Postup při adjustaci a kontrole různých metod stanovení koncentrace močoviny v mléce v mléčných laboratořích

Transkript

1 Uplatněná metodika MSM UM 1 - název: Postup při adjustaci a kontrole různých metod stanovení koncentrace močoviny v mléce v mléčných laboratořích Uplatněná metodika a technicko-organizační doporučení, opatření a postupy v systému QA/QC (quality assurance/quality control, zajištění a řízení kvality) k řešení referenčněrutinních systémů analytických laboratoří testace kvality syrového mléka pro zvýšení věrohodnosti výsledků. Cíl uplatněné metodiky: Cílem je zajištění a zvýšení věrohodnosti výsledků a provozní jistoty managementu rutinních mléčných laboratoří při kontrole složení a kvality mléka pro účely kontroly užitkovosti (metodická podpora kontroly zdraví zvířat). Náplň uplatněné metodiky: Implementace dosažených výsledků, získaných na základě předchozího výzkumu a vývoje v rámci řešení projektu MŠMT-ČR, MSM v rámci koordinační a konzultační metodické činnosti Národní referenční laboratoře pro syrové mléko (NRL-SM) Rapotín, do prostředí mlékařských analytických laboratoří Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. Praha. Zdroj uplatněné metodiky: projekt MŠMT-ČR, MSM , Uplatnění evropského modelu multifunkčního zemědělství v LFA oblastech České republiky. Zpracovali dne: Oto Hanuš, Pavel Hering, Libor Janů, Václava Genčurová, Radoslava Jedelská, Jaroslav Kopecký, Alena Dolínková Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Uplatnění bylo provedeno zavedením všech principů metodiky od r

2 Postup při adjustaci a kontrole různých metod stanovení koncentrace močoviny v mléce v mléčných laboratořích Definice metodického problému stanovení koncentrace močoviny v mléce v širších souvislostech Močovina je konečný produkt metabolismu bílkovin v organismu a znalost hladiny vylučované močoviny je jedním z důležitých ukazatelů správnosti sestavení krmné dávky. Močovina jako konečný metabolit je zpracováván kromě jater také v ledvinách, jejichž prostřednictvím je močovina po syntéze v játrech do ledvin transportována a vylučována močí. Močovina je transportována z krve také do mléka. Koncentrace močoviny v organismu během dne kolísá, nejvyšších hodnot dosahuje 4 až 6 hodin po nakrmení, nejnižších hodnot před příjmem potravy. Mezi vlivy, které koncentraci močoviny v organismu a následně v mléce ovlivňují jsou : - příjem proteinu a energie (obecně lze konstatovat, že nadměrný obsah hrubého proteinu v krmné dávce zvyšuje obsah močoviny v mléce a vyšší příjem energie často snižuje koncentraci močoviny v mléce) - příjem proteinu degradovatelného a nedegradovatelného v bachoru - příjem vody a sušiny v krmné dávce (při dehydrataci organismu lze očekávat vyšší hladiny močoviny) - zdravotní stav, zvláště funkčnost jater a ledvin - některá onemocnění - pastva (vyšší obsah močoviny na pastvě) - doba odebrání vzorků mléka V České republice se provádí analýzy vzorků mléka na močovinu jednak ze vzorků určených pro kontrolu mléčné užitkovosti a dále ze vzorků bazénových, určených ke stanovení jakostních ukazatelů mléka. Výsledky obou typů rozborů více či méně využívají jednak faremní zootechnici a zejména pracovníci firem, zabývajících se výživou a krmením hospodářských zvířat. Problémy nastaly, když došlo k převodu vzorků i bazénových z laboratoře centrální do laboratoří chovatelských při přesunu analýz pro zjištění kvalitativních ukazatelů mléka do laboratoří v Buštěhradu a v Brně. Vlivem faktu, že v centrální laboratoři a v laboratořích chovatelských se koncentrace močoviny měřila rozdílnými metodami, došlo samozřejmě i k větším či menším výsledkovým disproporcím. Cílem tohoto příspěvku bylo tedy porovnat jednotlivé metody stanovení koncentrace močoviny používané v laboratořích v České republice. Vzorky, kde se stanovuje koncentrace