Imobilizace enzymů. levný, inertní,, mechanicky pevný, chemicky stabilní

Transkript

1 Imobilizace enzymů enzymy - průmyslov myslové použit ití biokatalytické konverse bioanalytické aplikace, enzymové sensory ekonomický aspekt - snížen ení výrobních nákladn kladů enzymových procesů díky opakovanému použit ití dlouhodobá stabilizace enzymové aktivity snadná separace výsledného produktu dvoufázový systém, enzym zachycen na heterogenní fázi substrát, t, produkt volně v roztoku realizace kontinuáln lně pracujících ch procesů (enzymové reaktory) nevhodné,, pokud je i enzymový substrát t nerozpustný Ideáln lní nosič enzymu levný, inertní,, mechanicky pevný, chemicky stabilní zachovává nebo zvyšuje specifitu enzymu (dána poměrem k cat /K m ) snižuje inhibici enzymu produktem posunuje ph optimum enzymu žádaným směrem zabraňuje mikrobiáln lní kontaminaci omezuje nespecifickou adsorpci 1

2 Způsoby imobilizace a adsorbce b kovalentní vazba c zachycení v polymeru, "entrapment" d zachycení v membránov novém váčku, "cofinement"" Volba nosiče nízká cena (po zničen ení enzymové aktivity se vyhodí) drahé nosiče - při i malém m rozsahu procesu, případnp padně pokud je lze použít t opakovaně (opakovaná imobilizace enzymu) uplatní se forma, tvar, mech. stabilita, hustota, porosita, distribuce velikosti pórů, p, povrchový náboj n (posun ph optima reakce), hustota reaktivních skupin (vazebná kapacita) speciáln lní vlastnosti magnetismus rozklad nežádouc doucích ch produktů (Mn 2 a peroxid vodíku) povrch s redukčními vlastnostmi (Ti 2 ) Geometrické uspořádání částice ( beads( beads ) definovaná velikost a porosita filmové povlaky tenké vrstvy na vhodném m neutráln lním m nosném m materiálu membrány současn asně je možné realizovat biokatalytickou reakci a separaci na základě rozdíln lné velikosti substrátu tu a produktu vláknit knité materiály vysoký podíl l povrchu velká objemová aktivita pěny - zachycení uvnitř (polyurethany) Struktura mikroporesní 0.1 aža 10 nm mesoporesní 3 aža 10 nm srovnatelné se velikostí enzymů makroporesní 8 aža 1000 nm,, povrch 25 aža 100 m 2 /g neporesní výborná průto točnost, ale malá kapacita a malý povrch gelovitá nemá stálé póry, ty vznikají až při i nabobtnání; ; obdoba neporesního uspořádání 2

3 Adsorpce enzymů na nosič jednoduchý, široce použitelný postup velmi mírnm rné podmínky, zachování aktivity není kovalentní vazba, není narušen ení konformace reversibilita jak enzymu (purifikace), tak vlastní matrice obojí lze regenerovat a použít t znovu možnost vysokých obsahů (až 1 g enzymu na 1 g nosiče) ale slabá interakce enzymy se mohou postupně spontánn nně uvolňovat ovat z matrice zúčastněné interakce nespecifické (van der Waalsovy síly, vodíkov kové můstky, hydrofilní interakce): PG, silikagely biospecifické přes ligand interagující s enzymem (mimo aktivní místo) interakce s imobilizovanými barvivy nebo ionty kovů iontové interakce (ionexy) hydrofobní interakce: PET, HDPE, polyethylentereftalát,, latex (polystyren), poly(st (ST-DVB), amberlit XAD, silikáty, zeolity, talek částečná desolvatace v průběhu vazby na nosič,, můžm ůže e docházet ke změnám konformace stabilizace, změny aktivity a specifity katalyzované reakce Iontové interakce syntetické pryskyřice (SP) kopolymery akrylamidu a kys.. maleinové nebo itakonové, fenolformaldehydové kondenzáty SP s povrchovými skupinami Dowex, Amberlit, Duolit polysacharidové deriváty DEAE-celulosa, DEAE-dextran dextran,, DEAE- Sephadex,, M-celulosa, H-Sepharosa Sepharosa,, AH-Sepharosa Sepharosa,, Q-Q Sepharosa,, S-SepharosaS Sepharosa DEAE diethylaminoethyl,, M --H 2 -H, H -NH(H 2 )H, AH NH-(H 2 ) 6 -N, Q -H 2 -N + ( ) 3, S -H 2 -S 3 H všeobecně velmi hydrofilní materiály, náboj n závisz visí na ph okolního roztoku důležitou roli hrají podmínky, zejména ph, při p i adsorpci Invertasa Typ nosiče % vazby DEAE-Sephadex M-Sephadex (anex) (katex) ph ph ph

