AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE. Jana Sobotníková

Transkript

1 AFINITNÍ CHRMATGRAFIE Jana Sobotníková

2 Afinitní Chromatografie (Affinity chromatography, AC) biospecifická afinitní, bioafinitní chromatografie (specifický typ LSC) metoda izolace biologicky aktivních látek, studium interakcí biopolymerů využívá výjimečné biologické schopnosti některých látek- afinantů (ligandů či afinantních ligandů)- specificky a reverzibilně vázat komplementární látky (bílkoviny, NK) Provedení AC afinant se naváže kovaletní vazbou na vhodný nerozpustný inertní nosič kolona se naplní nosičem s navázaným afinantem biologicky aktivní látka se zachytí, látky bez afinity k použitému afinantu projdou kolonou nezadrženy látky zadržovány podle svých afinit za daných experim. podmínek uvolnění sorbované látky vhodným elučním činidlem (roztokem o odlišném ph či iontové síle) nebo rozpuštěním rozpustného afinantu AC 1

3 První aplikace AC: izolace protilátek pomocí celulózy s kovalentně navázaným antigenem K rozšíření AC přispělo objevení metod kovalentní vazby afinantu na agarózu. metoda vazby pomocí N-hydroxysukcinimidu, CNBr, karbondiimidu, epoxidu, thiolu AC 2

4 VYUŽITÍ AC Izolace: enzymů pomocí jejich inhibitorů, substrátů nebo koenzymů protilátek použitím proteinových antigenů (a naopak) lektinů pomocí oligosacharidů (a naopak) membránových receptorů pomocí příslušného hormonu či léčiva nukleových kyselin pomocí histonů (pro DNA), DNA (pro RNA) či syntetických polynukleotidů (polyt pro mrna) dělení a čištění buněk, virů a fágů úspěch metody AC závisí na schopnosti napodobit interakce složek jako kdyby byly v přirozeném prostředí (~ vodný roztok) podmínky AC se liší podle druhu izolované biologicky aktivní látky - selektivní interakce s afinantem AC 3

5 1. Analog substrátu Afinitní chromatografie Afinitní ligand + Enzym Nosič Raménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + Nosič Raménko Enzym vázaný na protilátku AC 4

6 VÝVJ METDY AC povaha pevného hydrofilního nosiče výběr afinantu a jeho vazba na nosič podmínky adsorpce a eluce izolovaných látek 1. VLBA PEVNÉH NSIČE a) pórovitá struktura umožňující pohyb makromolekul b) částice stejnorodé, pravidelného kulového tvaru, pevné, s dobrými průtokovými vlastnostmi, velký povrch c) inertní vůči izolovaným látkám (nízká nespecifická sorpce) d) přítomnost funkčních skupin, které lze aktivovat pro kovalentní vazbu afinantu nebo modifikovat e) dostatečné množství funkční skupin - dostatečná koncentrace afinantu pro vazbu izolované látky f) mechanická a chemická stálost nosiče během vazby ligandu, adsorpce a eluce g) odolnost vůči mikrobiálním a enzymatickým účinkům AC 5

7 PEVNÉ NSIČE PR AC hydrofilní, porézní, odolné vůči mikrobům a enzymatickým účinkům; mechanická a chemická odolnost 1. AGARÓZVÉ DERIVÁTY Agaróza: neutrální lineární polysacharid, D-galaktóza + 3,6-anhydro-L-galaktóza spojené glykosidickou vazbou a-1,3 a b-1,4 nejvíce používaný nosič v AC (SEPHARSA) používá se i v SEC a modifikovaná v IEC hydrofilní gel s dostatečně velkými póry nízké nespecifické interakce stabilní v rozmezí ph 4-9 a teplot 0-40 C kompatibilní s organickými rozpouštědly (až 50 %) malá mechanická odolnost, mikrobiální atak AC 6

8 2. PLYAKRYLAMIDVÉ A HYDRXYALKYLMETHAKRYLÁTVÉ GELY NH 2 inertní hydrofilní gely (Bio-Gel) neobsahují nabité funkční skupiny, nedochází k iontové výměně nízká porozita syntetické materiály, nejsou napadány mikroorganismy stálé v rozmezí ph 1 10 (PAM) mechanicky odolné C CH 2 CH CH 2 CH C NH CH 2 NH C CH 2 CH CH 2 CH C CH 2 CH C NH 2 CH 2 CH C NH 2 NH CH 2 NH C CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH C C HEMA gely inertní hydrofilní gely, syntetické stabilní chemicky (ph 2-12) a mechanicky ve formě kuliček o velikosti μm HEMA x ethylenglykolmethakrylátový gel SPHERN TYPEARL : nižší nespecifické interakce NH 2 NH 2 AC 7