močoviny v rámci kontroly mléčné užitkovosti, jsou analyzovány metodou enzymaticko-konduktometrickou na přístroji UREAKVANT (UR; obr. č. 2). Vzhledem ke skutečnosti, že touto metodou jsou analyzovány individuální vzorky mléka značné části krav zapojených do KU, lze říci, že tato metoda je v ČR nejpoužívanější. Princip metody, který je specifický, je uznávaný všemi mezinárodními zainteresovanými institucemi (IDF, ICAR-CECALAIT aj.) jako možný pro metody referenční. Princip analýzy je odvozený od funkce enzymového vodivostního biosenzoru, kterým je přístroj UREAKVANT vybaven. Biosenzor se skládá z temperovacího bloku, dvou průtokových elektrod a komory s enzymovým reaktorem. Analýza probíhá tak, že pomocí náběrové pipety a peristaltické pumpy je vzorek mléka dopraven přes temperovací blok a enzymový reaktor. Po ustálení všech chemických a elektrických podmínek se nasávání vzorku do přístroje zastaví. V této fázi se v reaktoru začnou hromadit produkty enzymové hydrolýzy, kterou katalyzuje enzym ureáza, která je navázána na vnitřní vrstvě reaktoru. Produkty reakce močoviny způsobují vzrůst elektrické vodivosti. Rychlost vzrůstu je přímo úměrná ke koncentraci močoviny ve vzorku mléka. Výhodou analýz mléka na stanovení koncentrace močoviny při kontrole mléčné užitkovosti je skutečnost, že rozbor je prováděn ze stejného vzorku, který je určený ke kontrole mléčné užitkovosti. To nabízí chovateli několik možností využití výsledků z laboratoře. Pokud jsou vzorky mléka součástí kontroly užitkovosti, má chovatel možnost stáhnout si z webových stránek nejen výsledky močoviny, ale

3 i vyhodnocení energetické bilance příslušné dojnice. Podmínkou je, aby chovatel byl přihlášen do systému elektronického předávání dat. Další běžně využívanou metodou stanovení koncentrace močoviny v syrovém kravském mléce je analýza pomocí infračerveného spektra. K instrumentálnímu měření koncentrace močoviny jsou využívány moderní přístroje renomovaných výrobců stanovující kromě klasických ukazatelů obsahových složek mléka (tuk, bílkovina, laktóza) také obsah močoviny příp.další ukazatele (např.bod mrznutí, obsah kaseinu, volných mastných kyselin, kyseliny citronové apod.). Tyto přístroje již nejsou konstruovány na základě měření dvěma paralelními optickými filtry (referenčního a měřícího) ale využívají měření interferometru za podpory tzv. Fourierových transformací (obr. č. 3). FT-MIR technologie se jeví jako nadějná pro monitoring zdravotního stavu dojených samic přežvýkavců a usměrňování prevence jejich produkčních a reprodukčních poruch spojených s chybnou výživou a technologiemi v porovnání k jejich vysoké mléčné užitkovosti. Přesto jsou např. při určení mléčné urey upřednostňovány metody přímé, zejména specifické (ureolytické diferenční jako např. AFNOR (Francie) Eurochem (Itálie), Chemspec (Bentley Instruments, USA) nebo UREAKVANT (ČR). Takové je i stanovisko Mezinárodní mlékařské federace IDF ve smyslu probíhající selekce oficiální referenční metody (LEFIER, 1999), kde specifičnost je základní podmínkou. Zde je třeba postupovat diferenční metodou, tzn. porovnat odezvu příslušné reakce před a po ureolýze nebo během ureolýzy a získané parametry, nejčastěji rozdíl, kalibrovat na známé koncentrace močoviny. Ostatní metody stanovení koncentrace močoviny (EH, BI) se využívají spíše v experimentálních podmínkách a provozně se z některých důvodů (pracnost, nákladovost) nepoužívají. Stručný přehled metod v rámci pokusu je obsahem tab. č. 1. Metoda vyhodnocení výsledků jako základ praktických doporučení Do vyhodnocení byla použita sada 10 bazénových vzorků nativního mléka odebraných v letním období 2006 ve vybraných chovech plemen krav České strakaté a Holštýn. Vzorky byly bezprostředně dopraveny do vybraných laboratoří v chladovém režimu. Analýzy vzorků na KMM (7 účastníků) byly uskutečněny v 