Buněčné kultury. Kontinuální kultury

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "1.12.2009. Buněčné kultury. Kontinuální kultury"

Ladislava Havlová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Primární kultury - odvozené přímo z excise tkáně buněčné linie z různých organizmů, tkání explantované kultury jednobuněčné suspense lze je udržovat jen po omezenou dobu během kultivace ztrácejí diferenciační charakteristiky, které mají in vivo Kontinuální kultury jednobuněčný typ kultury jsou udržované pasážováním limitovaný počet pasáží (přibližně 30 50, replikativní senescence) diploidní počet chromosomů, určitý stupeň diferenciace pasážovatelné bez omezení transformované (nádorové buňky) odvozené z nádorových tkání klinických případů transformované virovým onkogenem, chemickým kancerogenem. Morfologie suspense, monolayer závislost na tkáni, ze které byly získané Suspensní forma leukemie, lymfomy Monolayer fibroblasty, solidní nádory (viz monolayer HeLa buněk / karcinom děložního čípku pasážované více než 50 let) Kultivace normálních buněk Kontaktní inhibice Omezený počet generací Typické antigenní determinenty Aerobní metabolismus Nutnost růstových faktorů v mediu Diploidní počet chromosomů Specifický buněčný tvar Kultivace nádorových buněk Ztráta kontaktní inhibice Neomezený růst kultura je nesmrtelná Změny v povrchových antigenech (MHC, TSTA, fetální antigeny ) Anaerobní metabolismus Nízké nároky na růstové faktory v kultivačním mediu Změněný počet chromosomů Kultivace Sterilní podmínky Nutriční požadavky Definované typy medií dostupné komerčně Balancovaný roztok anorganických solí - obohaceno karbohydráty, vitaminy, proteiny a peptidy, lipidy a mastnými kyselinami, stopové prvky, serum Ph ( ), pufrovaný systém (indikátor bikarbonát): CO 2, atmosféra: 5-10% CO 2 chemicky (HEPES) nepotřebují CO 2 atmosféru Teplota Uchovávání zmrazení (méně než 135 o C tekutý nitrogen), kryoprotektiva Vhodné buňky pro cytogenetické vyšetření Lymfocyty Fibroblasty Buňky kostní dřeně Trofoblasty Buňky plodu izolované z amniové tekutiny Nádorové buňky.. 1

2 TKÁŇOVÉ KULTURY TKÁŇOVÉ KULTURY HeLa buňky - apoptóza CYTOGENETIKA KULTIVACE ZPRACOVÁNÍ, NAKAPÁNÍ NA SKLÍČKA G-PRUHOVÁNÍ: Giemsa po ovlivnění trypsinem C- PRUHOVÁNÍ: centromerické, delší působení trypsinu, výrazně se barví heterochromatinové úseky R-PRUHOVÁNÍ: barvení Giemsovým barvivem po zahřátí preparátů VÝMĚNY SESTERSKÝCH CHROMATID (SCE): výměna sesterských chromatid, viditelná po přidání bromdeoxyuridinu (analog tyminu) do kultivačního media. Rozlišení DNA syntetizované před 1., 2. a dalšími mitózami. Mutageneza a mitotická aktivita buňky. FISH fluorescenční in situ hybridizace Metoda FISH FISH spojení postupů klasické cytogenetiky a technologie molekulární genetiky jednovláknová (denaturovaná) sonda DNA vazba k cílové sekvenci na principu komplementarity použití v interfázi i mitóze sonda označena fluorochromem (Texas Red, FITC ) sondy centromerické alfa satelitní sekvence DNA přítomné v oblasti centromery (počet chromosomů) sondy lokus-specifické váží se na vybraný lokus (mikrodelece, translokace) sondy malovací (celochromosomové) směs fragmentů DNA konkrétního chromosomu, nelze použít v interfázi, pouze v metafázi (strukturní aberace inserce, translokace, marker chromosomy, ring-chromosomy) Karyotyp norma, G-pruhování 2