9 Struktura HEMA polymeru kolona Separon Hema (Spheron) od firmy Tessek kopolymer ethylen dimethakrylátu a hydroxyethyl methakrylátu biokompatibilita výroba měkkých kontaktních čoček publikováno: Jiří Čoupek, Ivan Vinš, Journal of Chromatography A, 658 (1994) , Hydroxyethyl methacrylate-based sorbents for high- performance liquid chromatography of proteins AC 8

10 3. CELULÓZVÉ DERIVÁTY Celulóza: lineární polysacharid, D-glukózové jednotky spojené vazbou β-1,4 nejstarší nosič pro afinanty, většina metod vazby vypracována pro celulózu typická fyzikální struktura s velkými póry, vysoce hydrofilní komerčně dostupný aktivovaný celulózový nosič Sepharosa CH, CNBr, Epoxy, Thiol Activated 4. DEXTRANVÉ GELY Dextran: větvený polysacharid, D-glukózové jednotky spojené glykosidickou vazbou a-1,6 (přímá), větvení a-1,2/1,3/1,4 Sephadex, Superdex hydrolýza glykosidické vazby při nízkém ph malá mechanická odolnost mikrobiální atak AC 9

11 5. Porézní SKLA afinant kovalentně vázán na povrch skla díky volným SiH skupinám navázání afinantu velmi špatně rozpustného ve vodě 6. Silikagel, Al 2 3, Ti 2, Zr 2 Silikagel: nutná modifikace povrchu (SiH) zavedení reaktivní epoxy skupiny, mechanická odolnost, omezená ph stabilita (2-8), nespecifické interakce Anorganické oxidy: Ti 2 a Zr 2 snesou extrémní podmínky, Al 2 3 se rozpouští při ph<3 a >12 7. KMERČNÍ AFINANTY VÁZANÉ NA NSIČ určeny pro konkrétní bioseparace Con A Sepharose 4B: agaróza s navázaným konkanavalinem A, analýza glykoproteinů AC 10

12 TSKgel Heparin-5PW hydrofilní polymer, velikost pórů 1000 Å, rozsah ph 2 12 imobilizovaný ligand: 4-6 mg heparinu/ml gelu adsorpční kapacita: 2-3 mg lidského antitrombinu III/mL gelu izolace a čištění koagulačních faktorů, lipoproteinů a lipoproteinových lipáz, DNA a RNA polymeráz, ostatní enzymy AC 11

13 2. VLBA AFINANTU A JEH VAZBA volba afinantu závisí na druhu a vlastnostech izolované látky (povaha a mechanismus interakce, afinita k ligandu) na vhodný afinant se izolovaná látka váže pevně, specificky a reverzibilně příklad afinantů: heparin pro lipázy či lipoproteiny, nativní protein A (příp. rekombin. protein G) pro IgG, boronát pro cis-dioly (vč. nuleotidů a glykopeptidů), polymyxin pro endotoxiny Ligandy pro skupinově specifické separace širší aplikovatelnost, komerční dostupnost konkanavalin A + glykoproteiny Ligandy pro monospecifické separace strukturně a biologicky příbuzné s cílovou molekulou, specifický ligand pro každý jednotlivý případ pepsin + 3,5-dijodo-L-tyrosin AC 12

14 Skupinově selektivní ligand konkanavalin A lysin arginin p-aminobenzamidin heparin Specifita glukopyranosyl- a manopyranosylové skupiny ribosomální RNA serinové proteázy serinové proteázy lipoproteiny, steroidní receptory, hormony TSKgel ABA-5PW Ligand: p-aminobenzamidin (ABA)-napodobuje inhibitor serinové proteázy Aplikace: trypsin, krevní koagulační faktory, urokináza Adsorpční kapacita: 3-4 mg trypsinu/ml gelu TSKgel Heparin-5PW Ligand: 4-6 mg heparinu/ml gelu Aplikace: koagulační faktory, lipoproteiny a lipázy, DNA a RNA polymerázy a jiné enzymy Adsorpční kapacita: 2-3 mg lidského antithrombinu III/mL gelu AC 13