4 Kovalentní imobilizace enzymů poresní / neporesní nosiče, vzájemn jemná velikost pórůp a molekul enzymu povrchová hustota navázaných molekul reaktivní skupiny dostupné na speciáln lních nosičích H a b c d N 2 N== N 3 e f g h N a anhydrid, b karbonát, c aldehyd, d epoxid, e azid, f isothiokyanát, g nitrofenylester karboxylové kyseliny, h azlakton typické množstv ství 0.02 g enzymu na 1 g nosiče Silikagel "silica", Si 2 x H 2, voda chemicky vázaná v nestechiometrickém m poměru, obsahuje vazby siloxanové (Si--Si) Si) silanolové (Si-H) - aktivují se silanizací amorfní struktura, výborná mechanická stabilita - vysoké tlaky omezená ph stabilita (mezi 2 a 8), náchylnýn na nespecifické interakce Porezní sklo PG, "controlled pore glass" výborné mechanické vlastnosti pro techniky pracující s vysokými tlaky poměrn rně křehké,, při p i aktivacích ch raději jemně třepat a nemíchat při i výměně roztoků je dobré používat vakuum, aby se odstranily bublinky zachycené v pórech příprava prava - borosilikátov tové sklo se zahřeje - dojde k separaci borátov tové a silikátov tové fáze, boráty se odstraní vylouhováním, vzniknou uniformní póry v alkalické oblasti nad ph 8 se rychle degraduje nízká nespecifická adsorpce 4

5 Vlastnosti PG Průměr r pórůp (nm) Plocha (m 2 /g) Silanizace aktivace inertních povrchů pokrytých vrstvou oxidu (sklo, silikáty ty, slída, oxidy kovů) v hydratovaném m stavu obsahuje hydroxylové skupiny, např.. Si- H, silanolový zbytek reakcí se silany y vzniká spontánn nně uspořádan daná vrstva obvykle několik n kolik vrstev, ne monovrstva nepoužívají se organické halogenované silany (jsou přílip liš reaktivní a žádná další skupina užu by nezbyla), ale méněm reaktivní alkoxyderiváty silanizací se na povrch modifikovaného nosiče e zavedou vhodné reaktivní skupiny X R R Si X H R Si X H RH Si X 5

