MASARYKOVA UNIVERZITA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE Vyhodnocení stanovení nových markerů sepse u pacientů v kardiogenním šoku k detekci infekční komplikace, srovnání se skupinou pacientů v septickém šoku Bakalářská práce Stanislav Drápela Vedoucí práce: Mgr. Jana Gottwaldová Brno 2014

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Drápela Stanislav Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav biochemie Vyhodnocení stanovení nových markerů sepse u pacientů v kardiogenním šoku k detekci infekční komplikace, srovnání se skupinou pacientů v septickém šoku Biochemie Biochemie Mgr. Jana Gottwaldová Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: 65 Klíčová slova: Sepse, septický šok, kardiogenní šok, presepsin, prokalcitonin, C reaktivní protein, pentraxin 3, ROC analýza

3 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: Drápela Stanislav Faculty of Science, Masaryk University, Department of Biochemistry Evaluation of new sepsis markers measurement in patients in cardiogenic shock for infectious complications detection, comparison with a group of patients in septic shock Biochemistry Biochemistry Mgr. Jana Gottwaldová Academic Year: 2013/2014 Number of Pages: 65 Keywords: Sepsis, septic shock, cardiogenic shock, presepsin, procalcitonin, C reactive protein, pentraxin 3, ROC analysis

4 Abstrakt Tato bakalářská práce je věnována stanovení nových markerů sepse, presepsinu a pentraxinu 3. Tyto markery jsou využívány pro určení diagnózy a prognózy septických stavů, monitorování léčby a její odezvy. V rámci práce byla vyhodnocena skupina pacientů s kardiogenním šokem. Naměřené hodnoty byly srovnány s kontrolní skupinou pacientů s nekomplikovaným průběhem infarktu myokardu a se skupinou pacientů v septickém šoku. Pacienti s akutním infarktem myokardu komplikovaným kardiogenním šokem mají špatnou prognózu s vysokou mortalitou %. Jako kontrolní skupina byli využiti pacienti s akutním infarktem myokardu bez selhání (STEMI). Stanovení presepsinu a pentraxinu 3 bylo porovnáno se stanovením dalších reaktantů akutní fáze, prokalcitoninem a C reaktivním proteinem. Pro všechny skupiny pacientů byly vytvořeny časové křivky průběhu hodnot presepsinu a dalších markerů. Pomocí ROC analýzy byly stanoveny cut - off hodnoty sloužící k rozlišení porovnávaných skupin hospitalizovaných pacientů. Tyto hodnoty napomohou v klinické praxi k rozhodnutí o zahájení léčby antibiotiky. Ke statistice dat byl využit biomedicínský software MedCalc (Belgie). Tato práce navazuje na práci IKK FN Brno, ve které byla sledována dynamika hladiny interlekukinu 6 (IL - 6) u identických skupin pacientů [13].

5 Abstract Presented thesis adresses the determination of new sepsis markers, presepsin and pentraxin 3. These markers are used for diagnosis and prognosis of sepsis, treatment monitoring and its response. Within scope of the thesis a group of patients with cardiogenic shock was evaluated. The measured values were compared with a patients control group with uncomplicated course of myocardial infarction and a patients group in septic shock. The patients with acute myocardial infarction and complicated cardiogenic shock have a misprognosis with a high mortality rate 50-75%. The patients with acute myocardial infarction without heart failure (STEMI) were used as the control group. Presepsin and pentraxin 3 detection was compared with the detection of other acute phase reactants, procalcitonin and C reactive protein. The time curves for course of presepsin and other markers values were created for all patients groups. Using ROC analysis were determined cut - off values used to distinguish the compared groups of hospitalized patients. These values might help the clinician in the decision to initiate treatment by means of antibiotics. The statistics data were processed through biomedical software software MedCalc (Belgium). This thesis is continuation of IKK FN Brno work, where the dynamics of interleukin 6 (IL - 6) in identical patients groups was studied [13].

6

7 Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval své vedoucí paní Mgr. Janě Gottwaldové za veškerou pomoc, odborné vedení, konzultaci a čas, který mi věnovala při vzniku této bakalářské práce. Zvláštní poděkování patří také panu MUDr. Mgr. Jiřímu Pařenicovi, PhD., vedoucímu lékaři koronární jednotky IKK FN Brno, za poskytnutí klinických údajů a pacientských vzorků k této práci. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 15. dubna 2014 Stanislav Drápela

8 Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/ ). Projekt je realizován v rámci Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.

9 Obsah Obsah Seznam použitých zkratek Teoretická část Úvod a cíl Sepse Etiologie Diagnostika Septický šok Etiologie Diagnostika Kardiogenní šok Etiologie Diagnostika Léčba STEMI Proteiny akutní fáze C reaktivní protein Struktura a funkce Etiologie zvýšených hodnot CRP Kinetika Stanovení Prokalcitonin Struktura a geneze Etiologie zvýšených hodnot PCT v plazmě Kinetika Stanovení

10 Obsah Srovnání PCT a CRP Pentraxin Geneze Kinetika a etiologie zvýšených hodnot PTX Stanovení Presepsin Membránový mechanismus sekrece presepsinu Stanovení Experimentální část Materiál a metodika Statistika dat Základní statistika Mann - Whitney test ROC analýza Výsledky Charakteristika měřeného souboru Dynamika hodnot ve sledovaných souborech pacientů Prokalcitonin C reaktivní protein Pentraxin Presepsin Výsledky ROC analýzy Diskuze Závěr Reference

11 Seznam použitých zkratek Seznam použitých zkratek AUC - area under curve AIM - akutní infarkt myokardu ALP - alkaline phosphatase APP - acute phase proteins CLEIA - chemiluminescence enzyme immunoassay CRP - C reaktivní protein ECL - electrochemiluminescence ECLIA - electrochemiluminescence immunoassay EIA - enzyme immunoassay ELISA - enzyme linked immunosorbent assay HRP - horseradish peroxidase (křenová peroxidáza) IL-1/IL-6 - interleukin 1/interleukin 6 LPBP - lipopolysaccharide binding protein LPS - lipopolysaccharide MODS - multiple organ dysfunction syndrome PCT - prokalcitonin PRE - presepsin PTX3 - pentraxin 3 scd14-st - presepsin, soluble CD14 subtype SIRS - systemic inflammatory response syndrome TPA - tripropylamin TLR 4 - toll-like receptor 4 TMB - tetramethylbenzidin TNF - tumor nekrotizující faktor α, také kachektin TSG-14 - tumor nekrotizující faktor stimulovaný genovou sekvencí 14 11

12 Úvod Teoretická část 1. Úvod Kardiogenní šok je hlavní příčinnou úmrtí pacientů hospitalizovaných pro akutní infarkt myokardu (AIM) navzdory špičkové intervenční, farmakologické a podpůrné terapii. U pacientů s AIM dochází po ischemickém inzultu k rozvoji zánětlivé reakce. Zánětlivá reakce je nejčastěji hodnocena hladinou C reaktivního proteinu (CRP). U pacientů v kardiogenním šoku je k detekci infektu přínosnější marker prokalcitonin (PCT). V recentní literatuře byly publikovány informace o presepsinu, solubilním fragmentu subtypu CD14, jehož zvýšené hladiny jsou detekovány při infekci, a který by mohl sloužit jako nový marker k diagnostice sepse a pentraxinu 3, zástupci skupiny dlouhých pentraxinů, jehož klinický význam zatím není plně objasněn. Podle ROC analýzy je u presepsinu hodnota pod křivkou (AUC) k detekci sepse výrazně vyšší v porovnání s CRP a PCT. Presepsin dosud nebyl testován k detekci infekce u pacientů v kardiogenním šoku [13, 24]. Rozhodnutí o správném zahájení antibiotické terapie je velice důležitým faktorem k úspěšné léčbě. Preventivní podání širokospektrých antibiotik není doporučováno a terapie může vést u 5-25% pacientů ke komplikacím, nejčastěji rozvoji infekce Clostridium difficile, která se klinicky manifestuje jako průjem, zvracení či septický šok. Cíl práce Cílem práce je zhodnocení možnosti využití nových markerů sepse - presepsinu a pentraxinu 3 a porovnání se současně používanými markery pro diagnostiku sepse - C reaktivního proteinu a prokalcitoninu ve skupinách pacientů v kardiogenním šoku a sepsi, v porovnání s kontrolní skupinou pacientů s nekomplikovaným akutním infarktem myokardu. Dílčím cílem je vizualizace vzestupů a poklesů hladin všech markerů v jednotlivých souborech odběrů pomocí Box-and-Whisker Plot a stanovení cut - off hodnot presepsinu a pentraxinu 3, pomocí ROC analýzy, při kterých je pravděpodobný rozvoj infekce u pacientů v kardiogenním šoku a které pomůžou v klinické praxi k rozhodnutí zahájení antibiotické léčby. 12

13 Úvod Název pracoviště Experimentální část studie byla provedena na Oddělení klinické biochemie FN Brno za poskytnutí klinických údajů a pacientských vzorků z Interní kardiologické kliniky FN Brno. Studie Tato observační, prospektivní studie navazuje na práci Interní kardiologické kliniky FN Brno, ve které byla sledována dynamika hladin časného specifického markeru interleukinu 6 (IL-6) k diagnostice infekce v identických vzorcích stejných skupin pacientů [13]. Pacienti Do studie bylo zařazeno celkem 85 pacientů, kteří splnili zařazovací kritéria: 52 pacientů v kardiogenním šoku, 14 pacientů v septickém šoku a 19 pacientů se STEMI. Hladiny presepsinu, pentraxinu 3, prokalcitoninu a C reaktivního proteinu byly stanoveny 7 krát za týden v daných časových odběrech. 13

14 Sepse 2. Sepse Sepse je klinický stav, který lze těžko definovat, diagnostikovat a léčit. Jedná se o komplexní syndrom, při kterém dochází k systémové zánětlivé odpovědi (SIRS) v důsledku odezvy organismu na napadení krve infekčním agens - obrázek 1. SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) neboli syndrom systémové zánětlivé odpovědi je stav ovlivňující celé tělo, který je spuštěn organismem jako reakce na infekční i neinfekční inzulty. Neinfekčními inzulty SIRS mohou být traumata, popáleniny, pankreatitidy, ischemie, či krvácení [12]. Stav sepse může pokračovat i po vymizení infekce, přičemž se může rozvinout do stavu těžké sepse (severe sepsis) se známkami dysfunkce nebo akutního selhání jednoho a více orgánů, snížení prokrvení tkání (hypoperfuze) a hypotenze [22]. Obrázek 1: Vztahy SIRS, infekce a sepse a jejich hlavní příčiny [16]. 2.1 Etiologie Infekčním agens způsobujícím sepsi jsou nejčastěji gramnegativní bakterie (mají na svědomí 90% sepsí) [16]. Nejčastějšími původci jsou rody Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Pseudomonas a Neisseria. Sepsi mohou však vyvolat i produkty grampozitivních bakterií (Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus), viry, rickettsie a plísně (Candida). Ložiskem může být krev, infekce v operační ráně, močových cestách, plících či jiné tkáni. Sepse postihuje jedince každého věku, nejčastěji se vyvíjí u pacientů 14

15 Sepse hospitalizovaných pro závažná onemocnění nebo v souvislosti s poraněním jako jsou popáleniny, ale také v případech rakoviny a zápalu plic [12]. 2.2 Diagnostika SIRS či sepsi je možné diagnostikovat, pokud jsou přítomny alespoň dva ze čtyř příznaků odezvy organismu na infekční i neinfekční inzulty. Mezi tyto příznaky patří: změna tělesné teploty, tachykardie, tachypnoe a změna počtu bílých krvinek v krevním řečišti. Změna tělesné teploty se může pohybovat směrem nahoru, poté mluvíme o hypertermii, horečce nad 38 C, která vzniká působením interleukinu 1 (IL-1) na hypotalamus a zpomaluje růst agens, nebo směrem dolů a poté mluvíme o hypotermii, při které tělesná teplota klesá pod 36 C [18, 22]. Tachykardie neboli vysoká tepová frekvence je dána tepovou frekvencí větší než 90 tepů za minutu. Tachykardie snižuje účinnost čerpání krve srdcem a dochází ke zvýšení spotřeby kyslíku, protože za tak krátký čas nemůže dojít k naplnění srdečního svalu krví [20, 22]. Dalším příznakem je tachypnoe, tedy zvýšení rychlosti dýchání a tím snížení množství CO 2 v krvi. Tachypnoe je možné diagnostikovat při zvýšení počtu dechů nad 20 za minutu či výrazném snížení parciálního tlaku CO 2 v krvi [22]. Při infekčním onemocnění je typická změna hladiny leukocytů v krvi (leukocytóza nebo leukopenie). Leukocytóza znamená zvýšení počtu bílých krvinek nad / l. Leukopenie je snížení počtu bílých krvinek pod 4000/ l. [18, 20, 22]. Větší množství symptomů vypovídá o komplikovanějším stavu pacienta a o tom, že se infekce začíná vymykat lokální kontrole [19]. Pokud je sepse včasně diagnostikována v souvislosti s rozpoznáním zdroje infekce, je možné ji úspěšně eliminovat. Nejčastěji se využívá podávání antibiotik [12], která dokáží účinně působit proti některým bakteriím, proto je důležité rychlé stanovení infekčního agens pro volbu správného antibiotika. Často je využívána podpůrná terapie ve formě plicní ventilace a podávání vazopresorů ke zvýšení tlaku [18]. Těžká sepse je spojena s oligurií a poruchami vědomí. Ročně postihuje stav sepse nebo těžké sepse více jak 18 miliónů pacientů s celkovou letalitou 20%. V České republice zemře na toto klinické onemocnění 55% všech nemocných, což je vysoce nadprůměrná hodnota [19]. Pro porovnání - na rakovinu plic zemře za rok dvakrát méně pacientů (zdroj: Roche Diagnostics). 15

16 Sepse 2.3 Septický šok Septický šok je závažný zdravotní stav, ke kterému dochází v důsledku těžké infekce, sepse, snížené perfuze tkání a snížené distribuce kyslíku. Imunitní systém není schopen se efektivně vypořádat s infekcí. Výsledkem může být multiorgánové selhání a smrt. Septický šok bychom mohli popsat také jako sepsí navozenou hypotenzi, která přetrvává i přes adekvátní přísun tekutin Etiologie Septický šok je nejčastěji spojen s gramnegativními bakteriemi a bývá pozorován u osob chronicky nemocných nebo osob s poruchou imunity. Přesto asi jedna třetina případů je vyvolána grampozitivními bakteriemi a plísněmi rodu Candida. Ohroženi jsou nemocní s dlouhodobě zavedenými katetry v cévním řečišti, s infekcemi močových cest a dále po komplikovaných chirurgických či urologických výkonech, pacienti s rozsáhlejšími popáleninami a narkomani. K rizikovým faktorům pro vznik septického šoku patří cukrovka [22] Diagnostika Z hemodynamického hlediska je pro septický šok charakteristické městnání krve v paralyzovaném kapilárním řečišti a průnik plazmatických bílkovin do intersticiálního prostoru. Stav septického šoku se většinou projeví náhle zimnicí, třesavkou. Dochází k prudkému vzestupu tělesné teploty, nemocný je obluzený a může zvracet. Pro časnou hyperdynamickou fázi septického šoku je také charakteristická vazodilatace, pokles centrálního žilního tlaku a vzestup minutového objemu srdečního. Nedostatečná možnost tkáňové perfuze a oxygenace vede k nadprodukci laktátu a ke vzniku laktátové metabolické acidózy. V pozdějších fázích dochází k aktivaci sympatoadrenálního systému se vznikem vazokonstrikce v kůži, svalech, střevech a ledvinách. Minutový objem srdeční klesá a dochází k ireverzibilnímu poškození parenchymových orgánů, především plic, ledvin, ale také jater, střev, srdce a mozku. Typická je přítomnost poruchy vědomí, stupňující se až ke vzniku kómatu a smrti [12]. Nepodaří-li se terapeuticky stav ovlivnit, dochází k prohloubení hypotenze a končí jako jiné typy šoků nejzávažnějším stádiem, a to tzv. syndromem multiorgánové dysfunkce, při kterém vlivem sepse selhávají dva nebo více orgánů [18]. Průměrná světová mortalita u pacientů v septickém šoku se pohybuje kolem 50% [21]. 16

17 Kardiogenní šok 3. Kardiogenní šok Kardiogenní šok je definován jako generalizovaná porucha prokrvení (perfuze) tkání s neschopností kardiovaskulárního systému vyhovět metabolickým požadavkům tkání (neadekvátní dodávka kyslíku a nedostatečné odstranění oxidu uhličitého) [12]. Pacienti s akutním infarktem myokardu komplikovaným kardiogenním šokem mají špatnou prognózu s vysokou hospitalizační mortalitou 50-75% navzdory moderní intenzivní péči a revaskularizační léčbě [13]. 3.1 Etiologie Klinicky je kardiogenní šok definován jako oběhový šokový stav, při kterém dochází ke snížení srdečního výdeje se známkami sníženého prokrvení tkáně (tkáňová hypoperfuze), v důsledku ztráty stažitelnosti myokardu [12, 13, 14]. Příčinou poruchy kontraktility může být myokarditida, pohmoždění srdce či AIM. Jednou z nejčastějších příčin kardiogenního šoku je právě AIM s elevacemi (vzestupy) ST segmentů, nebo malý AIM u pacienta se sníženou funkcí levé komory. 3.2 Diagnostika Hlavními příznaky je hypotenze, klidová tachykardie, porucha mentálních funkcí či oligurie [14]. Diagnostika vychází z cíleného fyzikálního vyšetření pomocí 12ti svodového EKG. Kardiogenní šok se většinou vyvíjí do 24 hodin od začátku příznaků AIM, průměrně 5-7 hodin po začátku AIM. Bylo prokázáno, že v průběhu AIM dochází ke zvyšování zánětlivých markerů především CRP a interleukinu 6 (IL-6) [13]. Incidence kardiogenního šoku u pacientů s AIM se pohybuje kolem 7% [15]. 3.3 Léčba V případě AIM je podávána plná dávka kyseliny acetylsalicylové s množstvím antikoagulantů ke zvýšení protisrážlivého účinku a také směs katecholaminů, dobutaminu a noradrenalinu, která dokáže zabránit orgánovému poškození především mozku, ledvin a jater zvýšením krevního tlaku a tím prokrvení tkání [12]. Pro záchranu pacienta je důležitý komplexní přístup týkající se včasného stanovení diagnózy, stabilizace a reperfuzní léčby [12, 14]. Šance na záchranu pacientova postiženého myokardu klesá s dobou nedokrvení - ischemie. 17

18 STEMI 4. STEMI Pro porovnávání detekovaných markerů v krvi u pacientů v kardiogenním a septickém šoku byla použita kontrolní skupina pacientů STEMI, u nichž nedocházelo po AIM k rozvoji zánětlivé reakce. Pacienti byli zařazeni do této skupiny podle mezinárodních doporučení na koronární jednotce IKK FN Brno [49]. Akutní koronární syndromy jsou v současné době klasifikovány podle přítomnosti nebo nepřítomnosti ST elevací [50]. STEMI je zkratka, která nahrazuje víceslovný termín ST segment Elevation Myocardial Infarction, tedy elevaci ST segmentů elektrokardiografické křivky u pacientů s infarktem myokardu - obrázek 2. Elevace ST segmentu poukazuje na to, že je poškozena relativně velká část myokardu [49]. Obrázek 2: Porovnání klasické EKG křivky u zdravého pacienta (1) a EKG křivky s elevací ST segmentu u pacienta po AIM (2) [48] K AIM dochází v důsledku alespoň částečné blokace koronární (věnčité) tepny krevní sraženinou (trombem), která způsobí přerušení krevního zásobování části srdce a tím jeho odumírání. Krevní sraženiny mohou vzniknout destrukcí aterosklerotického plátu složeného z dlouhodobě ukládaných tukových buněk na vnitřní povrch tepny. Srdeční záchvaty jsou rozděleny do dvou typů, z nichž STEMI patří mezi závažnější, neboť koronární tepna je zcela blokována krevní sraženinou. V důsledku toho dochází k odumírání celého myokardiálního svalu zásobeného postiženou tepnou [49]. Nejúčinnější léčba spočívá v rychlé a trvalé rekanalizaci uzavřené tepny využitím perkutánní koronární intervence (angioplastiky) a zajištění reperfuze myokardu [50]. 18

19 Proteiny akutní fáze 5. Proteiny akutní fáze Původní definice označovala jako proteiny akutní fáze (APP) takové plazmatické bílkoviny tvořené v játrech, jejichž koncentrace během prvních 7 dnů po zánětlivém stimulu stoupá o 25% a více. Tato definice musela být později modifikována z důvodu rozšiřování znalostí o jejich působnosti a s odhalováním regulačních mechanismů kontrolujících syntézu těchto proteinů. Současná definice říká, že proteiny akutní fáze jsou sekreční proteiny jaterních buněk, jejichž tvorba a uvolnění do cirkulace jsou regulovány prozánětlivými cytokiny [31]. Pokud tedy dojde k narušení integrity vnitřního prostředí organismu cizím inzultem, například bakteriálním lipopolysacharidem, následuje aktivace imunitního systému s produkcí TNF a následnou elevací cytokinů (IL - 1, IL - 6). Zvýšené hladiny cytokinů poté indukují sekreci peptidů a proteinů akutní fáze [30]. Hlavní úlohou těchto působků přirozené imunity je usměrnění funkce a proliferace buněk a tkání v průběhu lokální nebo systémové zánětlivé odpovědi [30, 31]. APP lze rozdělit do skupin podle rychlosti syntézy a odbourávání. Markery PCT, CRP, PTX3 a PRE patří do skupiny proteinů, které jsou rychleji syntetizovány než odbourávány, což znamená, že při zánětlivém procesu jejich koncentrace stoupá [16]. Za APP jsou považovány hormony tvořené jaterními buňkami (PCT), cytokiny jaterních buněk (IL - 1) či růstové faktory tvořené v játrech. V odlišném pojetí je možné mezi APP zahrnout i sekreční proteiny tvořené během zánětlivé odpovědi různými typy buněk. Celkem se jedná asi o dvě desítky plazmatických proteinů, které mají buď diagnostickou, nebo známou patogenetickou roli [31]. Hlavní skupinou APP jsou evolučně velmi staré [1], pentagonálně uspořádané sekreční proteiny - pentraxiny. Pentaxiny jsou tvořeny pěti globulárními podjednotkami spojenými nekovalentní vazbou. Označení pentraxiny ovšem nevystihuje biochemické vlastnosti celé skupiny. Zatímco lidský CRP je pentamer, další pentraxin - PTX3 je dekamer. Pentraxiny se dělí na dvě podskupiny, a to krátké a dlouhé. Nejdéle známým a klinicky nejvýznamnějším krátkým pentraxinem indukovaným prozánětlivými cytokiny je C reaktivní protein (CRP). Nově objevené dlouhé pentraxiny mají odlišné vlastnosti od klasických krátkých. Jejich exprese je většinou konstitutivní, s výjimkou PTX3 nejsou indukovány prozánětlivými cytokiny a jejich molekulová hmotnost je dvakrát větší. Je ale zachována jejich oligomerická stavba molekuly [31]. 19

20 Proteiny akutní fáze 5.1 C reaktivní protein C reaktivní protein (CRP) je jedním z klinicky nejvýznamnějších proteinů akutní fáze [31]. CRP patří do skupiny tzv. krátkých pentraxinů. CRP byl objeven v roce 1930 v USA Tilletem a Francesem v plazmě pacientů nemocných pneumonií jako protein reagující s C polysacharidem buněčné stěny Streptococcus pneumoniae. CRP je prokazován nejen v akutních, ale také chronických zánětech u řady onemocnění. Je nejcitlivějším reaktantem akutní fáze, přičemž jeho koncentrace při zánětlivém procesu lineárně roste [31]. Měření změn koncentrací CRP slouží jako užitečná diagnostická informace o akutnosti a závažnosti onemocnění [16] Struktura a funkce CRP je bílkovina kódovaná 225 aminokyselinami. Skládá se z pěti identických neglykovaných polypeptidických podjednotek (protomerů), které vytvářejí pětičlenný kruh s molekulovou hmotností 120 kda [16]. CRP je syntetizován jaterními buňkami. Tvorba CRP v hepatocytech je stimulována především cytokiny, zejména IL - 6, IL - 1 a IL CRP působí jako opsonizující faktor pro fagocytózu bakterií, parazitů a imunokomplexů. Nejvýznamnější a nejlépe poznanou funkcí je kalcium dependentní vazba na fosfatidylcholin bakteriální stěny. Vazba dvou volných iontů Ca 2+ na každou podjednotku podmiňuje změnu allosterické konfigurace CRP do podoby vhodné k vazbě na cílové struktury [31]. Jedná se o vazbu na nekrotizované nebo poškozené vlastní buňky a jejich produkty, které by mohly působit jako infekční inzulty. CRP tak umožní jejich rychlejší eliminaci z krve a tkání cestou aktivace komplementu a fagocytózy. Jedná se tak o důležitou preventivní funkci, zabraňující autoimunní reakci proti vlastním antigenům [40] Etiologie zvýšených hodnot CRP CRP slouží jako nespecifický marker řady onemocnění. Odezva CRP často předchází projevy klinických symptomů včetně horečky. Nejvyšších hodnot CRP dosahuje u akutních bakteriálních infekcí. Virové, mykotické a parazitární infekce vedou pouze k mírnému vzestupu hladin. U bakteriálního zánětu dochází k vzestupu koncentrace na mg/l, u viróz na mg/l. U normálních zdravých jedinců se CRP vyskytuje ve stopovém množství do 5 mg/l. Syntéza CRP u novorozenců je oproti dospělým jedincům snížená. CRP je ale užitečný pro diagnostiku kojeneckých meningitid. Mezi další impulzy k indukci CRP patří operace, popáleniny, infarkty či nádorová onemocnění. 20

21 Proteiny akutní fáze Na rozdíl od jiných markerů septických stavů se hladina CRP působením zánětlivého stimulu několikanásobně zvyšuje [31, 40] Kinetika Nárůst hodnot CRP se pohybuje v rozmezí 6 až 12 hodin s nejvyšší hodnotou mezi 24. až 48. hodinou. Je ovšem možné, že CRP dosáhne svého vrcholu až do 4 dnů od počátečních obtíží, což je důvodem, proč se pátrá po jiných markerech s rychlejším vzestupem. Jeho pokles po několika dnech je stejně rychlý jako vzestup. Biologický poločas cirkulujícího CRP je kolem 19 hodin, avšak pokud je vázán na ligandy, může být jeho eliminace mnohem rychlejší. Poločas značeného exogenního CRP je 5-7 hodin. Úspěšná terapie antibiotiky se projeví rychlým poklesem, při neúspěšné léčbě zvýšené koncentrace CRP přetrvávají [40, 41]. Nevýhodou CRP je jeho nízká specifita. Na rozdíl od prokalcitoninu neinformuje o tíži orgánového postižení, nýbrž pouze o přítomnosti infektu. Vzájemně se tyto dva markery nenahrazují, ale doplňují Stanovení Stanovení CRP je založeno na imunoturbidimetrii (angl. turbid - zakalený). Jedná se o optickou metodu, při které je měřena absorbance suspenze či koloidního roztoku - obrázek 3. K tvorbě imunokomplexu (suspenze), a tím ke vzniku zákalu roztoku dochází po smíchání a následné reakci antigenu (analytu) s pro něj specifickými protilátkami [28,41]. Kvantitativně byla tato reakce popsána již v roce 1929 Heidelbergem a Kendallem [42]. Detektor spektrofotometru leží v ose paprsku a měří záření prošlé vzorkem, ve kterém došlo ke snížení intenzity v důsledku rozptylu, částečné absorpce a částečného odrazu na vzniklých imunočásticích. V praxi se jako nejvýhodnější používají vlnové délky od 340 nm do 450 nm [28]. Obrázek 3: Schéma turbidimetrie [28] 21

22 Proteiny akutní fáze Množství rozptýleného světla závisí na koncentraci částic, což znamená, že koncentrace komplexu antigen/protilátka je přímo úměrná absorbanci vzorku. Jedná se tedy o aplikaci Lambert-Beerova zákona. Matematický popis zákalu (turbidity) - T lze vyjádřit rovnicí: ( ) ( ), kde b je tloušťka kyvety, Io počáteční intenzita světelného paprsku a I intenzita paprsku po průchodu suspenzí částic (imunitních komplexů) [28]. Při turbidimetrických metodách bývá nejobtížnější vytvořit dostatečně stabilní suspenzi, která by byla stálá po celou dobu měření. Proto se do reakčních směsí přidávají ochranné koloidy, nejčastěji polyethylenglykol. Výhodou turbidimetrických stanovení je vysoká specificita metody, rychlost stanovení a také nenáročnost detekce. Mezi nevýhody patří potřeba vhodně smísit antigen s protilátkou podle imunoprecipitační křivky, která má 3 fáze - obrázek 4. Obrázek 4: Imunoprecipitační křivka [42] V první fázi se nachází přebytek protilátky a vzrůstá množství precipitátu s přídavkem antigenu. Ve fázi ekvivalence je koncentrace protilátky a antigenu v rovnováze a ve fázi přebytku antigenu se vzniklé imunokomplexy rozpadají. Z analytického hlediska je možno rozdělit precipitační křivku na fázi využitelnou pro měření, bezpečnostní fázi a na fázi za kritickým bodem. Tento kritický bod, který představuje nejvyšší koncentraci antigenu, jakou může analyzovaný vzorek obsahovat, aniž bychom naměřili falešně nízké koncentrace antigenu, by měl být znám u každé prováděné techniky v daném analytickém systému [42]. 22

23 Proteiny akutní fáze 5.2 Prokalcitonin Do roku 1993 byl prokalcitonin (PCT) známý pouze jako prekurzor hormonu kalcitoninu. Po tomto roce se dostal do sítě zánětlivých mediátorů na pomezí cytokinů, hormonů a proteinů akutní fáze a po dobu dalších 20 let byl zánětlivý PCT objektem vědeckého zájmu [30, 34]. V roce 1975 byl objeven intracelulární prekurzor kalcitoninu - preprokalcitonin a jeho štěpné produkty včetně PCT. V dalších letech byly detekovány extrémně vysoké koncentrace plazmatického PCT u septických pacientů a jako hlavní stimulátor tvorby byl označen bakteriální lipopolysacharid (endotoxin). V dnešní době patří PCT k parametrům používaným k diagnostice systémového bakteriálního zánětu [30, 33] Struktura a geneze Struktura PCT je známá od roku PCT je bílkovina složená ze 116 aminokyselin o molekulové hmotnosti 13 kda - obrázek 5. U zdravých pacientů je PCT produkován parafolikulárními buňkami (C buňkami) štítné žlázy [30]. Obrázek 5: Prokalcitonin a jeho štěpné produkty [35] Studie prokázaly, že prakticky veškerý PCT je v endoplazmatickém retikulu C buněk štítné žlázy přeměněn na kalcitonin, proto nedochází k uvolnění PCT ze štítné žlázy do oběhu. Až v roce 2000 se podařilo objasnit zdroj zánětlivého PCT, jehož hodnoty můžeme detekovat v plazmě. Na rozdíl od klasických hormonů není PCT tvořen endokrinní žlázou, ale na jeho produkci se podílí více tkání. Dominantně je za této situace 23

24 Proteiny akutní fáze produkován tkáněmi mimo štítnou žlázu, a to neuroendokrinními buňkami [33], v plicích a střevech. V pozdější době však byla označena jako hlavní zdroj játra. Tento zánětlivý PCT je tvořen pouze 114 aminokyselinami, jelikož na N konci polypeptidového řetězce postrádá dipeptid Ala - Pro. Jeho hladina se zvyšuje v sepsi i u pacientů po thyreoidektomii, tedy chirurgickém odstranění štítné žlázy [30] Etiologie zvýšených hodnot PCT v plazmě Nejvyšších plazmatických hodnot dosahuje PCT u akutních bakteriálních, parazitárních či plísňových infekcí se systémovými projevy a při sepsi. Jedná se o nejspecifičtější marker infikované pankreatické nekrózy, není ovšem plně specifický, jelikož se zvyšuje i z jiných například neinfekčních příčin. Nejvyšší hodnoty se vyskytují u pacientů se sepsí či v septickém šoku. K dalším zvýšením může dojít při popáleninách, dále při mnohočetném traumatu, u pacientů s MODS a také u pacientů v kardiogenním šoku. Tyto hladiny nejsou tak vysoké jako u šoku septického a zvyšují se pomaleji [16, 30]. Vzrůst hladiny PCT je možno pozorovat také u novorozenců bezprostředně po porodu s poklesem na normální hladinu do 48 hodin [16, 32]. U virových infekcí jako je hepatitida B, HIV a další nedochází ke zvýšení hladiny PCT vůbec, nebo pouze mírně. PCT není markerem lokálních bakteriálních (tzv. fokálních) infekcí [30]. Příkladem může být pneumonie bez sepse, kdy je hladina PCT průměrná a pneumonie se sepsí, kdy je koncentrace PCT vysoká. Úspěšná léčba antibiotiky vede k významnému poklesu hladiny PCT v plazmě [16]. U pacientů uzdravujících se po septickém šoku dochází k poklesu hladiny PCT na 50% maximální hodnoty [30]. V důsledku bakteriální infekce dochází k desetinásobnému zvýšení koncentrace PCT v plazmě. Normální koncentrace PCT v plazmě se pohybuje mezi 0-0,5 ng/ml. Jako zvýšená je specifikována koncentrace 0,5-2 ng/ml a vysoká nad 3 ng/ml. Při sepsi a septickém šoku může dosahovat koncentrace až tisícinásobku normálních hodnot, to znamená až 500 ng/ml [33, 34] Kinetika V plazmě neexistují enzymy, které by byly schopné PCT štěpit. Za hlavní eliminační mechanismus jsou považovány ledviny [30]. Pokud se PCT nějakým mechanismem vyhne intracelulární proteolýze a je secernován do oběhu, zůstává v nezměněné podobě 25 až 30 hodin [30]. Z tohoto důvodu je považován za ideální marker pro denní monitorování nemocného pacienta. Hladina PCT v plazmě se zvyšuje po 2 až 6 hodinách od začátku tvorby a maxima dosahuje po 6 až 14 hodinách [33]. 24

25 Proteiny akutní fáze Stanovení Prokalcitonin je stanovován pomocí elektrochemiluminiscenčního imunostanovení (ECLIA) a rutheniového komplexu jako detekční značky pro stanovení výsledného imunokomplexu. [37]. Elektrochemiluminiscence (ECL, elektrogenerovaná luminiscence) je konverze elektrochemické energie na zářivou energii na povrchu elektrody [28]. Princip Elecsys ECLIA je založen na využití tris(2,2 -bipyridyl)ruthenium(ii) - komplexu a tripropylaminu (TPA). Zkráceně na systému [Ru(bpy) 3 ] 2+ / TPA. Na elektrodě je dvojmocná sůl ruthenia oxidována na trojmocnou a zároveň je TPA oxidován na radikál TPA +. Jelikož má tento radikál redukční vlastnosti, snadno redukuje trojmocný ruthenitý komplex na dvojmocný - obrázek 6. Tvoří se tak velký rozdíl potenciálů, který způsobí, že elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny rutheniového kationtu. Po přechodu tohoto elektronu do základního stavu je vyzářen foton a rutheniový komplex je možno znovu podrobit oxidaci [38]. Obrázek 6: Proces systému [Ru(bpy) 3 ] 2+ / TPA [38] Rutheniový kationt prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se a chová se jako enzym. TPA se rozpadá na dipropylamin, v reakci je spotřebováván a slouží jako substrát. Jedná se o terciární amin a právě tyto aminy jsou využívány proto, že dokáží vyvolat nejsilnější luminiscenci [36, 38]. Mechanismus detekce je založen na sendvičovém principu. Celková doba stanovení činí 18 minut. Prvním krokem je vznik sendvičového komplexu, který je tvořen biotinylovanou monoklonální protilátkou proti PCT, vzorkem obsahujícím PCT a 25

26 Proteiny akutní fáze monoklonální protilátkou proti PCT značenou rutheniovým komplexem. V následujícím kroku jsou přidány mikročástice potažené streptavidinem, přičemž dochází k vazbě biotinu a streptavidinu - obrázek 7. Tato vazba je velice pevná, navíc délka vazby způsobuje, že nemůže docházet k žádným sterickým zábranám při vazbě antigenu. Reakční směs je poté nasáta do měřící komůrky, kde jsou mikročástice zachyceny magnetickým polem na povrchu elektrody. Napětí přivedené na komplex vyvolá chemiluminiscenční emisi fotonu z rutheniového komplexu, která je měřena fotonásobičem [36, 37]. Obrázek 7: Schéma metody ECLIA pro stanovení kalcitoninu a prokalcitoninu [39] Jedinečná technologie ECLIA se vyznačuje mimořádnou citlivostí a přesnou reprodukovatelností díky elektrické indukci chemiluniniscenční reakce [38] Srovnání PCT a CRP Oba parametry patří k reaktantům akutní fáze a působí jako regulátory zánětlivého procesu. Ve srovnání s CRP a dalšími proteiny akutní fáze reaguje však PCT na infekční podněty rychleji a stejně tak pokles PCT lépe reflektuje zlepšení klinického stavu. Zvýšené hodnoty PCT přetrvávají během celého období onemocnění. Hladina PCT se vrací do normálních hodnot do 2-3 dní, u CRP přetrvává vysoká hladina po odeznění zánětlivého podnětu 5-7 dní. CRP reaguje citlivěji u pacientů v sepsi, septickém šoku a MODS, ale méně specificky než PCT. