Podíl membrán na funkcích živých organismů. buněčný transport dráždivost a vzrušivost energetika imunita rozmnožování

Transkript

1 Podíl membrán na funkcích živých organismů buněčný transport dráždivost a vzrušivost energetika imunita rozmnožování

2 Micely a liposomy amfifilní molekuly micely dvojvrstva vesikuly liposomy soly lamely tekuté krystaly

3 Měření povrchového tlaku π Langmuirova váha 1. Vana 2. Slídový plovák 3. Pt fólie 4. Hedvábné vlákno 5. Torzní vlákno 6. Kalibrační rameno 7. Zrcátko 8. Kompresní bariéra 9. Bariéry pro stahování nečistot z povrchu 10. Zařízení pro posun bariér

4 π = -Δ σ = σ 0 σ Povrchový tlak kde: σ 0 - povrchové napětí na čisté hladině vody, σ - snížené povrchové napětí ha hladině pokryté filmem nerozpustné látky πa = nrt, kde: π povrchový tlak (N.m -1 ), A plocha.

5 Formy povrchových filmů π A m A = N kt kde π - povrchový tlak (Nm -1 ) T absolutní teplota A m molekulární plocha (nm 2 ) A 0 limitující molární plocha, k - Boltzmannova konst. (1, JK -1 ) N Avogadrovo číslo (6, mol -1 )

6 Oblast B trojrozměrný kapalný stav tlaky 0,001-0,01 Nm -1 5 ( π π )( ) m A 0 / 10 0 A A0 N = kt - limitující molární plocha za nových tlakových podmínek, π 0 - povrchový tlak při přechodu z plynného stavu

7 Oblast C zabalený model tlak roste nad 0,01 Nm -1 A = ask 0 A N m a - aktivita rozpuštěné látky (a = c.f a ), f a aktivitní koeficient c koncentrace s plocha povrchu roztoku k konstanta π

8 Oblast D vznik kondenzované monovrstvy další nárůst tlaku A π = ask N 0 Am

9 Oblast E vznik mnohovrstevné struktury π = ask překročen limitní tlak monovrstva se hroutí

10 monovrstvy - lipidické - bílkovinné (reverzibilní rozvinutí až zhroucení terciární struktury) - smíšené stupeň nemísitelnosti látky v roztoku s rozpouštědlem povrchová tenze roztoku roztoky - voda - síran amonný vesikuly sonikací směsi vody, organického rozpouštědla a lipidu (Φ =50 nm)

11 povrchové napětí σ kvalitativní vlastnost kapalin na rozhraní s plynnou fází způsobeno: tendencí kapalin ke kohezi Existuje: na rozhraní mezi - dvěma nemísitelnými kapalinami - kapalinou a pevnou látkou Každá kapalina má snahu zaujímat co nejmenší objem - koule - stykem s větším množstvím kapalin je tento trend překonán - gravitace způsobí plošné uspořádání kapaliny

12 povrchový tlak π klesá lineárně se vzrůstající teplotou klesá do bodu ležícího těsně u kritické teploty kapaliny zcela zmizí při kritické teplotě (složky nemohou existovat jako kapaliny bez ohledu na velikost tlaku)

13 Gibbsova povrchová izoterma odvozena pro poměr mezi povrchovou koncentrací změnami v povrchovém tlaku v závislosti na koncentraci rozpuštěné látky

14 du= TS d pv d + σ da+ µ dn+ µ dn Γ= n A n Γ Gibbsova adsorpce - koncentrační přebytek molekul rozpouštěné látky na jednotku plochy povrchu Uvnitř roztoku platí Gibbsova-Duhemova rovnice ndµ + n dµ =

15 dσ n2 kn2 = =Γ dµ A 2 n 1 - pokud nevstupuje do rovnice, je povrchová koncentrace složky 2 (=Γ 2 ) nezávislá na objemu RT a pro Gibbsovu povrchovou izotermu (nebo též adsorpční rovnici) změna chemického potenciálu d µ 2 = 2 da Γ= a dσ RTda

16 Rovnice Szyszkowského σ0 σ = α ln 1+ βa ( ) α, β - konstanty vztažené k rozpuštěným látkám Γ= αβa RT 1+ βa ( ) α - hodnota je stejná pro homologické řady (monokarboxylové mastné kyseliny) Γ= α RT β - je závislá na druhu molekuly (např.6,1 pro propionovou a 2327 pro kapronovou)

17 Micely amfifilních molekul

18 Schématické znázornění kapalně-krystalické (mezomorfní) fáze systému lipid-voda d - opakovaná vzdálenost d 1 průměr lipidického cylindru či lamely A - hexagonální I B - hexagonální II C - obdélníková D - komplexně hexagonální E lamelární I x II (A = f(l a c))

19 Gely a koaguláty Vznikají při velmi nízkém obsahu vody (10-15%) mohou mít také lamelární strukturu Koagulát obsahuje dvě fáze, kapalnou vodu a krystalický lipid Gel je homogenní ale obvykle metastabilní

20 Fázový diagram systému amfifilní molekula voda, v závislosti na teplotě. L- lamelární fáze C- krychlová fáze H- hexagonální fáze

21 Porovnání umělých a biologických membrán Umělé membrány, obsahují pouze vodu a lipidy Biologické membrány obsahují směsi lipid - bílkovina voda Pro oba typy existují dvě základní strukturní uspořádání, - lamelární - hexagonální

22 Umělé membrány Molekuly fosfolipidů se ve vodném roztoku samy organizují do dvojvrstvy, ve které jsou hydrofobními řetězci obráceny proti sobě a hydrofilními skupinami do vodného prostředí. vezikula - měchýřek, který tvoří základ umělých membrán

23 Typy umělých membrán Ploché membrány označované jako černé lipidické membrány, protože negativní interferenční jevy způsobují, že se pod mikroskopem jeví jako černé Kulovité membrány buď se stejným nebo rozdílným mediem vně a uvnitř Velikost: několik desetin nm, větší kolem 1 µm, bublinové membrány s průměrem až 1 cm. liposomy - multivrstevné verze vezikul malých velikostí

24 Příprava umělých membrán Příprava multivrstevného liposomu a dvojvrstevných vezikul. Záleží na rychlosti míchání fosfolipidické emulze. Lipozomy mohou být vytvořeny z dvojvrstvy sonikací.

25 Příprava bublinové membrány

26 Příprava černé lipidické membrány A lipidická vrstva je silná tvořena několika molekulami vykazuje různé interferenční barvy B tenká, spontánně vytvořená dvojvrstva, se v mikroskopu jeví jako černá

27 X-paprsková difrakce krystalické látky mohou působit jako trojrozměrná difrakční mřížka pro X-paprsky, pokud meziatomové nebo mezimolekulární vzdálenosti mřížky mají stejnou řádovou hodnotu jako vlnová délka X-paprsků, tj. okolo 0,1 nm řádná konstruktivní či destruktivní interference paprsku, která se řídí Braggovou rovnicí 2d sin Θ = kλ

28 X-paprsková difrakce poloha maxima intenzity je dána rozměrem elementární buňky intenzita maxima závisí na distribuci elektronů v buňce velikost úhlu maxima závisí na stupni relativní orientace mezi buněčnými jednotkami úhlová šířka maxim závisí na počtu elementárních buněk v krystalické struktuře

29 Fourierova transformace Intenzita I získaného difrakčního obrazce souvisí s amplitudou A vlnoplochy vztahem I = A 2 lze vypočítat absolutní hodnotu amplitudy ale ne její fázi. Užitím Fourierovy transformace pro vektorovou hustotu elektronů v reálném prostoru (konkrétní případ pro osu x) dostáváme ( ) ( ) 2π irx ρ x = Are dr kde A(r) tzv. strukturní faktor r převrácená hodnota vzdálenosti (nm -1 ) i (-1) 0,5

30 membránové studie intenzita difrakčního obrazce se čte mikrodenzitometrem z ní se vypočte profil elektronové hustoty (graf závislosti pozorované intenzity na převrácené hodnotě vzdálenosti) X difrakce - pro umělé i přírodní fosfolipidické membrány pro hexagonální uspořádání získáme ostré píky, které se ale s rostoucí teplotou ro membrány jsou - zřetelně symetrické, co se týká rozměru - asymetrické, co se týče elektronové hustoty (v důsledku různého podílu cholesterolu v obou typech membrán )

31 UV spektroskopie Elektronové přechody mezi základním stavem a excitovanými stavy jsou základem pozorování absorpčních jevů ve spektrálním rozmezí 150 až 600 nm, optické aktivity různých skupin. Existují dvě metody klasické absorpční spektroskopie - Optická rotační disperze (ORD) - Cirkulární dichroismus (CD)

32 Optická rotační disperze (ORD) Princip: když monochromatický, lineárně polarizovaný paprsek světla projde opticky aktivní látkou, vibrační rovina jeho elektrického vektoru bude rotovat. Velikost rotace lze určit hranolem. Použití: k rozlišení α-helikální struktury a dalších struktur peptidických řetězců globulárních bílkovin

33 Optická rotační disperze (ORD) Membránové bílkoviny mají z valné části strukturu α-šroubovice. Globulární bílkoviny jsou, dík své vnitřní asymetrii dané strukturou α-šroubovice, více pravotočivé než peptidické řetězce, z nichž jsou složeny. Rozdíl v hodnotách ORD mezi nativní a denaturovanou bíkovinou je mírou podílu α-šroubovice na její struktuře.

34 Cirkulární dichroismus (CD) Princip: Hodnota cirkulárního dichroismu je vlastně rozdíl absorbance vzorku pro levo- a pravotočivě polarizované světlo (obvykle je konstruovaná jako eliptičnost Θ ) Eliptičnost má stejnou jednotku jako optická rotace (rad. cm 2.dmol -1 ) Jaká část polarizovaného světla bude absorbována, o tom rozhoduje konformace bílkoviny

35 Vliv lipidů na změnu CD spektra a - po extrakci lipidů b - po přidání kardiolipinu c - vextrahované mitochondrie mitochodrií Problémy s interpretací spekter: - červený posuv CD paprsku - nízká amplituda

36 Nukleární magnetická rezonance Princip: měří se energie potřebná ke změně orientace atomového jádra v externím magnetickém poli. Jádro s nenulovým spinem (paramagnetické jádro) bude absorbovat energii elektromagnetického záření působícího pod úhlem 90 k externímu magnetickém poli, při frekvenci definované vztahem µ - jaderný magnetický moment H 0 - intenzita externího mg. pole h - Planckova konstanta I - jaderný spin γ - gyromagnetický poměr, specifický pro dané jádro f µ H0 γh0 = = hi 2π

37 Elektron spinová rezonance Princip: do membrány vzorku vstupuje molekula s nepárovým paramagneticky značeným elektronem mastná kyselina nebo jiná lipoidní látka s navázaným stabilním volným radikálem: - nitroxylová N-O skupina - paramagnetický 2,2,6,6,- tetrametylpiperidin-1-oxid - v tucích rozpustné deriváty

38 Jaké informace poskytuje elektron spinová rezonance? Jemná struktura spektrálních linií vypovídá o efektu rotace interakci mezi molekulami přenosu spinu přes membránu změně způsobené teplotou

39 Fluorescence Princip: Využívá vlastní fluorescence molekul Slouží ke zjištění změn především v trojrozměrné konformaci bílkovin, ve fluiditě membrány, ve velikosti potenciálu, v rozložení náboje na povrchu membrán

40 Využití fluorescenční metody Fluoreskování bílkovin po excitaci v UV světle (aromatické amkyseliny phe, tyr,try). Kvantový výtěžek a další charakteristiky fluorescence odrážejí změny ve fyzikálněchemickém stavu okolí bílkovin.

41 Nástroje fluorescenční metody Vnější fluorescenční sondy Charakteristiky sond se mění v závislosti na polaritě prostředí Fluorescence odpovídá charakteru vazného místa a jeho okolí Po vazbě na bílkovinu může dojít k výraznému vzrůstu kvantového výtěžku, zvětšení viskozity a snížení polarity

42 Nástroje fluorescenční metody měření polarizace fluorescence využívá jak vnitřní fluorescence bílkovin tak fluorescence emitované z vnějších zdrojů Poskytuje údaje o rotační volnosti fluoreskují látky případně bílkovinné molekuly v membráně, závisející na fluidním či krystalinním stavu membrány

43 Kalorimetrie a související techniky Princip: měření tepelných vlastností membrán a jejich komponent Diferenční teplotní analýza Diferenční snímací kalorimetrie Infračervená spektroskopie Tato technika má v analýze membránových lipidů a bílkovinné struktury omezené použití.

44 BIOLOGICKÉ MEMBRÁNY Historické modely membrán A 1925 H 1968 B 1943 G 1969 C 1956 E 1964 D 1970 F 1970 I 1972 Singer, Nicolson J 1972 Green a spol.

45 Model plasmatické membrány IP integrální protein GP glykoprotein PP - povrchový protein L lipidické kontinuum

46 Membrána tekutá mozaika dvojvrstva tvoří tekutou nebo tekutěkrystalinní základnu, ve které se molekuly lipidů laterálně pohybují. základní vlastnosti membrány: tekutost, pružnost, elektrický odpor, nepropustnost pro polární molekuly poměrné zastoupení lipidů a bílkovin je přibližně stejné

47 Stabilita a mechanické vlastnosti dvojvrstvy za fyziologické teploty kontrolovány hlavními složkami lipidické dvojvrstvy fosfolipidy % z celkového obsahu lipidů v membráně (fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, kardiolipin a sfingomyelin) glykolipidy cholesterol - zpevňuje membránu

48 Bílkoviny membrány více než 50% hmotnosti membrány globulární, základní strukturou α-helix periferní integrální aminokyselinové bílkoviny plavou v závislosti na η membrány ponor určuje složení a počet nepolárních zbytků aminokyselin na povrchu difúzní koeficient membránových bílkovin je kolem 10-9 cm 2 s -1

49 Funkce bílkovin v membráně immobilizované enzymy pro jejich činnost je rozhodující směrová orientace kanály pumpy receptory signální generátory složky membránového skeletu výstelka pórů (průměr pórů 0,35-0,8 nm)