6 Silanizační činidla aminosilany (H APTES 3 ) 3 Si ( ) 3 -NH 2 (3-aminopropyl) aminopropyl)-triethoxysilan APDEMS (3-aminopropyl) aminopropyl)-diethoxy-methylsilan APMES (3-aminopropyl) aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilan, monofunkční - vede ke vzniku monovrstvy H 3 Si ( ) 3 -NH 2 Si ( ) 3 -NH 2 glycidoxysilany GPS glycidoxypropyl-trimethoxysilan GPMES (3-glycidoxypropyl) glycidoxypropyl)-dimethyl-ethoxysilanethoxysilan merkaptosilany MPTS (3-mer merkaptopropyl) aptopropyl)-trimethoxysilantrimethoxysilan MPDMS (3-mer merkaptopropyl) aptopropyl)-methyl-dimethoxysilan ( ) 3 Si ( ) 3 Si Si H H 2 ( ) 3 -SH H H 3 Si ( ) 3 -SH Agarosa (Sepharosa) H H polysacharid tvořen z D-galaktosy a 3-anhydrogalaktosy poly-{β-1,3 1,3-D-galaktosa-α-1,4-(3,6-anhydro) anhydro)- -L-galaktosa} sekundárn rní a primárn rní struktura je komplexní,, vláknit knitá s přítomnými póryp přirozená je mechanicky labilní (zahřátím nad 40 º se rozpouští) modifikuje se zesíťov ováním pomocí epichlorhydrinu nebo divinylsulfonu ztratí se tím t část využitelných hydroxylových skupin zesítěná je relativně stabilní (rozpouštědla mísitelnm sitelná s vodou, ph 3 až 14), neměla by se nechat vyschnout H H 6

7 Sepharosa nejběž ěžnější je Sepharosa L-6B zavedená firmou Pharmacia (Amersham Biosciences,, dnes GE Healthcare) L = crosslinked,, 6B = 6% beaded agarose póry dostatečné pro biomolekuly do 1 MDa,, varianty 2B a 4B do 10 MDa nosič dodávaj vají i firmy BioRad jako Bio-Gel A a IBF jako Ultrogel pro aktivaci vhodné metody zaměř ěřené na hydroxylové skupiny Sepharose High Performance Forma (částice vesměs 90 µm) 6% highly cross-linked agarose (34 µm) 6 Fast Flow 4 Fast Flow L-6B L-4B 6B 4B 6% highly cross-linked agarose 4% highly cross-linked agarose 6% cross-linked agarose 4% cross-linked agarose 6% agarose 4% agarose Preaktivované Sepharosy NHS-activated Sepharose High Performance NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow NBr-activated Sepharose 4 Fast Flow EAH Sepharose 4B EH Sepharose 4B Epoxy-activated Sepharose 6B Activated Thiol Sepharose 4B Thiopropyl Sepharose 6B 12-atom. hydrofil. můstek, přes -NH 2 viz výše vazba primárních -NH 2 skupin 10-atom. můstek, přes -NH 2 9-atom. můstek, přes -H 12-atom. hydrofil. můstek, přes -H, -NH 2 nebo -SH skupiny 10-atom. můstek pro reversibilní vazbu přes volné thioskupiny 4-atom. hydrofilní pro reversibilní vazbu proteinů a thiolovaných ligandů. Reaguje i s těžkými kovy, alkyl- a arylhalogenidy a dává adiční reakce s =, = a N=N vazbami 7

8 Aktivace -H v sacharidových matricích ch epoxyskupiny (bisoxiran, epichlorhydrin) bromkyanová metoda divinylsulfon =H-S 2 -H= R-NH 2 (R-H, R-SH) H - - -S 2 -H= - - -S NH-R sulfonylchloridy tosylchlorid = p-toluensulfonylchlorid tresylchlorid = 2,2,2-trifluorethansulfonylchlorid l-s 2 tosylchlorid l-s 2 - F 3 tresylchlorid R-NH 2 H-S 2 - F 3 H -S 2 - F 3 NH-R Dextranové nosiče materiály Sephadex, Superdex glukosové jednotky spojené 1,6 vazbou, větvení i přes p 1,2 / 1,3 a 1,4 spoje mechanicky málo m stabilní náchylné na bakteriáln lní degradaci glykosidické vazby nestabilní při nízkém ph H H H H HH H H H 8