15 TSKgel Boronate-5PW Ligand: m-aminofenylboritá kyselina Aplikace: glykoproteiny, nukleázy, nukleotidy, katecholaminy, sacharidy, trna Adsorpční kapacita: 40 μmol sorbitolu/ml gelu TSKgel Tresyl-5PW Ligand: 20 μmol CH 2 S 2 CH 2 CF 3 /ml gelu Aplikace: aktivovaný nosič imobilizace ligandů s reaktivní amino-, thiol-, fenolnebo imidazolovou skupinou TSKgel Chelate-5PW Ligand: ~20 μmol iminodioctové kyseliny/ml gelu Aplikace: proteiny z krevní plazmy, laktoferin, proteinázy (kolagenáza), granulární proteiny, interferony (proteiny nespecifické imunity) Chelatační kapacita: ~ 20 μmol Cu 2+ nebo Zn 2+ /ml gelu AC 14

16 nosič aktivace nosič s aktivními funkč. skupinami imobilizace afinitního ligandu blokace nezreag. funkčních skupin naplnění kolony afinitní stacionární fáze Aktivace nosiče epoxy skupinami (bisoxiran) bromkyanovou metodou (CNBr) divinylsulfonem (DVS) organickými sulfonyloxidy tosylchlorid p-toluensulfonylchlorid tresylchlorid 2,2,2-trifluoroethansulfonylchlorid AC 15

17 Imobilizace afinantu na nosič metoda vazby správné vazebné místo prostorová přístupnost koncentrace ligandu Aktivní skupina Reagující skupiny ligandu Reakční podmínky epoxy -NH 2, -H, -SH, -CH ph 5-12 doba 4-72 hod teplota 4 60 C bromkyan -NH 2 doba 1-12 hod ph 7-10 teplota 4 25 C divinylsulfon -NH 2, -H, -SH ph 6-11 doba 2-24 hod teplota 4 25 C tresyl -NH 2 doba 2-16 hod ph 7-9 teplota 4 25 C AC 16

18 Imobilizace afinantu na nosič správné vazebné místo prostorová přístupnost Pro dosažení dostatečné izolace biologicky aktivních látek je důležitá volba správného místa vazby afinantu k nosiči a prostorová přístupnost afinantu pro makromolekulu. Mezi afinant a povrch nosiče se často vkládá tzv. spacer oddalovací raménko. VLBA SPRÁVNÉH MÍSTA VAZBY N NH 2 N NH(CH 2 ) 6 NH N N NH(CH 2 ) 6 P P CH 2 N N N N CH 2 P H H H H AC 17

19 VLIV SPACERU N H S CH 2 H H H H NHCH 2 CH 2 NHCCH 2 NH S CH 2 H H H H NHCH 2 CH 2 CH 2 NHCH 2 CH 2 CH 2 NHCCH 2 CH 2 CNH S CH 2 H H H H Aktivita afinantu se vazbou na nosič snižuje. I při optimálním způsobu připojení afinantu k nosiči je interakce s izolovanou látkou slabší než při vazbě analytu na volný ligand. AC 18

20 Imobilizace afinantu na nosič metoda vazby správné vazebné místo prostorová přístupnost koncentrace ligandu koncentrace afinantu na nosiči nedostatečná použití chromatografické kolony s dostatečnou délkou příliš silná afinita izolované látky k ligandu - snížení koncentrace navázaného afinantu, naředění čistým nosičem určení množství imobilizovaného ligandu diferenční metoda (m celk. m nezreag. ) přímá spektroskopie kyselá/enzymová hydrolýza hydrolýza vazby mezi afinantem a nosičem elementární analýza S, I, N, P analýza radioaktivních izotopů 3 H, 32 P, 57 Co AC 19

21 Blokace nezreagovaných funkčních skupin vazba vhodné látky na zbytkové aktivní skupiny nosiče, např. glycin, glycerol, ethanolamin hydrolýza zbytkových aktivních skupin v alkalickém prostředí Imobilizace ligandu a blokace zbylých funkčních skupin AC 20

22 3. PDMÍNKY SRPCE A ELUCE kondicionace nosiče s afinantem při optimálních podmínkách interakce (iontová síla, ph) dávkování vzorku prostředí o nízké iontové síle sorpce izolované látky závisí na její povaze a interakci s afinantem je ovlivněna průtokovou rychlostí a teplotou elučního činidla a dávkovaného vzorku eluce sorbované látky: změnou ph, iontové síly nebo teploty pufrů nespecifická (neselektivní) eluce přídavkem disociačních činidel (roztok inhibitoru či substrátu u enzymů) - specifická (selektivní) eluce izokratická eluce: stejné složení mobilní fáze gradientová eluce (ph, iontová síla, koncentrace disoc. činidla, T) eluce závisí na druhu sorbované látky, nosiče a afinantu, druhu a intenzitě interakce AC 21

23 Použití AC izolace/přečištění/prekoncentrace proteomika genomika lékařská analytika: enzymy, hormony, viry a jejich genetický fond, rakovinotvorné markery, protilátky, léky, drogy stanovení vazebných konstant AC 22