3 FISH mnohobarevné pruhování Sarkom kosterního svalu-hypotetraploidie okrouhlé až vřetenovité maligní buňky mitoticky aktivní Multispektrální analýza - cytogenetická metoda využívající přístupy molekulární genetiky přesná identifikace každého chromosomu, chromosomových párů původ rekombinovaných chromosomů, které se často nacházejí v nádorových buňkách zpracování vyžaduje použití několika technik založených na poznatcích fyziky, chemie (Fourierova spektroskopie) přístrojové vybavení - zařízení pro zobrazení spektra barev vybuzeného elektrickým nábojem, optický mikroskop SPEKTRÁLNÍ KARYOTYPOVÁNÍ (a) Normální lidský karyotyp - každý chromosom má odlišné zbarvení. (b) Spektrální karyotypování chromosomů otce a dítěte s mentální retardací. Translokace mezi chromosomem 1 a 11. (c) ataxia (postižení svalů), translokace mezi chromosomy 4 a 12. (d) Chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu. Chromosomální přestavby v buňkách nádoru Nádorové buňky mívají změněný počet a strukturu chromosomů Heteroploidní, pseudodiploidní počet chromosomů Chromosomální přestavby - delece, translokace, marker chromosomy, ring chromosomy, isochromosomy.. Změny v karyotypu - náhodné, nenáhodné Nádor plic 3

4 Chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu Vyšetření chromosomů buněk nádoru prsu mnohočetné strukturní přestavby Karyotyp charakterizuje závažnost onemocnění, naznačuje prognózu, je vodítkem pro volbu terapie Chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu metoda FISH Protoonkogen Her-neu kóduje receptor pro epidermální růstový faktor s tyrosinkinázovou aktivitou amplifikace Her-neu Prognostický a diagnostický marker u karcinomů prsu i dalších nádorů (např. nádory močového měchýře) Centromera zeleně Her-neu - červeně Rodina protoonkogenů myc N-myc - neuroblastom regulace buněčného cyklu aktivace např. růstovými faktory geny časné odpovědi Amplifikace sekvence DNA A) homogenně zbarvené oblasti (HSR) B) samostatné útvary - double minutes diagnostický a prognostický marker rodina protoonkogenů myc (virus myeloblastózy kuřat) N-myc neuroblastom L-myc malobuněčné karcinomy plic L-myc malobuněčný karcinom plic Chronická a akutní myeloidní leukemie metoda FISH mnohočetné kopie protoonkogenu L- myc nepříznivá prognóza mnohonásobná amplifikace tvoří oblak, jednotlivé signály jsou nesnadno detekovatelné Chromosomální diagnostika Molekulární diagnostika Detekce BCR-ABL fuzního genu a jeho transkriptu 4

5 Chronická myelogenní leukemie (CML) Filadelfský chromosom (Ph) Filadelfský chromosom Filadelfský (Ph) chromosom - reciproká translokace mezi chromosomem 9 a 22 { t(9;22)(q34;q11) } Filadelfský chromosom Cytogenetický marker u 90% případů chronické myeloidní leukemie (CML) a u 5-20%případů akutní lymfocytární leukemie (ALL) 5% Ph negativních pacientů - cryptický fuzní gen BCR-ABL detekovatelný metodami molekulární genetiky 2.5% CML pacientů - negativní pro Ph chromosom i pro BCR-ABL fuzní gen Translokace - fuzní gen BCR-ABL, zlom v BCR ("breakpoint cluster region") genu na chromosomu 22 a ABL (Abelson onkogen) genu na chromosomu 9 CML - produkt fuzního genu je protein 210 kd, má transformační schopnosti Burkittův lymfom Burkittův lymfom translokace [der(8;14), der(2;8), der(8;22)] Translokace protoonkogenu c-myc [der(8;14)] 5

Podobné dokumenty

Buněčné kultury. Kontinuální kultury

Buněčné kultury. Kontinuální kultury Buněčné kultury Primární kultury - odvozené přímo z excise tkáně buněčné linie z různých organizmů, tkání explantované kultury jednobuněčné suspense lze je udržovat jen po omezenou dobu během kultivace