9 elulosa použit ití není tak běžb ěžné,, spíš íše e v průmyslov myslové oblasti H velmi často se objevuje ve formě membrán H lineárn rní polymer z 1,4-β-D-glukosových jednotek nativní polymer je ve formě vláken bez poresní struktury, reinformovaná celulosa je ve formě kuliček snáší ph 3 aža 10, stabilnější je při p i kyselé oblasti ph,, při p ph 7 můžm ůže být autoklávov vována vláknit knitá celulosa se dodává jako suchý práš ášekek Whatman, BioRad, Schleicher & Schuell v roztoku je náchylnn chylná na mechanické poškozen kození (NE magn.. míchm chání) aktivace - karbonyldiimidazol a divinylsulfon chloroformiát H H l--- - Hl, H celulosové částice, průměr r kolem 450 µm R-NH 2 H N H R H Polyakrylamidové nosiče v biochemické oblasti velmi oblíben bené připravují se kopolymerací akrylamidu a N,N -methylen methylen- bis(akrylamidu akrylamidu), probíhá radikálovým mechanismem v přítomnosti tetramethylendiaminu (TEMED) a peroxodvojsíranu ranu amonného jako iniciátoru Bio-Gel P dodává materiál l firma BioRad póry poskytují vylučovac ovací limity od 2 do 400 kda nízké nespecifické vazby dobrá ph stabilita (2 10) nevýhodou je malá mechanická stabilita variabilita matrice při p i změně složen ení pufrů nízké průto točné rychlosti aktivace se nejsnáz provádí částečnou hydrazinolýzou při i 50 º dostupné jsou i preaktivované materiály (Enzacryl( Enzacryl) glutaraldehydem - uplatní se adice amidové skupiny na dvojné vazby přítomnp tomné v polymerní formě glutaraldehydu. 9

10 Trisacryl kopolymerace: dodává IBF N-akryloyl-2 amino-2 hydroxymethyl- 1,3 propandiol H 2 N (H H H 2 H) 3 + H 2 N H H N H H H H H 2 HH N,N -diallyltartradiamid NH-( H) 3 - -H- -H- -H- NH H-H H-H NH NH-( H) 3 - -H- -H- tris(hydroxymethylov hydroxymethylové) ) uskupení poskytuje materiálu výborné hydrofilní vlastnosti zesíťovaný charakter přinp ináší zlepšen ení mechanických vlastností oproti polyakrylamidu tolerance ph je od 1 do 11 snáší zmražen ení,, teploty do 120 º a organická rozpouštědla aktivace je možná pomocí karbonyldiimidazolu bromkyanu divinylsulfonu trisacryl NH-( H) 3 Sephacryl na bázi b dextranového gelu s vnesenými allylovými postranními skupinami zesíťovanými pomocí N,N -methylen methylen-bis( bis(akrylamidu) obsahuje tedy lineárn rní glukosové řetězce spojené přes molekuly bis(akrylamidu akrylamidu) ) a také lineárn rní části polymerního bis(akrylamidu akrylamidu) Sephacryl S-300 a S-400 S - vylučovac ovací limity 1,5 a 8 MDa gely HR řady - vylepšen ené průto točné vlastnosti materiál l je dostatečně chemicky i mechanicky odolný aktivace - přes es sekundárn rní hydroxylové skupiny 10

11 Methakrylátov tové matrice H H H I H H n H II H H 2 III H 3 H TSK-Gel Toyopearl (vyr. Tosoh,, distribuce Merck jako Fractogel TSK) kopolymerace glycidylmethakrylátu tu, pentaerythritol dimethakrylátu tu a polyethylenglykolu - velký počet hydroxylů a etherových vazeb částečně hydrofilní,, výborné mech. vlastnosti, tolerancí ph 2 aža 12 velikosti S ( superfine( superfine,, 20 aža 40 µm), F ( fine( fine,, 30 aža 60 µm) a ( coarse,, 50 aža 100 µm) H H H TSK n I pentaerythritol dimethakrylát II polyethylenglykol III glycidylmethakrylátu HEMA H H + H H 3 H- - - n H H H 3 H 2 poprvé připraven v Československu vzniká kopolymerací 2-hydroxyethylmethakrylátutu se síťujs ujícím ethylendimethakrylátem tem zesíťovan ovaná struktura vytváří makro i mikropóry ry,, které poskytují vysokou odolnost vůčv ůči i tlaku chemická odolnost je pro ph 2 aža 12 tepelná odolnost aža do 170 º dodávan vané velikosti částic jsou 5, 10 a 60 µm v tuzemsku nyní vyrábí firma Tessek, k dispozici i předaktivované matrice s různými reaktivními skupinami 11

