METODY MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE. Mgr. Jana Slováčková, Ph.D. Ústav patologie FN Brno

Transkript

1 METODY MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Mgr. Jana Slováčková, Ph.D. Ústav patologie FN Brno

2 Molekulární patologie Využívá molekulární a genetický přístup k určení diagnózy a klasifikaci onemocnění Rutinně využívá metody molekulární biologie, zejména PCR v různých modifikacích, sekvenování a in situ hybridizaci Vyšetřuje biomolekuly (NK, proteiny) převážně z parafínových bloků tkání, pro některé metody také z tkání nativních či tělesných tekutin

3 Hlavní úkoly molekulární patologie Diferenciální diagnostika a klasifikace nádorů Detekce molekulárních aberací odpovědných za nástup onemocnění Odpověď na léčbu (prediktivní markery) Odhad chování onemocnění (prognostické markery)

4 Prognostický marker odhad chování onemocnění či jeho závažnosti bez ohledu na zvolený způsob léčby Např.: prognosticky negativní jsou DHL/THL lymfomy (současná aberace genů MYC, BCL-2 a BCL-6) Mnohé markery jsou jak prediktivní tak prognostický faktor pro dané onemocnění

5 Prediktivní marker zda pacient bude mít z léčby prospěch, tedy odhad odpovědi na konkrétní léčbu vyšetřován validovanou metodou v RL (nepodkročitelná minima a doporučené metody vyšetření shrnuty v Modré knize ASCO/CAP guidelines ) Karcinom prsu ER, PR, ERBB2 Kolorektální karcinom RAS (KRAS, NRAS) a BRAF Maligní melanom BRAF GIST c-kit, PDGFRα NSCLC EGFR, ALK, ROS1, PD-L1 Karcinom žaludku ERBB2

6 Kvalita NK izolovaných z FFPE V důsledku použití formaldehydu (formolu) jako fixativa dochází u NK ke vzniku cross-linků DNA/DNA a DNA/proteiny a následně k výrazné fragmentaci NK Způsob zacházení s tkání v preanalytické fázi má velký vliv na kvalitu NK (např.: způsob odběru, způsob a délka fixace ) DNA nejčastěji fragmenty kolem 300bp RNA nejčastěji RIN kolem bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Testování kvality DNA z FFPE bloků Použit obrázek z DP Mgr. Lucie Ballonové (roz. Charvátové)

7 Nádorová heterogenita Nádor má monoklonální původ ale jeho buňky se přesto liší v řadě znaků, skládá se rozdílných subklonů, na něž působí různé selekční tlaky např. faktory nádorového mikroprostředí (hypoxie, přítomnost imunitních buněk ) nebo terapie. Vlivem těchto tlaků se nádor mění, vyvíjí. Přináší vysvětlení, proč se může lišit výsledek genetického vyšetření ze 2 různých míst nádoru stejného jedince v průběhu onemocnění mezi primárním nádorem a metastázami

8 Nejčastější metody molekulární patologie Metody založené na PCR, sekvenování, ISH Diagnostika aberací na úrovni NK vyžaduje citlivé techniky (v celém genomu 3x10 9 bp se obtížně hledá změna 1 bp, proto je nezbytné buď amplifikovat oblast zájmu nebo použít velmi citlivý detekční systém) Pro zvýšení citlivosti metod: makro/mikrodisekce

9 PCR polymerázová řetězová reakce

10 Vyhodnocení PCR Elektroforéza (agarová nebo PAGE) Kapilární elektroforéza g001.png

11 Modifikace PCR Kvantitativní PCR v reálném čase (real-time PCR, qpcr) založena na principu klasické PCR, umožňuje však kvantifikaci sledovaného úseku DNA v reálném čase. Na rozdíl od běžné PCR, kde se analyzuje až výsledný produkt elektroforézou, je při qpcr produkt zaznamenáván při každém cyklu ve skutečném čase nejčastěji pomocí fluorescenčních sond. Př.: Cobas mutation test analytická citlivost: 5% nádorových buněk obsahuje mutaci FFPE_fig1_

12 Modifikace PCR Multiplex PCR obsahuje několik sad primerů v jedné reakci např. pro detekci všech nejčastějších mutací daného genu Př.: ViennaLab StripAssay Princip: 1. Amplifikace: Multiplex PCR, současné značení PCR produktu Biotinem, 2. Hybridizace: Přímo na StripAssay teststripech, 3. Identifikace: značené produkty jsou detekovány pomocí alkalické fosfatázy konjugované se streptavidinem Analytická citlivost: 1% nádorových buněk obsahuje mutaci

13 Sekvenování Přímé sekvenování (Sangerovo) předchází mu PCR amplifikace s dntps a značenými ddntps, následuje sekvenace jednotlivých DNA fragmentů, tzn.čtení jednotlivých bází pomocí detekce fluorescenční značky na kapilární elekroforéze. Délka získané sekvence až 1000 bp a přesnost čtení 99,9%. Nevýhody: citlivost sekvenování - přímé sekvenování nezachytí mutaci, pokud není zastoupena v 10-30% nádorových buněk, sekvenace pouze jednoho úseku DNA (max. sekvenační výtěžek jednoho sekvenačního běhu cca 60 kb), nízká rychlost.