6 laboratořích (z nichž téměř všechny jsou akreditovány a dvě disponují statutem Národní referenční laboratoř pro syrové mléko) v České republice za použití 4 analytických metod. Artificiální metodické zvýšení koncentrace močoviny v některých vybraných standardních vzorcích nativního mléka (č. 6, 8, 9 a 10) v sadě vzorků ve výkonnostním testu bylo dosaženo provedením přídavků vyšší a vysoké koncentrace močoviny v roztoku mléčné matrice tak, že výsledná koncentrace v takto nově získaných vzorcích měla být o 10 (2 ), 20 (1 ) a 30 (1 ) mg/100 ml vyšší oproti koncentracím základním ve vzorcích původních (č. 4, 7, 2 a 7). Z těchto hodnot byla vypočtena výtěžnost, resp. recovery (v %) jednotlivých metod (pracovišť). Posouzení dosažených výsledků jako základ metodických doporučení Výsledky (Tab. 2) byly vyhodnoceny stanovením Euklidické vzdálenosti pro hodnocení správnosti (věrohodnosti) laboratorních výsledků (obr. 1). Byly vypočteny průměrné odchylky a variability individuálních hodnot těchto odchylek účastníků (laboratoří, metod) od referenčních hodnot a Euklidické vzdálenosti (RE) laboratoří od středu (počátku). Referenční hodnoty byly stanoveny dvakrát. Jednou (I) pro celý soubor a podruhé (II) po vyloučení výsledků dvou nejodlehlejších laboratoří. V tabulce č. 2 a zobrazení (obr. 1) lze nalézt výsledky a pozice laboratoří, resp. metod, z hlediska věrohodnosti měřených výsledků. Pokud jde o recovery, byla tato u vzorků s přídavkem močoviny 10, 20 a 30 mg/100ml následující podle zúčastněných metod: FT-MIR 85,0 69,5 a 95,0 %; UR 1 72,0 58,0 a 96,3 %; UR 2 70,0 74,0 a 95,0 %; EH 85,0 77,5 a 96,7 %; BI 1 65,0 48,5 a 75,3 %; BI 2 42,0 16,0 a 69,0 %; UR 3 71,0 72,0 a 95,3 %. V recovery jsou patrné značné rozdíly mezi metodami. Korelační koeficienty mezi výsledky všech metod navzájem vyjma BI 2 byly vyšší než 0,977. Naopak metoda BI 2 měla vůči všem ostatním metodám korelaci od 0,713 do 0,774. To svědčí o možnosti lokálního vlivu. Metodické a pracovní informace a doporučení pro rutinní mléčné laboratoře: - měření jednotlivými metodami může vykazovat určité diference v závislosti na principu i lokálním provedení. Tyto možné rozdíly jsou zohledněny vyjádřením nejistot výsledků měření, které laboratoře deklarují;

4 - významné je, aby metoda FT-MIR byla adjustována vždy na metody s nejlepší dosaženou recovery a těsnými korelacemi k jiným metodám a výhradně na kvalitních přirozených vzorcích mléka se škálou o dostatečném rozptylu (cca od 10 do 45 mg/100ml). Artificiální přídavky močoviny jsou zde možné; - stejný typ vzorků používat při organizaci výkonnostního testování stanovení mléčné močoviny v rutinních mléčných laboratořích; - použití referenčních a kontrolních vzorků konkrétně příslušných metodě Ureakvant (manipulovaná mléčná báze) není možné pro srovnávání nebo adjustace u MIR-FT, je však možné u zmíněných fotometrických metod; - v každém případě je užitečné podrobně prostudovat relevantní protokol o analýze, kde každá laboratoř vlastnící příslušné akreditační osvědčení musí identifikovat metodu, která byla k analýze mléka použita; - znalost uvedených skutečností je důležitá zejména pro uživatele výsledků naměřených v jednotlivých laboratořích; - výsledky jsou významné rovněž pro uživatele, kteří se z jakéhokoliv důvodu rozhodnou organizovat nějaké srovnávací měření, případně z vlastní vůle zorganizovat mezilaboratorní kruhový test. Tab.1Charakteristiky použitých metod analýz mléčné močoviny. Zkratka Název Princip reakce Princip měření Použitá kalibrace Specifita Zastoupení UR Ureakvant ureolýza močoviny Diference BI BioLaTest Barvení močoviny diacetylmonoximem konduktivit před a po reakci fotometricky (525 nm) EH Ehrlich Barvení močoviny paradimetylaminobenzaldehydem (420 fotometricky nm) FT-MIR FT infraanalýza IR absorpce močoviny v celém zpracování spektru (interferometr) Specifita = použití štěpné reakce pomocí ureázy (enzymatická metoda). výtěžnosti signálu Fourierovými transformacemi v testu Pětibodová kalibrační přímka ANO 3 podle standardů se známým umělým přídavkem močoviny (mléčné standardy) Směrnice podle kalibračního NE 2 standardu se známým obsahem močoviny (nemléčný standard) Pětibodová kalibrační přímka NE 1 podle standardů se známým umělým přídavkem močoviny (nemléčné standardy) Vícebodová lineární regrese na NE 1 vybranou referenční metodu (mléčné standardy) Tab. 2 Hodnoty KMM (v mg/100ml) naměřené prostřednictvím jednotlivých analytických metod. Metoda REF. FT-MIR UR-1 UR-2 EH BI-1 BI-2 UR-3 REF. I Vzorek II 1 19,1 26,1 27,8 27,1 17,4 30,4 26,5 24,92 26, ,4 * 30,1 28,9 30,0 21,2 * 30,7 29,7 29,88 29, ,7 26,0 25,9 27,0 18,0 33,7 26,3 25,23 26, ,2 28,8 27,0 28,5 19,8 22,6 28,0 25,13 28, ,2 27,7 29,7 31,8 21,8 27,0 30,6 27,37 29, ,3 33,2 34,0 37,0 25,3 25,4 35,1 31,34 33, ,8 27,8 30,2 35,1 20,2 24,0 30,7 27,54 29, ,3 35,0 36,7 41,0 26,6 28,2 37,4 34,03 36, ,3 41,7 43,7 45,5 30,9 33,9 44,1 39,88 42, ,3 56,7 58,7 64,1 42,8 44,7 59,3 54,23 58,42 X 29,2 33,3 34,3 36,7 24,4 30,1 34,8 31,96 34,15 Sx 10,0 9,0 9,6 10,8 7,3 6,1 9,7 8,7 9,4 vx % 34,3 27,2 28,0 29,5 29,9 20,2 27,9 27,1 27,6 min. 19,1 26,0 25,9 27,0 17,4 22,6 26,3 24,9 26,3 max. 53,3 56,7 58,7 64,1 42,8 44,7 59,3 54,2 58,4 Rmax.-min. 34,2 30,7 32,8 37,1 25,4 22,1 33,0 29,3 32,1 FT-MIR = infračervená metoda ve středové oblasti spektra s Fourierovými transformacemi; UR-1, UR-2 a UR-3 = specifická, diferenčněkonduktometrická metoda Ureakvant; EH = fotometrická metoda s Ehrlichovým činidlem; BI-1 a BI-2 = fotometrická metoda BioLaTest; REF. I

5 a REF. II = referenční hodnoty po statistickém vyloučením odlehlých výsledků (* Grubbsův test na hladině 95 %) z celkového souboru (I) a po diskvalifikaci odlehlých výsledků metod (II); n = počet případů; x = aritmetický průměr; sx = směrodatná odchylka; vx = variační koeficient v %; min. = minimum; max. = maximum Obr. 1 Euklidická vzdálenost účastníků (I; n = 7) stanovení koncentrace močoviny v mléce (KMM) od počátku (RE). sd FT-MIR UR-1 UR-2 EH BI-1 BI-2 UR d d = průměrná odchylka (diference v mg/100ml); sd = variabilita průměrné diference. Linie vycházející z centra grafu představují významnost odchylek, kdy body pod liniemi jsou významně odchýlené (P<0,05), nad liniemi nevýznamně (P>0,05). Půlkruh vymezuje úspěšný výsledek (hladina spolehlivosti 90 % pro RE), obdélník velmi úspěšný výsledek. Předání uplatněné metodiky Postup při adjustaci a kontrole různých metod stanovení koncentrace močoviny v mléce v mléčných laboratořích: vyvinutá uplatněná metodika byla předána do užívání rutinních mlékařských laboratoří ČMSCH a.s. Praha, LRM Buštěhrad a LRM Brno-Tuřany v elektronické i písemné formě Kontrola uplatnění metodiky: kontrola aplikace uplatněné metodiky je proveditelná prostřednictvím revize dokladů a dokumentů o prováděných pracovních postupech v rutinních mléčných laboratořích LRM (Buštěhrad a Brno- Tuřany) a rovněž na ústředním pracovišti klienta ČMSCH a.s. Praha na pracovišti Hradištko pod Medníkem a jeho webových stránkách. Přílohy, dokumenty a doklady: technická řešení a postupy této uplatněné metodiky byly zčásti převzaty z vědecké a odborné literatury a zejména podpořeny výsledky vlastního výzkumu, vývoje a empirických poznatků, které byly publikovány a jako dokladové materiály mohou tvořit přílohu tohoto metodického materiálu. Datum:... Za zhotovitele: Doc. Dr. Ing. Oto Hanuš Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. Za uživatele: Prof. Ing. Jaroslav Pytloun, DrSc. Českomoravská společnost chovatelů, a.s., Praha Přílohy a seznam použitých podkladů: Výsledky řešení metodického problému byly formou vyhodnocení experimentů zpracovány pro publikace v recenzovaných vědeckých časopisech.