Zuzana Zemanová, Kyra Michalová Centrum nádorové cytogenetiky, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.

Transkript

1 Návrh laboratorní směrnice pro molekulárně cytogenetickou analýzu chromosomových odchylek v nádorových buňkách metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Zuzana Zemanová, Kyra Michalová Centrum nádorové cytogenetiky, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1.LF UK Praha 1. Úvod Tato metodika platí pro zpracování cytogenetických preparátů metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a je závazná pro pracovníky cytogenetických laboratoří při analýze chromosomových odchylek v mitosách i v nedělících se interfázních jádrech za použití DNA sond pro specifické chromosomové struktury (centromery, telomery, satelitní DNA), sond pro jedinečné genové kopie (lokus-specifické sondy) a tzv. malovacích sond pro celé chromosomy. 2. Princip metody Hybridizace neradioaktivně značených DNA sond ke komplementárním úsekům cílové DNA chromosomů nebo interfázních buněčných jader fixovaných na mikroskopickém preparátu a následná vizualizace a analýza fluorescenčních signálů ve fluorescenčním mikroskopu. Sondy jsou značeny přímo různými fluorochromy nebo nepřímo, např. biotinem či digoxigeninem. U nepřímo značených sond po hybridizaci následuje detekce pomocí systému protilátek konjugovaných s různými fluorochromy. 3. Indikace k vyšetření metodou FISH Metody FISH používáme vždy cíleně, na základě výsledků klasického cytogenetického vyšetření a po domluvě s ošetřujícím lékařem. Přímé vyšetření metodou FISH bez výsledků klasické cytogenetiky je možné jen v případech, kdy lze použít tzv. interfázickou FISH (I-FISH) na nedělících se buňkách, např. při nezdaru kultivace jakéhokoliv typu buněk pro cytogenetické vyšetření, při cíleném stanovení diagnózy, při monitorování úspěšnosti chemoterapie nebo transplantace kostní dřeně, případně při časovém stresu. 4. Typy DNA sond pro FISH: 4.1. α-satelitní sondy (centromerické, CEP) Hybridizují k α-satelitní DNA lokalizované v oblasti centromer lidských chromosomů. Jsou vhodné k detekci početních odchylek chromosomů (monosomie, trisomie, tetrasomie, hyperdiploidie, hypodiploidie atd.) v mitosách a v nedělících se interfázních jádrech.

2 4.2. lokus-specifické sondy (LSI) Hybridizují specificky ke konkrétním lokusům na chromosomech. Slouží k přímé lokalizaci genů, k detekci jejich amplifikace a k detekci strukturních chromosomových aberací (delece, translokace, inverze, inzerce, amplifikace atd.) v mitosách a v nedělících se interfázních jádrech. Do této skupiny patří i tzv. subtelomerické sondy, které hybridizují specificky k subtelomerickým oblastem jednotlivých chromosomů, používají se hlavně k detekci malých terminálních delecí a translokací malovací sondy pro celé chromosomy (WCP whole chromosome painting) Obsahují sekvence z celých chromosomů nebo jejich částí (parciální sondy). Slouží k detekci původu marker chromosomů, k analýze strukturních chromosomových aberací a složitých komplexních přestaveb v mitosách. Nejsou vhodné k analýze nedělících se interfázních buněk. Jednotlivé typy DNA sond jsou zobrazeny na Obrázku č Materiál k vyšetření Pro vyšetření metodou FISH používáme nejčastěji cytogenetické preparáty z kultivovaných či nekultivovaných buněk připravené klasickým způsobem. Rovněž lze použít tkáňové řezy používané v histologii či fixované buněčné nátěry nebo otiskové preparáty. Dále je možné provádět I-FISH na cytospinových preparátech nebo na tkáňových řezech získaných z parafinových bločků (před hybridizací nutná deparafinizace). 6. Pracovní postupy a protokoly Všechny reagencie a preparáty obsahující fluorochromy chránit před světlem! Mikrozkumavky s reagenciemi před otevřením vždy krátce protřepat na vortexu a stočit v pikofuze! 6.1. Příprava cytogenetických preparátů Preparáty pro FISH jsou připravovány konvenčním způsobem. Před hybridizací jsou uchovávány v krabicích na mikroskopická skla při pokojové teplotě nebo jsou připravovány den před použitím ze zamražené fixované buněčné suspenze. Pro hybridizaci s malovacími sondami je vhodné použít preparáty staré jeden týden až jeden měsíc, pro FISH s α-satelitními nebo lokus-specifickými sondami je nejvhodnější připravit čerstvé preparáty den před hybridizací. pretreatment (platí pro α-satelitní a lokus-specifické sondy) 1) Ve vodní lázni předehřát 0,1N HCl na 37 C 2) Preparáty inkubovat ve 2xSSC, 37 C, 5 min 3) Na každý preparát aplikovat 100 μl RNAzy, přikrýt krycím sklem, inkubovat 60 min při pokojové teplotě 4) Odstranit krycí sklo, přenést do 2xSSC, inkubovat 3x5 min při pokojové teplotě 5) Těsně před použitím přidat do 0,1N HCl (37 C) 25 μl Pepsinu (konečná koncentrace 50 μg/ml v 0,1 N HCl, ph=2,3), preparáty inkubovat v roztoku 8 minut při 37 C 6) Mytí: 1x PBS, 2x5 min při pokojové teplotě