12 H 2 NH- -NH + H 2 NH 2 + H 2 H H H 2 H H 2 N H 3 H N H H 2 N H Eupergit H NH 2 H H H kopolymerací methakrylamidu,, N,N -methylen methylen-bis(methakrylamidu) ) a složky s oxiranovou skupinou, glycidylmethakrylátu tu nebo allylglycidyletheru (na obr. dole) Rohm Pharma,, v USA jako Spectra/ryl porézn zní částice 30, 150 a 250 µm, neporézn zní 1 µm, mechanická stab. imobilizace probíhá adicí na oxiranové uskupení reagovat mohou primárn rní aminy, sulfhydrylové skupiny či i hydroxyly doporučov ována přítomnost p fosfátov tového pufru,, urychlí se tím t m reakce a můžm ůže probíhat blízko neutráln lního ph Srovnání reakčních parametrů 12

13 Relativní užitečnost aa pro imobilizaci AA zbytek bsah Dostupnost Reaktivita Stabilita spojení Použití Asp Arg ± - ys - ± cystin + - ± ± - Glu His ± Lys Met - - ± - - Ser ++ + ± + ± Thr ++ ± ± + ± Trp ± - Tyr _+ + konec N konec sacharid. zbytek - ~ ± rientace enzymu nesmí dojít t (a) ke změně konformace vazebného místa, m aby docházelo k optimální vazbě substrátu tu (b) nevhodné je nepřístupn stupné aktivní místo (c) v důsledku d sterické zábrany méně efektivní až nefunkční může e být vazebné místo deformované v důsledkud distorse (d) v obou případech p padech můžm ůže e pomoci "oddálen lení" " molekuly enzymu od nosiče e použit itím m vhodně dlouhého ho raménka (spacer, linker, ) 13

14 Zachycení enzymu v polymeru může e se jednat o čistě fyzikáln lní zachycení na základz kladě velikosti v gelu, zapolymerování uvnitř vhodné matrice kombinace zachycení a kovalentní vazby derivatizace lyzinových zbytků akryloylchloridem =H- -ll vzniklý na enzym vázaný v akrylamid se pak kopolymerizuje s klasickou směsí akrylamidu a bisakrylamidu vhodné pro imobilizaci "komplexnější ších" systémů obsahujících ch daný enzym (buňky, organely, ) metoda je vhodná pouze pro enzymy účinkující na nízkomolekuln zkomolekulární substráty ty stabilita chymotrypsinu v závislosti z na způsobu imobilizace volný (a), derivatizovaný akryloyl l (b) zachycený v polymethakryl. gelu (d), kombinovaně (c) Gelové matrice enzym se zachytí v průběhu přípravy p pravy gelu alginát, chitosan, želatina, PAG, PVA plus MNH další ších polymerů vznikne tak monolitický materiál enzym se nechá vsáknout do hotového gelu ve formě kuliček (Sepharosa, Sephadex) a následnn sledně se chemicky zesíťuje (glutaraldehydem) prosté zesíťov ování nedává geometricky definované tvary "smart" polymery - mění vlastnosti pod vlivem externích vlivů (ph, teplota, iontová síla) a mohou tak cílenc leně např.. uvolnit vázaný v enzym do roztoku 14

