. Potom z každé komůrky odeberu jeden vzorek plazmy a jeden vzorek pufru po 0,1 ml a dám si změřit jejich aktivitu Ultrafiltrace Nejprve si připravím vzorky krevní plazmy k 1 ml plazmy přidám 10 µl radioaktivně značeného vzorku látky.

64 57 Poté napipetuji do mikrozkumavek s filtrem 0,45 ml připravené plazmy. Pro každý živočišný druh použiji vždy dva vzorky. Mikrozkumaky pečlivě narovnám do centrifugy a nechám je odstřeďovat. Po uplynutí 3 minut je vyndám a do měřících lahviček odeberu vzorky plazmy zfiltrované i nezfiltrované dvakrát po 0,1 ml. Nakonec si nechám změřit aktivitu jednotlivých vzorků. V případě 5C-2-BOC byly použity mikrozkumavky druhu: Vecta Spin Micro Cellulose Triacetate 12k MWCO 100 Units Cat. No Whatman. V případě 5C-5-BOC to byly: PALL Life Sciences Centrifugal Devices For biomolecular separation NANOSEP 3K OMEGA Radiochemická čistota Pod vedením Doc. Ing. Alice Lázníčkové CSc. byla určována radiochemická čistota obou studovaných látek značených 99m Tc. Radiochemická čistota byla v mém případě určována pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Eluce probíhala v 50mm kolonce po dobu 35 min za pokojové teploty. Jako mobilní fáze byl použit 0,9 % roztok chloridu sodného a acetonitril. Jejich gradient byl uspořádán následovně: v 0 10 min od nástřiku byl použit pouze roztok chloridu sodného; mezi min to byla směs obou dvou, přičemž koncentrace acetonitrilu se zvyšovala od 0 % do 100 %; mezi min pouze acetonitril; od 30min do konce koncentrace acetonitrilu postupně klesala od 100 % do 0 %. Mobilní fáze protékala kolonkou rychlostí 1 ml. s -1. Látka 5C-5-BOC vykazuje o něco nižší rozpustnost ve vodě než látka 5C-2-BOC, proto je pro její zlepšení při přípravě roztoku přidáno malé množství methanolu. Pro jistotu je ještě před vlastní HPLC analýzou zfiltrována přes filtr ISO-Disc PVDF o průměru 13 mm a velikosti pórů 0,2 µm, aby se zabránilo případnému zneprůchodnění kolony.

65 58 6. Výsledky Vaznost potenciálních léčiv na bílkoviny krevní plazmy vypočítám podle následujícího vzorce: % %c`éhc= n; 0M % %c`éhc= n0;. 0M 100 pro dialýzu respektive 100 pro ultrafiltraci Kde % volného představují, kolik procent látky se nenaváže na bílkoviny krevní plazmy, dále A pufr představuje aktivitu v pufru, obdobně A plazma a A ultrafiltrát znamená aktivitu v plazmě respektive ultrafiltrátu. Směrodatnou odchylku spočítám podle následujícího vzorce: s= - Ž ( Ž V - V ). Kde N označuje počet jednotlivých měření, V jednotlivé hodnoty a aritmetický průměr.

66 m Tc-5C-2-BOC Měření vazebnosti pomocí rovnovážné dialýzy. Tab. 3 Naměřené hodnoty CMP (counts per minute) jednotlivých vzorků látky 99m Tc-5C-2-BOC zpracovaných za využití metody rovnovážné dialýzy při 37 C Naměřené hodnoty CMP Komůrka č Živočišný druh Člověk Plazma , , , ,6 Pufr 93621, , , ,9 Králík Plazma , , ,9 Pufr 84622, , ,2 Skot Plazma , , , ,6 Pufr , , , ,1 Potkan Plazma , , , ,8 Pufr , , , ,0

67 60 Tab. 4 Hodnoty volné a vázané frakce látky 99m Tc-5C-2-BOC stanovené metodou rovnovážné dialýzy při 37 C Rovnovážná dialýza volná frakce Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 61,31 93,38 71,29 / průměr 75,32 odchylka 13,4 Králík 28,03 / 20,53 27,60 25,39 3,4 Skot 90,19 55,23 69,05 84,43 74,73 13,7 Potkan 38,23 41,68 49,38 / 43,10 4,7 Procenta látky vázaná na bílkoviny krevní plazmy Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 38,69 6,62 28,71 / průměr 24,67 odchylka 13,4 Králík 71,97 / 79,47 72,4 74,61 3,4 Skot 9,81 44,77 30,95 15,57 25,27 13,7 Potkan 61,77 58,32 50,62 / 56,90 4,7

