Princip a využití protilátkových mikročipů RNDr. Zuzana Zákostelská

Transkript

1 Princip a využití protilátkových mikročipů RNDr. Zuzana Zákostelská Laboratoř buněčné a molekulární imunologie Odd. Imunologie a gnotobiologie MBÚ AVČR v.v.i, Praha Konference XXXIII. Imunoanalytické dny 2012 a XII. Mezinárodní konference CECHTUMA 2012, Ústí nad Labem

2 Multiplexové metody Metody,které umožnují stanovit až několik stovek analytů v jedné reakční nádobce nebo na jedné reakční ploše Hlavní výhody - menší spotřeba vzorku - méně pracné - kratší doba zpracování - levnější

3 Multiplexové metody Genová úroveň (metody založené na PCR) Analýza genových polymorfismů (DNA) či expresních profilů (RNA). Nemusí odrážet koncentraci cílového analytu Proteinová úroveň (metody založené na hmotnostní spektrometrii) Komplexní vzorky je nutné rozdělit do frakcí (např. pomocí chromatografie), což bývá časově náročné Není potřeba předem znát ani analyt ani vhodný epitop Menší citlivost v komplexních vzorcích Proteinová úroveň (metody založené na protilátkách) Přesné a citlivé i v komplexním vzorku Vhodné pro klinickou praxi (jednodušší přístrojové vybavení, highthroughput řešení) Analyt musí být znám a musí být vyvinuty vhodné protilátky, které rozpoznávají vhodné epitopy.

4 Multiplexové metody založené na protilátkách Hlavní výhodou multiplexových metod obecně je získání lepší představy o vlastním biologickém ději. Spojení více reakcí dohromady dále vede k menší spotřebě času, vzorku a reagencií. Na rozdíl od stanovení jednoho analytu jsou však multiplexové metody náchylnější ke zkříženým reakcím mezi protilátkami a antigeny. Přestože počet kvalitních protilátek stále narůstá, řadu látek nelze takto určit a nebo je určení nespolehlivé (nevhodný epitop, nízká senzitivita ). RayBio Biotin Labelbased Human Antibody Array 1 Detekce 507 lidských cytokinů

5 Multiplexové metody založené na protilátkách Suspenzní versus planární Ellington AA, et al. Clin Chem 2010;50:

6 Multiplexové metody založené na protilátkách Suspenzní Princip průtokové cytometrie Snazší automatizace Přesnější díky opakovanému měření Např. Luminex, Cytometric bead array BD Biosciences, USA

7 Multiplexové metody založené na protilátkách Planární Zmenšení detekční plochy vede ke snížení detekčního limitu kvůli dobrému odstupu signál-šum a rychlejší reakce kvůli kratším difusním vzdálenostem než u ELISA Vysoký dynamický rozsah (5 log) Nižší interference,antigen-protilátka umožňuje větší paralelizaci. Např: Tkáňový mikročip, Proteinový mikročip, Protilátkový mikročip

8 Mikročip založený na protilátkách Tkáňový mikročip ( Tissue microarray ): Malé části tkáně jsou na pevné fázi jako antigen a ve vzorku hledáme např. nové nádorové markery. John Hopkins Pathology

9 Mikročip založený na protilátkách Proteinový mikročip ( Reverse phase protein microarray ) Protein ze zkoumaného vzorku (např. lyzát tkáně nádoru) je na pevné fázi a k němu se přidávají se značené protilátky Vhodné pro analýzu posttranslačních modifikací, dynamiky, Biocompare, USA, Aplicattion notes -Reverse Phase Protein Lysate Microarrays

10 Mikročip založený na protilátkách Protilátkový mikročip ( Analytical antibody microarray ): Protilátka je na pevné fázi (sklíčku, membráně apod.) a vzorkem je směs proteinů. Zachycené proteiny jsou označeny obvykle druhou (značenou) protilátkou (podobně jako sendvičová ELISA) Ray Biotech, Inc., USA, Custom quantibody array- protocol

11 Protilátkový mikročip ( Analytical antibody microarray ): Nosiče: celulosová membrána, mikroskopické sklíčko Stanovení analytu: kvalitativne,kvantitativne Zacílení: angiogeneze, apoptóza, zánět, TH1/TH2 nebo TH17 buněčná odpovědˇ.. mikročip na zákazku Využití: hledání biomarkerů, monitorování cytokinů a chemokinů jako odraz fyziologických procesů a v klinických studiích, hledání molekulárních mechanismů pro vývoj nových léčiv..

12 Cytokiny odraz fyziologických procesů Pomocí protilátkových čipů jsme popsali přítomnost 68 cytokinů v lidském kolostru a stanovili jejich změny v čase. Celkem 32 z nich jsme stanovili v tomto vzorku poprvé. V současnosti zkoumáme jejich význam pro vývoj jedince a vztah ke zdravotnímu stavu matky Cytokinový profil u jednoho vzorku: 30 hodin po porodu (A) 60 hodin pp (B) 80 hodin pp (C) Negativní kontrola (D). Kverka M, et al. Clin Chem. 2007;53:

13 Praktické zkušenosti se zpracováním protilátkových mikročipů Supernatant μl Pokud médium obsahuje sérum je nezbytné udělat kontrolu!! Sérum, plazma,moč Ředění: 1:1,1:5,1:10 Buněčné nebo tkáňové lyzáty μg/ml proteinu

14 Praktické zkušenosti se zpracováním protilátkových mikročipů Manipulovat se skly v rukavicích bez latexu Čisté prostředí (laminární flow-box) Nedotýkat se plochy skla-pouze okrajů Před začátkem pokusu nechat ekvilibrovat a vyschnout Před začátkem pokusu označit na straně a na skle Přetáhnout folií -pokud inkubace delší než dvě hodiny Nikdy nenechat vyschnout!!! Po sundání plastového krytu - rychle a pečlivě stočit

15 Praktické zkušenosti se zpracováním protilátkových mikročipů aneb co se stane, když..

16 Praktické zkušenosti se zpracováním protilátkových mikročipů Vyhodnocení: Layout/úprava dat-ručně, odstranění spotovacích chyb a nečistot Převedení hodnot do software od výrobce Doporučení: - Dodržovat počet promývání - Standartní křivka může mít jen 5 bodů (ne 7) - Kalibrace

17 Závěr Multiplexové metody jsou účinným nástrojem k popsání mechanismů fyziologických a patologických procesů Protilátkové mikročipy umožňují stanovit koncentraci více proteinů zároveń Protilátkové mikročipy - mají vysokou citlivost a specifitu - mnoho aplikací

18 Poděkování MBÚ AVČR, v.v.i. Sektor imunologie a gnotobiologie Laboratoř buněčné a molekulární imunologie Miloslav Kverka Klára Klimešová Helena Tlaskalová-Hogenová

19 Děkuji Vám za pozornost Zuzana Zákostelská