15 Sol-gel imobilizace sol-gel proces vznik skla hydrolytickou polymerací monomole- kulárn rních prekursorů ( ) 4 Si tetramethyl-o-křemi emičitan itan (TMS): ( ) 4 Si + H 2 2 ( ) 3 Si-H 2 ( ) 3 Si-H enzym Si x y (µ-h) z (t-h) 4x ( ) 3 Si-H + H ( ) 3 Si--Si(H Si( ) 3 + H 2 ( ) 3 Si- + -Si(H 3 ) 3 + H - H sol 4x-2y 2y-2z2z gelovatění gel zachycení v pórechp stárnut rnutí a vysychání Si x y + zh + + (2x-y-z) H 2 xerogel (mech. stabilní) Zachycení v membránových systémech enzym je od pracovního prostřed edí oddělen semipermeabilní membránou, průchoz chozí pro substráty ty a produkty membránov nová dutá vlákna "hollow fiber membranes" obsahují enzym uvnitř,, pracovní roztok proudí okolo povrch membrány i více v než 20 m 2 /l jednoduché - není třeba nic optimalizovat relativně drahé membrána můžm ůže e být i ve formě váčků ("droplets") enzym se rozpustí ve vodném m roztoku 1,6-diaminohexanu disperguje se v roztoku 1,6-hexandiov hexandiové kyseliny v chloroformu vzniknou kapičky ky enzymu obalené tenkou membránou nou z nylonu (Nylon-6,6) je možné použít t i liposomy s enzymem uvnitř 15

16 Srovnání imobilizačních postupů harakteristika Adsorpce Kovalentně Entrapment Zachycení v membráně Příprava snadné obtížné obtížné snadné Náklady nízké vysoké střední vysoké Vazebná síla různé silné slabé silné Únik enzymu ana ne ano ne Použitelnost široká selektivní široká univerzální Pracovní problémy vysoké nízké vysoké vysoké Matricové efekty ano ano ano ne Velká difúzní bariéra ne ne ano ano chrana před mikroby ne ne ano ano Vliv imobilizace na ph optimum náboj nosiče e posouvá ph optimum důsledek partitice H + iontů v mikrookolí enzymu na povrchu nebo v pórech nosiče posun ph pracovního roztoku můžm ůže e být výhodný pro zlepšen ení rozpustnosti substrátu tu či i produktu nativní enzym v roztoku imobilizace na kladně nebo záporně nabitý nosič 16

17 Difúzn zní vlivy substrát t se musí dostat z okolního prostřed edí do aktivního místam překonává se nemíchan chaná vrstva na povrchu nosiče - externí difúze poté se pohybuje uvnitř pórů nosiče - interní difúze koncentrační gradienty substrátu tu a produktu v případp padě poresního nosiče a pouze reakce a interní difúze b navíc c partitice S a P v mikro prostřed edí nosiče c jako a, navíc c externí difúze d kombinace difúzn zních ch a parti- tičních efektů partitiční vrstva je cca 1000x tenčí než difúzn zní vrstva Difúzn zní kontrola enzymové konverze při i imobilizování velkého množstv ství enzymu se jeho aktivita jakoby zdánliv nlivě ztrácí efektivní aktivita enzymu na nosiči i je mnohem menší než teoreticky navázan zaná - důsledek difúzn zních problémů - omezený pohyb substrátu tu pozitivní projev - zdánliv nlivá stabilizace imobilizovaného enzymu aktivita skutečně přítomná nalezená aktivita nalezená vnesená aktivita čas 17

18 Imobilizace pro enzymové biosensory imobilizace enzymu na povrch fyzikáln lně-chemického ho převodníku využívaj vají se postupy imobilizace zmíněné dříve i další speciáln lní metodiky nejčast astější jsou enzymové elektrody - kombinace enzymu a elektrochemického ho převodnp evodníku enzymové optody (optrody) - analogie, nosičem je ale obvykle světlovod (optické vlákno) Membrány a biosensory mechanická kontrola transportu imobilizace převodník E E E membrány v biosensorech plní několik funkcí: imobilizace enzymových molekul nosná funkce řízení transportu látek l buď prostřednictv ednictvím m difúzn zní kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferen interferenční) zlepšen ení mechanické stability biokompatibilita 18