68 61 Měření vazebnosti pomocí ultrafiltrace. Tab. 5 Naměřené hodnoty CMP jednotlivých vzorků látky zpracovaných za využití metody ultrafiltrace 99m Tc-5C-2-BOC Naměřené hodnoty CMP Mikrozkumavka č. 1 2 Živočišný druh Člověk Plazma 90299, , , ,0 Filtrát 15216, ,1 7696, ,8 Králík Plazma , , , ,4 Filtrát 5417,5 5807,6 7763,5 8905,1 Skot Plazma , , , ,8 Filtrát 21301, , , ,5 Potkan Plazma , , , ,7 Filtrát 11119, , , ,2

69 62 Tab. 6 Hodnoty volné a vázané frakce látky 99m Tc-5C-2-BOC stanovené metodou ultrafiltrace Ultrafiltrace volná frakce Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 16,85 23,12 6,78 6,33 průměr 13,27 odchylka 7,1 Králík 3,50 3,59 6,38 4,78 4,56 1,2 Skot 14,28 16,35 23,32 10,09 16,01 4,8 Potkan 7,95 10,42 12,74 10,85 10,49 1,7 Procenta látky vázaná na bílkoviny krevní plazmy Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 83,15 76,88 93,22 93,67 průměr 86,73 odchylka 7,1 Králík 96,50 96,41 93,62 95,22 95,44 1,2 Skot 85,72 83,65 76,68 89,91 83,99 4,8 Potkan 92,05 89,58 87,26 89,15 89,51 1,7

70 m Tc -5C-5-BOC Měření vazebnosti pomocí rovnovážné dialýzy. Tab. 7 Naměřené hodnoty CMP jednotlivých vzorků látky zpracovaných za využití metody rovnovážné dialýzy při 37 C 99m Tc-5C-5-BOC Naměřené hodnoty CMP Komůrka č Živočišný druh Člověk Plazma 29910, , , ,0 Pufr 14070, , , ,3 Králík Plazma 47372, , , ,1 Pufr 8216,9 8924,2 8973,7 8229,4 Skot Plazma 26876, , , ,9 Pufr 12917, , , ,3 Potkan Plazma 48603, , , ,0 Pufr 18473, , , ,7

71 64 Tab. 8 Hodnoty volné a vázané frakce látky 99m Tc-5C-5-BOC stanovené metodou rovnovážné dialýzy při 37 C Rovnovážná dialýza volná frakce Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 47,04 45,75 57,07 28,26 průměr 44,53 odchylka 10,4 Králík 17,35 15,66 22,85 31,88 21,93 6,3 Skot 48,06 48,24 32,83 49,11 44,56 6,8 Potkan 38,01 35,83 33,54 27,19 33,64 4,1 Procenta látky vázaná na bílkoviny krevní plazmy Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 52,96 54,25 42,93 71,74 průměr 55,47 odchylka 10,4 Králík 82,65 84,34 77,15 68,12 78,07 6,3 Skot 51,94 51,76 67,17 50,89 55,35 6,8 Potkan 61,99 64,17 66,46 72,81 66,36 4,1

72 65 Měření vazebnosti pomocí ultrafiltrace. Tab. 9 Naměřené hodnoty CMP jednotlivých vzorků látky zpracovaných za využití metody ultrafiltrace 99m Tc-5C-5-BOC Naměřené hodnoty CMP Mikrozkumavka č. 1 2 Živočišný druh Člověk Plazma 8007,6 6376,3 7951,4 7669,7 Filtrát 6272,1 5234,2 6090,9 6416,7 Králík Plazma 9386,7 6043, ,7 5090,1 Filtrát 4186,6 2591,0 7264,0 3463,7 Skot Plazma 8540,7 6309, , ,8 Filtrát 3712,2 5076,1 3944,7 7055,0 Potkan Plazma 6700,6 5418, , ,0 Filtrát 3794,6 4086,4 9354,8 7650,6