50 Immunologické vlastnosti Sacharidy glykolipidů Sacharidy glykoproteinů Chrání cytoplazmatické membrány na vnější straně

51 Lipidická dvojvrstva Laterální pohyb lipidů v membráně (prokázáno spektroskopickými metodami) - pozice dvou sousedních molekul se zamění za cca 10-7 s, (difuzní koeficient kolem cm 2 s -1) Viskozita x větší než viskozita vody Výměna lipidických molekul mezi oběma vrstvami vyžaduje hodiny až dny

52 Teplota přechodu T C čistých amfifatických lipidů Do krystalinního stavu a naopak mohou přecházet jen za určité teploty Při teplotě přechodu T C nastává fázový přechod Pod hodnotou teploty fázového přechodu jsou řetězce mastných kyselin nataženy a paralelně orientovány (krystalinní stav) Nad teplotou T C je uspořádání řetězců volnější a lipidická vrstva je podstatně tekutější

53 Přechody komplexních lipidů nejsou ostré jsou doprovázeny oddělením obou fází za určitých podmínek mohou v membráně vedle sebe existovat oblasti tekuté a pevné fáze Fyzikální vlastnosti membrán elektrický odpor membrán je kolem 10 3 Ω.cm -2 (u umělých membrán je to cca 10 7 Ω.cm -2) kapacitance membrán 0,5 1,5 µf.cm -2 (u umělých membrán 0,6-0,9 µf.cm -2 ) Nižší rezistence biologických membrán je dána přítomností bílkovin, které mohou v membráně tvořit propustné póry pro ionty ale i určité molekuly.

54 Energetická závislost interakce lipid-bílkovina Schopnost měnit stupeň mobility a tím i stupeň agregace bílkovin v určité membráně představuje významný kontrolní mechanismus buňky 1) Dojde-li změnou podmínek ke snížení viskozity membrány, zvyšuje se reakční rychlost enzymových reakcí. 2) Membránové bílkoviny mohou být v disociovaném stavu enzymově neaktivní a v disociovaném aktivní a naopak.

55 Čím je určena distribuce bílkovin z hlediska termodynamického entropií mísení Ideální entropie mísení bude příznivá neuspořádané distribuci bílkovin přes dostupnou plochu membrány R - Boltzmannova konstanta ΔS ideální entropie mísení na mol x, (1-x) - molární množství mísených látek S = xln x 1 x ln 1 x R ( ) ( )

56 interakcemi mezi bílkovinnými složkami Specifické interakce vznik vícemolekulárních komplexů Nespecifické interakce vznik volně spojených enzymových komplexů, které se za určitých podmínek znovu rozpadají (T, ph, přídavek látek ovlivňujících stav membrány). Vazba bílkovinných molekul v membráně a) periferní bílkovina b) specifická agregace c) nespecifická agregace

57 interakcemi lipid-bílkovina bílkovinné molekuly způsobují perturbaci lipoidní dvojvrstvy bílkovina je ovlivňována částí lipidů v jejím sousedství - hraniční lipid charakteristiky hraničního lipidu složení hraničního lipidu se liší od složení celkového lipidu enzymová aktivita enzymů vázaných na membrány je závislá na přítomnosti a skladbě hraničního lipidu hraniční lipid se nepodílí na přechodech kapalné a tuhé fáze při teplotě přechodu permeabilní vlastnosti membrány v místě hraničního lipidu se liší od permeability neporušené lipidické dvojvrstvy

58 Gibbsova energie interakce protein lipid U tekuté vrstvy je energeticky výhodnější neagregovaný stav bílkovin G = H T S Předpokládané změny ΔG G hraničního lipidu v závislosti na vzdálenosti od místa perturbace r

59 Snížení Gibbsovy energie hraničního lipidu vlivem agregace membránových bílkovin Vrstva hraničního lipidu nejblíže sousedící s bílkovinou je charakterizována zápornými hodnotami změn H a tím i G (elektrostatické i jiné vazebné síly). Oblast přechodu od lipidu vázaného na bílkovinu k tuhé dvojvrstvě. V oblasti přechodu jsou interakce mezi lipoidními molekulami relativně nejslabší, hodnoty změn H i G nabývají maxim. Agregace bíkovin se projeví eliminací dvou ze čtyř pozitivních plošek, tj. snížením Gibbsovy energie.

60 Průběh H,S,G v závislosti na vzdálenosti od povrchu bílkoviny a to jak pro tekutou, tak tuhou dvojvrstvu. Změna entalpie charakterizuje sílu mezimolekulárních interakcí a je tak určující složkou pro změnu Gibbsovy energie. G je u tekuté vrstvy poněkud snížena protichůdným působením entropického členu.