3 1xPBS/50mM MgCl 2, 1x5 min při pokojové teplotě 7) Postfixace: preparáty inkubovat 10 min v 0,1% Formaldehydu při pokojové teplotě 8) Přenést do PBS, inkubovat na třepačce 5 min při pokojové teplotě 9) Dehydratace v alkoholové řadě (70%, 85% a 96% ethanol) po 2 min 10) Usušit na vzduchu 6.2. Denaturace cytogenetických preparátů Při aplikaci komerčně vyráběných DNA sond (např. VYSIS, Cytocell, CAMBIO, Q-biogen atd.) se postupuje podle protokolů doporučených výrobcem. DNA sondy připravené v laboratoři: 1) Předehřát denaturační roztok (70% Formamid/2xSSC, ph=7,0 až 7,2) nejméně půl hodiny před použitím na požadovanou teplotu 2) Denaturace preparátů: inkubovat v předehřátém denaturačním roztoku při teplotě 70 až 75 C, 2-5 min (teplota a čas závisí na typu použitých sond) 3) Dehydratace v ledové alkoholové řadě po dvou minutách 4) Usušit na vzduchu 6.3. Příprava a denaturace DNA sond Při aplikaci komerčně vyráběných DNA sond (např. VYSIS, Cytocell, CAMBIO, Q-biogen atd.) se postupuje podle protokolů doporučených výrobcem. DNA sondy připravené v laboratoři: 1) Zmrazené sondy inkubovat 5 min při 37 C, 2x krátce protřepat a stočit 2) Požadované množství sondy (obvykle 7-10 μl) odpipetovat do připravené sterilní mikrozkumavky, u některých typů sond je nutné nejdříve smíchat cca 1 μl sondy s cca 9 μl hybridizačního pufru, 2x krátce protřepat a stočit 3) Umístit do plováčku a denaturovat ve vodní lázni 5 až 10 min při teplotě 70 až 80 C (teplota a čas závisí na typu použité sondy) 4) Přenést na led (1-5 min) 6.4. Příprava DNA sond preanealing Používá se pouze u některých typů sond (např. WCP). Mikrozkumavky se sondami umístit ve stojánku do termostatu a inkubovat 30 min při 37 C 6.5. Hybridizace Při aplikaci komerčně vyráběných DNA sond (např. VYSIS, Cytocell, CAMBIO, Q-biogen atd.) se postupuje podle protokolů doporučených výrobcem. DNA sondy připravené v laboratoři: 1) Do hybridizační komůrky vložit navlhčenou buničinu nebo filtrační papír, předehřát na 37 C 2) Mikrozkumavky se sondami 2x krátce protřepat a stočit

