Signalizace je vlastně komunikace. a komunikace je základem života.

Transkript

1 Signalizace je vlastně komunikace a komunikace je základem života.

2 Signalizace, regulace, komunikace a integrace v buňce, pletivu a organizmu Několik poznámek. Kvantitativně převažujícím prvkem regulace genové exprese je represe (a její odblokování). Většina bílkovin je polyfunkčních a jejich exprese a funkce je regulována na mnoha úrovních najednou. Signální dráhy se integrují na úrovni společného regulačního bílkovinného intermediátu (příklad fosf.), druhého posla, promotoru, procesu či struktury. Signál je zesilován, či zeslabován - při tom šum okolí může být pozitivně využit k zesílení signálu = stochastická resonance.

3

4 Z toho, že organismus vládne buňkám (nejen buňky organizmu), také plyne, že také buňka a organizmus vládne signálním drahám a sítím. Buňka není jen výsledkem propletence procesů/struktur, které v ní probíhají/strukturují, ale také jejich tvůrcem.

5 Degradace bílkovin je stejně důležitý regulační krok jako jejich syntéza. Signální dráhy často obsahují vysoce specifickou/regulovanou degradaci bílkoviny jako důležitý regulační krok. (Vzpomeňme na cykliny )

6 Proteolýza je ovšem také konstitutivní proces. Až 30% translatovaných bílkovin je nefunkčních.

7 Degradace buněčných bílkovin 17- Proteolytické dráhy u eukaryot - 1. vakuolární/lysozomální - 2. Na ubiquitinu-proteasomu závislá degradace - 3. post-proteasomálni degradace : Tricorn, TPII? - 4. Degradace membranových proteinů

8 17- Hlavní proteolytické dráhy eukaryot Mitochondria Autophagosome Mitochondrial /plastid proteolytic systems Lysosome/ endosome endosomelysosome system cooperation nuclear proteins cytoplasmic proteins Nucleus Ubiquitinproteasome system ER proteins endosome-lysosome pathway degrades extracellular and cellsurface proteins ubiquitin-proteasome pathway degrades proteins from the cytoplasm, nucleus and ER mitochondria (and chloroplasts) have their own proteolytic system that are of bacterial origin

9 17- Dějiny studia proteolýzy Folin states endogenous proteins are stable Schoenheimer uses 15 N to show continuous protein turnover Hershko et al. identify enzymes of the ubiquitinprotein ligase system 26S proteasome partly purified by Rechsteiner Kischner et al. discover that cyclin is degraded by the ubiquitin pathway Lewis discovers bodies in patients with Parkinson s disease Hershko and Ciechanover discover the process of ubiquitylation ubiquitin structure 1987 proteasome structure 1995 Varshavsky, Ciechanover and Finley discover ubiquitylation is essential for viability and cell-cycle progression Lowe, Landon and Mayer discover that Lewy bodies are full of ubiquitylated proteins Several groups discover the combinatorial control and specificity of SCF ubiquitin protein ligases podle John Mayer, Nature reviews 1,

10 Vakuolární/lysozomální lysozomální degradace (viz. min. předn.) macroautophagy is the equivalent of forming intracellular endosomes (phagosomes) that fuse to the lysosome and result in the breakdown of its contents Hsc73 (constitutively-expressed Hsp70 chaperone) is involved in one pathway of lysosome-mediated degradation 17- vakuola

11 Degradace membránových proteinů. AAA proteases mediate the degradation of membrane proteins in bacteria, mitochondria and chloroplasts (i.e., compartments of eubacterial origin) combine proteolytic and chaperone activities in one system, acting as qualitycontrol machineries model substrate polypeptides containing hydrophilic domains at either side of the membrane can be completely degraded by either of two AAA proteases found in mitochondria, if solvent-exposed domains are in an unfolded state - a short protein tail protruding from the membrane surface is sufficient to allow the proteolytic attack of an AAA protease that facilitates domain unfolding at the opposite side Leonhard et al. (2000) Mol. Cell 5, p=precursor; m=mature; 25ºC=no unfolding; 37ºC=unfolding of domain(s)

12 Bílkoviny určené k degradaci proteasomem jsou modifikovány ubiquitinem. Prvním známým proteinem ubq. in vivo v aktivní formě byl u rostlin fytochrom. Řada bílkovin je před ubiquitinací specificky fosforylována.

13 Ubiquitinová dráha 17- E1 - ubiquitin activating enzyme E2 - ubiquitin conjugating enzyme E3 - ubiquitin ligase ~ denotes high-energy thioester bond DUB, deubiquinating enzyme

14 Syntet. z fusních tandemových prekursorů 3 až 6. Jsou štepeny deubiqutinačními enzymy/proteasami = DUB 76 AA rostl. od kvasinek/živočichů se liší 2/3 AA. Ubq. se kovalentně váže na Lys cílové bílkoviny C -Gly.

15 Ubiquitinová dráha 17- ub ub O O OH N-H prot E1-SH ATP E3 prot ub ub ub O AMP E1-SH O S-E1 E2 O S-E2 E1 - ubiquitin activating enzyme uses ATP to activate the carboxyl group of ubiquitin s C-terminal residue (Gly76). The outcome of this reaction is the formation of a thioester between Gly76 of ubiquitin, and a cysteine residue of E1 E2 - ubiquitin conjugating enzyme accepts the ubiquitin from the E1 through a thioester linkage with a cysteine E3 - ubiquitin ligase transfers the ubiquitin molecule to the epsilon NH 2 group of lysine on the substrate ubiquitin molecules are then in succession to the Lysine 48 residue to form a multiubiquitin chain the DUB enzyme recycles ubiquitin the 26S proteasome degrades the substrate to peptides

16 E1 ubq. Aktivace E2 ubq. Konjugace E3 ubq. Ligace ubq. na Lys cílové bílkoviny. E3 zajišťuje specifitu rozpoznání. Na bílkovině je ubq. více Lys a to opakovaně = polyubiquitin.