73 66 Tab. 10 Hodnoty volné a vázané frakce látky 99m Tc-5C-5-BOC stanovené metodou ultrafiltrace Ultrafiltrace volná frakce Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 78,32 82,09 76,60 83,66 průměr 80,17 odchylka 2,8 Králík 44,60 42,87 62,79 39,45 47,43 9,1 Skot 43,46 80,45 38,60 39,45 50,49 17,4 Potkan 56,63 75,42 67,85 64,01 65,98 6,8 Procenta látky vázaná na bílkoviny krevní plazmy Pokus No Aritmetický Směrodatná Živočišný druh Člověk 21,68 17,91 23,40 16,34 průměr 19,83 odchylka 2,8 Králík 55,40 57,13 37,21 60,55 52,57 9,1 Skot 56,54 19,55 61,40 60,55 49,51 17,4 Potkan 43,37 24,58 32,15 35,99 34,02 6,8

74 67 Pro názornost uvádím ještě grafické znázornění výsledků vazebnosti (obr ). První dva grafy ukazují vazebnost látky 99m Tc 5C-2-BOC zjištěnou pomocí metody rovnovážné dialýzy (první graf) resp. ultrafiltrace (druhý graf). Druhé dva grafy znázorňují vazebnost látky 99m Tc 5C-5-BOC stanovovanou rovněž stejnými metodami (pořadí metod je stejné jako u předchozí látky). Skupinka sloupců s označením živočišného druhu znázorňuje, kolik procent dané látky je volné, tj. nenavázané na bílkoviny v plazmě. Na poslední dvojici grafů (obr ) je vyobrazeno porovnání vazebnosti obou látek podle použité metody. Na ose x je uvedený příslušný živočišný druh a na ose y aritmetický průměr procent vázané látky.

75 metody rovnovážné dialýzy při 37 C. Obr mTc-5C-2-BOC rovnovážná dialýza Měření č Měření č Měření č Měření č Člověk % volného Člověk % vázaného Králík % volného Králík % vázaného Skot % volného Skot % vázeného Potkan % volného Potkan% vázaného 68 Na obr. 14 je graficky znázorněno kolik procent látky 99mTc-5C-2-BOC se váže na bílkoviny krevní plazmy resp. je volných; stanoveno pomocí

76 Na obr. 15 je graficky znázorněno kolik procent látky 99mTc-5C-2-BOC se váže na bílkoviny krevní plazmy resp. je volných; stanoveno pomocí metody ultrafiltrace. Obr mTc-5C-2-BOC ultrafiltrace Měření č. 1 Měření č. 2 Měření č. 3 Měření č. 4 Člověk % volného Člověk % vázaného Králík % volného Králík % vázaného Skot % volného Skot % vázaného Potkan % volného Potkan% vázaného 69

77 metody rovnovážné dialýzy při 37 C. Obr mTc-5C-5-BOC rovnovážná dialýza Měření č. 1 Měření č. 2 Měření č. 3 Měření č. 4 Člověk % volného Člověk % vázaného Králík % volného Králík % vázaného Skot % volného Skot % vázaného Potkan % volného Potkan % vázaného 70 Na obr. 16 je graficky znázorněno kolik procent látky 99mTc-5C-5-BOC se váže na bílkoviny krevní plazmy resp. je volných; stanoveno pomocí

78 Na obr. 17 je graficky znázorněno kolik procent látky 99mTc-5C-5-BOC se váže na bílkoviny krevní plazmy resp. je volných; stanoveno pomocí metody ultrafiltrace. Obr mTc-5C-5-BOC ultrafiltrace Měření č. 1 Měření č. 2 Měření č. 3 Měření č. 4 Člověk % volného Člověk % vázaného Králík % volného Králík % vázaného Skot % volného Skot % vázaného Potkan % volného Potkan % vázaného 71

79 99m Tc-5C-2-BOC na bílkoviny krevní plazmy; stanoveno pomocí metody rovnovážné dialýzy při 37 C a ultrafiltrace. Obr. 18 Mezidruhové srovnání vazebnosti 99mTc-5C-2-BOC Rovnovážná dialýza Ultrafiltrace Člověk Králík Skot Potkan 72 Na obr. 18 je graficky znázorněno mezidruhové srovnání vazebnosti látky

80 Na obr. 19 je graficky znázorněno mezidruhové srovnání vazebnosti látky 99m Tc-5C-5-BOC na bílkoviny krevní plazmy; stanoveno pomocí metody rovnovážné dialýzy při 37 C a ultrafiltrace. Obr. 19 Mezidruhové srovnání vazebnosti 99mTc-5C-5-BOC Rovnovážná dialýza Ultrafiltrace Člověk Králík Skot Potkan 73