Biochemie. Česká studijní literatura Biochemie. Zdeněk Vodráţka. Biochemie. 2. opr. vyd. Praha : Academia, 1996.

Transkript

1 Biochemie Česká studijní literatura Biochemie. Zdeněk Vodráţka. Biochemie. 2. opr. vyd. Praha : Academia, Šípal, Zdeněk. Biochemie. 1. vyd. Praha : Státní pedagogické nakladatelství, Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemie. Translated by Arnošt Kotyk. 1. vyd. Praha : Victoria Publishing, 1995.

2 Biochemie Anglická studijní literatura Voet, Donald - Voet, Judith G. Biochemistry. 3rd ed. Hoboken : John Wiley & Sons, 2004 Voet, Donald - Voet, Judith G. - Pratt, Charlotte W. Fundamentals of biochemistry :life at the molecular level. 3rd ed. Hoboken, N.J. : John Wiley & Sons, Boyer, Rodney. Concepts in biochemistry. 2nd ed. New York : John Wiley & Sons, 2002.

3 Biochemie 1. ÚVOD 2. BÍLKOVINY - Struktura, vlastnosti a funkce 3. NUKLEOVÉ KYSELINY - Struktura, vlastnosti a funkce 4. SACHARIDY - Struktura, vlastnosti a funkce 5. LIPIDY - Struktura, vlastnosti a funkce 6. ENZYMOLOGIE 7. METABOLISMUS A BIOENERGETIKA 8. METABOLISMUS SACHARIDŮ 9. FOTOSYNTÉZA 10.METABOLISMUS LIPIDŮ 11.METABOLISMUS BÍLKOVIN 12.REGULACE BIOCHEMICKÝCH PROCESŮ

4 Biochemie chemická disciplína, která studuje chemické sloţení ţivé hmoty a chemické procesy, které v ní probíhají je hraniční vědní disciplínou, na pomezí mezi chemií a biologií, zkoumá biologické objekty chemickými metodami

5

6

7

8

9

10

11

12 Látkové sloţení

13 Prvkové sloţení vesmíru, zemské kůry a člověka

14

15

16

17

18

19

20 Fylogenetický strom

21 Fylogenetický strom

22 Margolis endosymbiotická teorie

23 Prokaryontní bakteriální buňka

24 Eukaryontní ţivočišná buňka

25 Eukaryontní rostlinná buňka

26 Organizace biologických struktur

27 Viry

28 Viry

29 Evoluce ţivota na zemi

32

33

34

35

36

37

38

39

40 Cystin

41 Cystin

42 Selenocystein

43

44 Esenciální AMK Rostliny + mikroorganismy 0 Člověk biosyntéza -12 esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, Thr, Ile, Leu, Val, Arg?

45 Esenciální AMK Rostliny + mikroorganismy 0 Člověk biosyntéza -12 esenciální - 8 Lys, Try, Phe, Met, Thr, Ile, Leu, Val, Arg?

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55 Titrační křivka glycinu

56

57

58 Thalidomid

59 Thalidomid

60

61

62 L AMK - CO-R-N

63 Diastomery threoninu

64

65 Ninhydrinová reakce

66 Reakce AMK s dansylchloridem

67

68 Papírová chromatografie AMK

69 RP HPLC AMK

70

71

72

73

74

75

76

77 Proinzulín 84 AMK

78 Inzulín 51 AMK

79 Amanitin Faloidin

80 Amanita phalloides

81

82 Microcystiny

83 Microcystiny

84

85

86

87

88 AMK analyzátor

89 AMK analyzátor

90

91

92

93

94

95

96 Srpkovitá anémie

97 Srpkovitá anémie versus malárie

98 URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY A. Purifikace bílkoviny získání homogenn B. Aminokyselinové složení určení počtu jednotlivých AMK zbytků (kyselá hydrolýza 6N HCl, ºC, 24 h) C. Pořadí aminokyselin: 1. Oddělit a isolovat jednotlivé řetězce(redukce nebo oxidace disulfidických můstků) 2. Určit N-konec a C-konec 3. Určit pořadí aminokyselin Edmanovým odbouráváním(kam až to jde) 4. 2 nezávislá specifická štěpení isolovat štěpy (peptidy) 5. Opakovat bod Sestavit primární strukturu řetězce 7. Určit způsob propojení původních řetězců

99 Zjišťování N-koncových AMK

100 Moţnosti štěpení

101 Edmanovo sekvenování

102 Metoda překrývajících se štěpů

103 MS

104 MS

105 MS-MS

106 MS-MS

107 MS-MS

108

109

110

111

112

113

114 Trans Cis

115

116

117

118

119 α - helix

120 α - helix

121 β - sheet

122 β - sheet

123 β - turn

124 β - turn

125

126

127 Strukturní motivy

128 Strukturní motivy

129 Strukturní domény

130

131

132 Hemoglobin

133

134 Rtg difrakce

135 NMR podstata jaderné spiny E E

136 NMR

137 NMR

138 NMR spektrum

139 NMR spektrum

140 NMR

141 Denaturace - renaturace

142

143 Skládání folding bílkovin Neprobíhá náhodným způsobem Probíhá postupně: a. malé dočasné periodické struktury b. supersekundární struktury c. strukturní domény a "roztavená" glubule d. závěrečné úpravy za účasti enzymů Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?

144

145 Levinthal Paradox We assume that there are three conformations for each amino acid(ex. α- helix, β-sheet and random coil). If a protein is made up of 100 amino acid residues, a total number of conformations is : = x If 100 psec(10-10 sec) were required to convert from a conformation to another one, a random search of all conformations would require 5 x x sec 1.6 x years. However, folding of proteins takes place in msec to sec order. Therefore, proteins fold not via a random search but a more sophisticated search process.

146

147

148

149

150 Chaperony

151 Titrační křivka

152

153

154 Izolace proteinů

155 Literatura Scopes : Protein Purification Harris : Protein Purification Methods Practical Approach Deutcher : Guide to Protein Purification Janson : Protein Purification Kastner : Protein Liqiud Chromatography

156 Metody separace proteinů Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody

157 Problémy se vzorkem Komplexnost Malá mnoţství Labilita

158 Plánování separace bílkovin

159 Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaloţením patřičného úsilí

160 Volba vstupního materiálu Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot

161 Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt % HIC % IEX %

162 Stanovení koncentrace bílkoviny na stanovení koncetrace dusíku Metoda založená na základě optickýchvlastností na základě elektrochemickýchvlastností

163 Kjeldahlova metoda stanovení N 2 Mineralizace vzorku převedení organického dusíku na NH 4 + Stanovení NH titrace, fotometrie, selektivní elektrody

164 UV spektrofotometrie 280 nm aromatické AMK interference nukleotidů nm peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace

165 VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

166 Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu 2+ Měření : nm 310 nm

167 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm

168 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm

169 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

170 Nejčastěji pouţívané metody Metoda Rozsah (ng) Poznámka Biuretová okamţitý vývoj Lowryho pomalý vývoj UV nm interference UV 205 nm interference Bradfordové sorpce barviva

171 Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atdf.

172 Vlastní separace

173 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

174 Vstupní materiál

175 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné mnoţství - selekce mutantů o poţadovaných vlastnostech - genetické inţenýrství - termofilní organismy

176 Bezobratlí Hmyz, plţi, mlţi Nevýhody - málo se pouţívá, nesnadno se získává

177 Ţivočišné tkáně Laboratorní zvířata myši, krysy, králíci Jateční zvířata orgány Člověk tělní tekutiny

178 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda problematický růst za definovaných podmínek

179 Rozbití a extrakce

180 Bakterie Záleţí na lokalizaci cytoplasma periplasma

181 Balotina Princip jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy nutno chladit

182 French (X) press Princip zmraţená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemţ dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk

183 Ultrazvuk Princip ultrazvuk (> 20 khz) v roztoku vyvolává střiţní síly nutno chladit

184 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H 2 O bakterie popraskají

185 Ţivočišné tkáně Třecí miska s pískem Ruční homogenizatory Potter Elvehjemův Mixery Osmotická lyse - erytrocyty

186 Rostlinné tkáně Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

187 Sráţecí metody

188 Sráţení Nezaměňovat s denaturací bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody pouţívané pro separaci bílkovin EtOH, (NH 4 ) 2 SO 4 Filtrace nahrazena centrifugací

189 Rozpustnost bílkoviny Vlastnostmi bílkoviny distribuce hydrofobních a hydrofilních skupin na povrchu bílkoviny

190 Rozpustnost bílkoviny Vlastnostmi roztoku ph, iontová síla, org. rozpouštědla, org. polymery, teplota

191 rozpustnost Izoelektrická precipitace pi ph

192 rozpustnost Sráţení neutrálními solemi vsolování vysolování I

193 Vsolování H 2 O H 2 O - H 2 O + H 2 O - H 2 O + + H 2 O - H 2 O

194 Vysolování

195 (NH 4 ) 2 SO 4 Rozpustnost se málo mění s teplotou Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umoţňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 ) Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý

196 % Sráţení - dvojstupňově Bílkovina Aktivita 0 % saturace

197 Sráţení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou Rozpouštědla ruší solvatační obal bílkoviny H 2 O H 2 O - H 2 O + H 2 O - H 2 O + + H 2 O - H 2 O

198 Sráţení org.rozpouštědly mísitelnými s vodou COHN separace plazmatických bílkovin EtOH Nutno provádět při T < 0 o C, při větší teplotě dochází k denaturaci Dvojstupňově Přídavky z tabulky nebo podle vzorce

199 Sráţení selektivní denaturací Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina musí zůstat z % v nativním stavu. Denaturační vlivy T, ph, org. rozpouštědla Bílkovina musí nejen denaturovat i precipitovat

200 % Tepelná denaturace Bílkovina 1 Bílkovina 2 0 teplota

201 Chromatografické metody

202 Chromatografie Cvet separace chlorofylů na CaCO

203 Chromatografie

204 Zařízení pro LPC

205 Ionexová chromatografie elektrostatická interakce Vazba + Eluce + +

206 Ionexy Katexy - - vazba kationtů silné - sulfo(s), sulfopropyl(sp) OSO 3 - slabé - karboxy(c), karboxymetyl(cm) COO - Anexy - + vazba aniontů silné - dietylaminoetyl(deae) slabé trietylaminoetyl(teae)

207 Ionexová chromatografie Nanášení vzorku nízká iontová síla Eluce gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou ph Afinitní eluce Pouţití purifikace, zakoncentrování, výměna pufru

208 Hydrofobní chromatografie Stacionární fáze - C 8, -fenyl Mobilní fáze vodné roztoky 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 Eluce sniţováním iontové síly Pouţití : purifikace bílkovin

209 Afinitní chromatografie

210 Afinitní páry

211 Afinitní chromatografie nanesení vzorku

212 Afinitní chromatografie vznik interakce

213 Afinitní chromatografie vymytí balastů

214 Afinitní chromatografie eluce

215 Provedení Nanesení vzorku nízká iontová síla Eluce selektivní - volným ligandem neselektivní - změna ph, iontové síly, polarity Pouţítí : analytické (stanovení K), purifikace

216 Gelová permeační chromatografie

217 Gelová permeační chromatografie Princip - stérická exkluse - omezená difuse Pořadí eluce : MrA>MrB>MrC

218 Gelová permeační chromatografie Totální exkluse Selektivní permeace Totální permeace

219 Gelová permeační chromatografie Nanášení vzorku objem vzorku < 2% Eluce izokratická objemu kolony Pouţití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

220 Elektromigrační metody

221 Podstata Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli

222 Zónová elektroforéza + + A+B+C C B A - - A > B > C

223 Upořádání Horizontální + -

224 Upořádání Vertikální + -

225 Polyakrylamid Sloţení kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje poţadavky - Monomery jsou neurotoxiny!!!!!! Pouţití : analýza bílkovin

226 Polyakrylamid H 2 C CH C O NH 2 H 2 C H 2 C CH C O NH CH 2 NH C O CH CH 2 CH 2 CH H 2 C C O NH 2 NH 2 C O CH H 2 C CH C O NH CH 2 NH C O CH

227 SDS PAGE OSO3 - Na g bílkoviny váţe 1.4 g SDS uniformní náboj na jednotku MW

228 SDS PAGE

229 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Log Mr Rm skvrna čelo Rm

230 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy

231 Izoelektrická fokusace Elektroforéza v gradientu ph, částice jsou separováný podle svých pi

232 Izoelektrická fokusace t 0 t ph A A pi H 3 O + OH - H 3 O + OH -

233 Izoelektrická fokusace t x + - ph H 3 O + OH -

234 Izoelektrická fokusace analytická Provedení - v gelech PAGE, agarosa Pouţití - sledování komplexních směsí - izoenzymové sloţení - stanovení pi rozřezání a eluce ph elektrody pi standardy

235 Izoelektrická fokusace analytická

236 Dvojrozměrná elektroforéza pi 3.0 ph 10.0 M r I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE

237 Dvojrozměrná elektroforéza pi M r