14 Sekvenování NGS (Next Generation Sequencing) - Masivně paralelní sekvenování Princip: příprava sekvenační knihovny (nastříhání DNA, připojení adaptorů), PCR amplifikace (vznik clustrů), detekce fluorescenční barvy jednotlivých nukleotidů během syntézy úseku DNA Analytická citlivost 5% mutovaných alel Nevýhoda: Délka získaných sekvencí cca bp, náročné vyhodnocení Výhody: Sekvenační výtěžek jednoho běhu až několik tisíc Gb (až o 6 řádů vyšší než u kapilárního sekvenování), rychlost, umožňuje testování celého panelu mutací v jednom běhu, poskytuje mnoho informací Příklad využití: CZECANCA: CZEch CAncer panel for Clinical Application - vyšetření 219 genů asociovaných s dědičnými nádorovými onemocněními, obsahuje přes 50 klinicky významných genů vysokého a středního rizika, zbývající geny tvoří málo prozkoumané a kandidátní predispoziční geny, jejichž vrozené mutace mají nejasnou klinickou interpretaci Ukázka technologie Illumina

15 ISH Metody In situ hybridizace umožňují lokalizaci a identifikaci specifické sekvence nukleotidů cílového místa v DNA resp. RNA. Princip: využívá procesu denaturace a reasociace DNA. Hybridizace probíhá podle pravidel komplementarity bazí, vlákno vyšetřované DNA se spojí s druhým vláknem oligonukleotidu značené sondy. K hybridizaci dochází přímo ve vyšetřovaném biologickém materiálu, tedy na místě (in situ), nikoli na izolované DNA

16 V závislosti na použitém označení sondy lze metody rozdělit na FISH (fluorescenční) a CISH (chromogenní) CISH Výhody: Možnost pozorovat signály i morfologii tkáně současně ve světelném mikroskopu FISH Výhody: Možnost sledovat více cílových sekvencích (každá obarvena jiných fluorochromem)

17 Molekulární diagnostika u NSCLC Patolog nejprve určí o jaký typ karcinomu plic se jedná na základě morfologie a příp. IHC (typy NSCLC: adenokarcinomu, NSCLC spíše adenokarcinom, adenoskvamózní karcinom a NSCLC NOS, dlaždicobuněčný (skvamozní) karcinom) Patolog zváží, zda je výhodné testovat molekulární prediktivní markery (typ karcinomu plic, dostatečné zastoupení nádorových buněk v biopsii, přítomnost zánětlivého pozadí falešně negativní výsledek, zda se zvažuje příslušný terapeutický zásah ve spolupráci s klinikem) Testují se tyto prediktivní markery: EGFR aktivující mutace u 16,6 % u evropské populace rezistentní mutace T790M (mutační status nádoru se mění v souvislosti s proběhlou léčbou) Detekce: qpcr cobas Roche, StripAssay ViennaLab Testování mutačního stavu genu EGFR u NSCLC je prováděno reflexne, tj. u všech nemocných s diagnózou adenokarcinomu, NSCLC spíše adenokarcinomu, adenoskvamózního karcinomu a NSCLC NOS, u skvamózního karcinomu je prováděno jen na vyžádání klinika Vyšetření lze provádět i z volně cirkulující DNA (z tekuté biopsie), pokud není k dispozici tkáňová biopsie primárního nádoru a/nebo pro monitorování progrese či recidivy během léčby TKI. Mutace prokázaná z volně cirkulující DNA má stejnou prediktivní váhu jako z tkáňové biopsie. Analytická senzitivita je jen 70% (ne všechny typy tumorů uvolňují dostatečné množství cirkulující nebuněčné nádorové DNA). ALK a ROS-1 imunohistochemie metodou první volby, dle potřeby následuje detekce metodou FISH, V České populaci jsou na přestavbu ALK genu pozitivní 3,2 % vzorků, přestavba ROS-1 se vyskytuje ještě vzácněji Algoritmus vyšetření genů ALK a ROS1 - převzato z Registru KELLY mutace EGFR a ALK se navzájem vylučují, přítomnost aspoň jedné umožňuje nasadit cílenou biologickou léčbu TKI (gefitinib, crizotinib) PD-L1 imunohistochemicky vyšetřuje exprese PD-L1, nemocní s vysokou expresí PD-L1, kteří mohou být kandidáty imunoterapie (nivolumab) Pro správnou léčbu pacienta je nutná komplexní součinnost patologa, molekulárního biologa a klinika Ani optimální využití molekulárně genetických metod pro většinu nemocných zatím nevede k cílené léčbě přibližně jen 15-20% adenokarcinomů obsahuje terapeuticky ovlivnitelné mutace.

18 Děkuji za pozornost