4 3) Nanést cca 10 μl hybridizační směsi na cytogenetický preparát, přikrýt krycím sklem (velikost krycího skla závisí na množství hybridizační směsi viz. tabulka č. 1), oblepit rubber-cementem (např. lepidlo FIXOGUM od firmy Marabu) 4) Skla umístit do předehřáté hybridizační komůrky, inkubovat v termostatu při C 30 min až 24 h (délka hybridizace závisí na typu sondy, v některých případech může probíhat i 2 až 5 dní) Tabulka 1: Doporučené velikosti krycích skel pro různá množství hybridizační směsi Krycí sklo Minimální množství hybridizační směsi 18 x 18 mm 5 μl 22 x 22 mm 10 μl 22 x 30 mm 15 μl 22 x 40 mm 20 μl 22 x 60 mm 30 μl 6.6. Detekce Při aplikaci komerčně vyráběných DNA sond (např. VYSIS, Cytocell, CAMBIO, Q-biogen atd.) se postupuje podle protokolů doporučených výrobcem. DNA sondy připravené v laboratoři: 1) Předehřát mycí roztoky na požadovanou teplotu minimálně půl hodiny před použitím 2) Mycí roztok (50% Formamid/SSC), 2 až 3x 5-10 min při C (podle typu sondy) Stringence (síla) mycího roztoku je přímo úměrná teplotě a nepřímo úměrná koncentraci SSC koncentrace SSC v mycím roztoku závisí na typu použité sondy: např. WCP sondy 1xSSC, LSI a CEP sondy 2xSSC. 3) SSC (WCP 0,1x SSC, CEP+LSI 2xSSC), 2x 5 min, C 4) 2xSSC/0,1%NP40, 5 min při pokojové teplotě (jen LSI a CEP sondy) U přímo značených sond následuje obarvení preparátu pomocí DAPI nebo PI, ustálení fluorescenčních signálů pomocí antifadu, který stabilizuje fluorescenční signál a vizualizace ve fluorescenčním mikroskopu. Nepřímo značené sondy jsou detekovány pomocí systému protilátek konjugovaných s fluorochromy, jejich výběr závisí na typu značení viz. tabulka č. 2.K zesílení signálu se používá tzv. sendvičová metoda, t.j. opakované nanášení protilátek. Tabulka 2: Doporučené detekční protilátky Značení Protilátky Counterstain Digoxigenin Anti-Digoxigenin - FITC PI, DAPI Digoxigenin Anti-Digoxigenin - Rhodamine DAPI Biotin Avidin FITC PI, DAPI Biotin Avidin Texas Red DAPI Dvoubarevná FISH Anti-Dig. Rhodamine + Avidin - FITC DAPI

5 5) 50 μl příslušné protilátky na jeden preparát pod krycí sklo 22x60 mm, inkubovat min při 37 C 6) Mytí: 3x 2 min v mycím roztoku (SSC s detergentem), na třepačce, při pokojové teplotě 7) Amplifikace: krok 5 a 6 opakovat 2-4x s amplifikačními protilátkami (viz. tabulka č. 3), počet amplifikačních kroků závisí na intenzitě fluorescenčního signálu a na kvalitě pozadí preparátu (kontrolovat v mikroskopu) Tabulka 3: Doporučené amplifikační protilátky Značení Protilátky I Protilátky II Digoxigenin-FITC Rabbit Anti-Sheep Anti-Rabbit-FITC Digoxigenin-Rhodamine Rabbit Anti-Sheep Anti-Rabbit - Rhodamine Biotin-FITC Anti-Avidin Antibody Avidin-FITC Biotin - Texas Red Anti-Avidin Antibody Avidin - Texas Red 8) Nanést μl DAPI/Antifade nebo PI/Antifade (např. Mountig Medium,Vector), přikrýt krycím sklem 22x60 mm Nebo: Obarvení preparátu - inkubovat 3 min v roztoku DAPI/SSC na třepačce krátce opláchnout v 2x SSC při pokojové teplotě krátce opláchnout pod tekoucí studenou vodou, okapat Antifade - nanést μl Antifade (nebo Mountig Medium, Vector) přikrýt krycím sklem 22x60 mm 9) Filtračním papírem odsát přebytky Antifadu. 7. Manipulace s fluorescenčními preparáty Preparáty po hybridizaci je nutné chránit před světlem! Před prohlížením ve fluorescenčním mikroskopu po hybridizaci jsou preparáty uchovány ve tmě při pokojové teplotě alespoň po dobu 30 min. Následuje analýza ve fluorescenčním mikroskopu. 8. Analýza ve fluorescenčním mikroskopu Analýza hybridizovaných DNA sond probíhá ve fluorescenčním mikroskopu vybaveném specifickými optickými filtry odpovídajícími použitým fluorochromům. Fluorescenční signály je nutné hodnotit alespoň v mitosách. Při analýze chromosomových odchylek v nedělících se interfázních buňkách se doporučuje hodnotit alespoň 200 jader na jeden mikroskopický preparát a hybridizační mix. V případě patologického nálezu snímat obraz z fluorescenčního mikroskopu CCD kamerou a dále zpracovat pomocí softwaru pro FISH. Patologické nálezy archivovat na pevném disku, případně na magnetooptických discích. 9. Uchování fluorescenčních preparátů Preparáty chráněné před světlem lze před fluorescenční analýzou krátkodobě uchovávat v lednici. Dlouhodobě jsou preparáty uchovávány v mrazicím boxu při teplotě -20±1 C.