19 Rozdělen lení a přípravaprava membrán membrána = porézn zní prostřed edí,, rozdělen ení: hrubě porézn zní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl l hydrostatického ho tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje uje jemně porézn zní - póry 1 aža 5 nm (např.. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí,, permeabilita je dána d velikostí rozpuštěných látekl neporézn zní (husté) - nevykazují porézn zní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí fázová konverze - roztok polymeru ve vhodném m rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpařen ení rozpouštědla polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát t (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) polymerace z mono či i oligomerů přímo na místm stě použit ití (tvorba in situ ) - vhodná k přípravp pravě fragilních gelovitých membrán n (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl l vody dodatečná tvorba pórůp - tzv. nukleárn rní membrány (Nucleopore) vrstva polymeru se prostřílí í urychlenými nukleony, pak se naleptá Úpravy membrán Nucleopore membrána velikost pórůp membrány lze dodatečně změnit nit: zvětšen ení průchodnosti se dosáhne naleptáním m polymeru membrány, které vede ke zvětšen ení průměru ru pórůp alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů zmenšení průchodnosti a zlepšen ení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek l uvnitř pórů např.. organosilanů nebo lipidických látekl symetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná asymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fázíf 19

20 Mechanické zachycení enzymu převodník o-kroužek E E E E E dialyzační membrána nejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodnp evodníku a překryje p se dialyzační membránou alternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrn rné dialyzační membrány Zachycení v gelu želatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při i zvýšen ené teplotě (až 50 o ) a přidp idá se enzym, promích chá se a naleje na podložku (např.. dialyzační membrána) Nafion je polymer rozpuštěný ve směsi si alkoholů s vodou používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměni nič může e zachycovat biomolekuly [(F 2 F 2 ) m F F 2 ] n Nafion F 2 F 3 F F 2 F 2 S 3 H p 20

21 Zachycení v PVA polyvinylalkohol je hydrofilní,, neutráln lní a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; ; dostupný ve formě oligomerů (90 kda), které po zesíťov ování vytvoří konečný ný polymer radiační polymerace využívá ozářen ení směsi si oligomerů a enzymu γ- zářením m (generuje 60 o) vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťov ování výsledná membrána neobsahuje žádné nežádouc doucí produkty a současn asně je sterilizována chemické síťování triisokyanáty ty (TI), spojí postranní hydroxyly N N UV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) vůbec nejšetrn etrnější postup imobilizace pomocí PVA N TI N + H NH zesítění Multifunkční polymery kombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátor torů M E přenášející elektrony, tzv. redox relays E M poly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kda) M se částečně komplexuje s osmiem (mediátor), a částečně se do něj n j kvarternizací zavedou E E aminoskupiny směs s modifikovaného oligomeru, enzymu a činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu H N n parc. komplexace (1/6) + s(bpy) 2 l 2 kvarternizace + 2-bromoethylamin N M M N s(bpy) 2 l H 2 H PEGDE H NH 2 21

22 Zesíťov ování enzymu na povrchu BSA E BSA E BSA E BSA E BSA retikulum H ( ) 3 H glutaraldehyd H + H 2 N Schiffova báze H N redukce (NaBH 4 ) NH zdaleka nejčast astěji se používá glutaraldehyd; ; jeho směs s s roztokem bílkoviny v závislosti z na koncentraci složek vytváří spontánn nně retikulum buď přímo na povrchu sensoru,, nebo na vhodném m podkladovém m materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána) reakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze, která se ještě může e zredukovat na stabilnější aminovou vazbu 22