17 E3 ubiquitin ligázy 17-4 základní typy E3 ubiquitin ligáz u rostlin: kol.1300 genů Arabidopsis kóduje podjednotky E3 ligáz. s HECT domains (E6AP-related proteins) - monomerní 17x u A.t. s Ring/U-Boxem (VHL, SCF, APC, MDM2, c-cbl, etc.) 480x RING a 64x U- Box u A.t SCF komplex 4 podjednotky - podjednotka řídící specifitu F-box 700x u A.t. APC le také 37x AtE2 = potenciálě obrovské množství spec. ubq. komplexů

18 vedle 700 F-boxů má Arabidopsis 21 SKP bílkovin. Opět velká kombinatorika komplexů existují ovšem preferované kombinace.

19

20 SCF- dependentní ní ubiquitinace u kvasinek 17-1 F-box proteins mediate substrate selectivity in degrading various yeast proteins many (all?) of the substrates need to be phosphorylated to be recognized by the F-box protein WD40 and leucinerich repeats (LRRs) present in F-box proteins mediate protein-protein interactions u rostlin je to podobné

21 Monoubiquitinace může sloužit jako regulační modifikace. Např. pro třídění do endocytotické dráhy a vakuoly/lysozomu či modifikuje např. transkripci TF-ubq.

22 Anaphase promoting complex (APC) 17-1 The anaphase-promoting complex (also termed cyclosome ) is a ubiquitin-protein ligase that controls important transitions in mitosis by ubiquitinating regulatory proteins consists of many different proteins, including some related to SCF (e.g., ring protein) To initiate sister chromatid separation, the APC has to ubiquitinate the anaphase inhibitor securin, whereas exit from mitosis requires the ubiquitination of B-type cyclins em reconstruction unprocessed em images Gieffers et al. (2001) Mol. Cell 7,

23 Tricorn degradační dráha prokaryot tricorn protease in prokaryotes may be part of a degradation pathway that involves proteasome (in archaea) or other ATP-dependent proteases in archaea/bacteria proteasomes/other oligomeric proteases digest proteins to small peptides tricorn protease then cleaves these to 2-4 mers, which are then degraded down to the level of free amino acids by aminopeptidases a modular system for protein degradation 17-1 probably one of many pathways of protein degradation in prokaryotes Yao and Cohen (1999) Curr. Biol. 9,

24 Tricorn degradační dráha u eukaryot? 17-1 tripeptidyl peptidase II (TPPII) is a cytosolic subtilisin-like peptidase that may be functionally related to Tricorn protease but not sure if TPPII is protease that replaces proteasome Multicorn? - popsán u Schizosaccharomyces pombe po inhibici proteasomu Legend to gels: Galactosidase (116 kd) (lane 1), purified TPPII (lane 2), fast- and slowrunning electrophoretic isoforms of 26S proteasomes (lanes 3 and 4, respectively), and purified 20S proteasomes (lane 5) em pictures of TPPII; dumbbell- or ovoid-shaped Geier et al. (1999) Science 283,

25 ClpAP je proteázový komplex aktivní v plastidech (homol. E.coli). rání hromadění nefunkčních bílkovin v plastidech. Podobně je tomu mitochondriích.

26 Proteasom

27

28 Topologie proteasomu zajišťuje, že proteázovou aktivitou nebudou nespecificky zasaženy cytoplasmatické bílkoviny. U Arabidopsis každá podjednotka = dva geny - to zn. různé subtypy proteasomu.

29 1.5 MDa

30 CSN (COP9 / signalosom) komplex byl poprvé objeven u Arabidopsis (viz. dále = světlo jako signál). Jeho podjednotky a celková organizace jsou homologní "víku" RP proteasomu.

31

32 CSN kontroluje aktivitu E3 SCF ligázy prostřednictvím neddylace či deneddylace (NEDD8 či RUB1 jsou peptidy podobné ubiquitinu) a pravděpodobně interaguje s proteasomem.

33 N-koncové pravidlo Met, Thr, Ser, Gly a Val na N stabilizují bílkovinu, zatímco Lys, Arg, His a další ji destabilizují.

34 N-koncová acetylace stabilizuje bílkovinu.

35 U některých prot. je N Met odštěpen aminopeptidázou a novou počáteční AA bývá Glu nebo Asp;takové bílkoviny se stávají substrátem ubiquitinace teprve po přidání N - Arg.

36 Bílkoviny se mnohonásobně liší poločasem životnosti a ten se prudce mění s měnícím se diferenciačním/regulačním stavem buňky. Klíčové proteiny signálních drah (včetně transkripčních faktorů) bývají velmi labilní.

37 Příklady proteolytických bílk. a ovlivněných procesů u rostlin.

38 Inhibitory proteasomu The peptide aldehydes, MG 132, MG 115, and PSI, inhibit the complex's chymotrypsinlike activity in a potent but reversible manner. Lactacystin is a natural, irreversible, nonpeptide, cell permeable inhibitor that is more selective than peptide aldehydes but less selective than peptide boronates, another class of proteasome inhibitors.