6 10. Bezpečnostní opatření Při zpracování cytogenetických preparátů metodou FISH je nutné dodržovat bezpečnostní opatření vyplývající z provozního řádu příslušného pracoviště. Všechny reagencie obsahující fluorochromy je nutné chránit před světlem! Formamid je mutagen - při manipulaci vždy používat rukavice a ochranný oděv! DABCO a propidium iodide jsou potenciální karcinogeny - při manipulaci vždy požívat rukavice a ochranný oděv! 11. Validace Analýzu chromosomových odchylek metodou fluorescenční in situ hybridizace provádějí vyškolení atestovaní vysokoškoláci nebo laborantky, nálezy jsou popisovány podle mezinárodní ISCN nomenklatury. V pravidelných intervalech jsou veškeré nálezy posouzovány a schvalovány vedoucím laboratoře nebo jeho zástupcem. Pro analýzu nedělících se interfázních buněk musí být na každém pracovišti stanovena hodnota "cut-off value" (tj. dělícího bodu), podle kterého jsou nálezy klasifikovány jako pozitivní, respektive negativní) pro používané typy DNA sond a vyšetřované typy buněk či tkání. Jako kontrolní skupina musí být vyšetřeny osoby, u kterých je zřejmé, že mají normální cytogenetický nález bez prokazatelné chromosomové aberace. Vzorky odebrané těmto osobám jsou vyšetřeny metodou interfázické FISH s příslušnými DNA sondami a jsou spočítány buňky s aberacemi (aneuploidie, strukturní přestavby). Poté je stanoven průměr a směrodatná odchylka pro celou kontrolní skupinu. Jako "cut-off" pro použité typy sond je pak stanovena hodnota průměr +3SD. U vyšetřovaných pacientů je za pozitivní považován nález, který se rovná nebo převyšuje tuto hodnotu v procentech z celkového počtu analyzovaných buněk. 12. Interpretace výsledků Interpretaci výsledků provádí vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce a zprávu o výsledku poskytuje ošetřujícímu lékaři s případným komentářem. 13. Vydávání výsledků Písemné zprávy o výsledku vydává po podpisu vedoucí laboratoře nebo jeho zástupce. Při vyšetření Statim je možné vydat výsledek telefonicky pouze ošetřujícímu lékaři. 14. Kontrola kvality V pravidelných intervalech (1x ročně) probíhá mezilaboratorní porovnání kvality analýzy chromosomových odchylek metodou FISH mezi akreditovanými cytogenetickými laboratořemi. Kontrolu kvality práce v cytogenetických laboratoří na mezinárodní úrovni připravuje v pravidelných intervalech společnost EUROGENTEST, což je společná organizace EU, která se zabývá testováním kvality práce na genetických pracovištích (CEQA, Vnitřní kontrola kvality v cytogenetické laboratoři je zavedena průběžně, pravidelně se testují chemikálie používané při FISH a pravidelně se vyhodnocuje kvalita získaných výsledků podle diagnóz pacientů.

7 15. Použité zkraky CEP - centromerické sondy (Chromosome Enumeration Probes) DAPI - 4,6 diamidino 2-phenylindol DNA - deoxyribonukleová kyselina DNA sondy - úseky DNA o známé sekvenci FISH - fluorescenční in situ hybridizace FITC - fluorescein isothiocyanat I-FISH interfázická FISH- analýza nedělících se jader s určitým typem DNA sond LSI - lokus specifické sondy (Locus Specific Identifier) PI - propidium iodide TKD - transplantace kostní dřeně WCP - malovací sondy pro celé chromosomy (Whole Chromosome Painting) 16. Reference 1. ISCN (2005): An International System For Human Cytogenetic Nomenclature. Shaffer L.G., Tommerup N. (eds); S. Karger, Basel, 2005.

8 Obrázek č. 1: DNA sondy pro fluorescenční in situ hybridizaci (FISH): CENTROMERICKÉ SONDY (CEP) LOKUS-SPECIFICKÉ SONDY (LSI) MALOVACÍ SONDY (WCP)