24 Afinitní chromatografie proteinů semenné plazmy kolona Toyopearl s heparinem proteiny semenné plazmy kančí (A), býčí (B), lidské (C) eluce změnou pi (NaCl v 0,02M Tris-HCl ph 7,5) pík 1=proteiny nevážící se na heparin, pík 2= proteiny vážící se na heparin AC 23

25 2D kapalinová chromatografie pro kvantifikaci monoklonálních protilátek Afinitní chromatografie na koloně s imobilizovaným proteinem A, izolace protilátky ze složité matrice gradientová eluce, MF: A)fosforečnanový pufr, ph 7, mm NaCl, B) HCl, ph 1, mm NaCl UV nm Reverzní chromatografie na krátké koloně, odsolení a zakoncentrování vzorku před MS detekcí gradientová eluce, MF: A) 0,1% kyselina mravenčí, B) MF A v acetonitrilu MS detekce AC 24

26 Monitorování obsahu glukózy v krvi pomocí afinitní chromatografie glykovaného hemoglobinu koncentrace glykovaného hemoglobinu představuje integrované hodnoty glukózy v předchozích 8-12 týdnech - HbA1c je diabetický marker afinitní boronátová chromatografie separace celkového glykovaného hemoglobinu, tj. včetně α-řetězce a glykovaného lysinového konce glykované hemoglobiny se navazují svými 1,2-cis-diolovými skupinami (vzniká pětičlenný kruh) neglykované hemoglobiny se nezadržují, eluují jako první glykované hemoglobiny jsou z boronátové vazby eluovány sorbitolem detekce frakcí fotometricky při 413 nm komerčně připravené kolony pro PCT (laboratoř u lůžka pacienta) automatizovaný analyzátor Premier Hb9210 analýza plné krve, výsledek za 66 sec, přesnost stanovení <2% AC 25

27 Afinitní boronátová chromatografie využívá tvorby kovalentní vazby mezi kyselinou aminofenylboritou a glykany obsahující galaktózu či manózu za vzniku diesterů reakce probíhá v alkalickém prostředí, snížením ph či použitím sorbitolu jsou zachycené glykoproteiny z kyseliny boronové uvolněny AC 26

28 Analýza vazby ligandu a biopolymeru Určení disociační konstanty K komplexu (biopolymer-zakotvený ligand) význam pro posouzení praktické použitelnosti nosiče se zakotveným afinantem vazba na imobilizovaný ligand bývá slabší než na ligand volný hodnota K musí ležet v intervalu mol l -1 1 V R V 0 = K V 0 V M c L V M -mrtvý objem kolony V 0 -eluční objem nezadrž. biopolymeru V R -eluční objem studovaného biopolymeru c L -koncentrace vázaného ligandu AC 27

29 Určení disociační konstanty K komplexu (biopolymer-volný ligand) vychází z předpokladu, že oba ligandy (volný i zakotvený) se váží na biopolymer kompetitivně (metoda kompetitivní eluce) na kolonu s vhodným afinantem naneseme biopolymer k eluci použijeme určitou koncentraci kompetitivního ligandu (c L ) a změříme eluční objem biopolymeru V R provedeme sérii pokusů s různými koncentracemi ligandu, získáme různé eluční objemy 1 V R V 0 = K V 0 V M c L + K c L V 0 V M c L K V M -mrtvý objem kolony V 0 -eluční objem nezadrž. biopolymeru V R -eluční objem studovaného biopolymeru c L -koncentrace vázaného ligandu c L koncentrace volného ligandu K -disociační konstanta komplexu (biopolymer-vázaný ligand) AC 28

30 IMAC Afinitní chromatografie na vázaných kovových iontech (Immobilized Metal Affinity Chromatography) afinita některých bílkovin k iontům kovů, imobilizovaným na pevném nosiči ve formě chelátu: Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+, Co 2+ vhodné pro proteiny s atomy N, S, nebo P vazba na kov přes aminokyseliny His, Cys, Trp, Glu, Asp, Tyr, Lys, Arg protein vytěsní slabě vázané molekuly ligandů (vody) z komplexu a nahradí je vysoký stupeň přečištění a zakoncentrování (až x) v jednom stupni díky vysoké selektivitě interakce AC 29

31 IMAC-Co 2+ izolace rekombinantních proteinů značených His (His-tag) izolace a stanovení markeru PSMA pro karcinom prostaty (prostate-specific membrane antigen) chelatující ligand iminodioctová kyselina IDA koordinační vazba Co 2+ -biopolymer AC 30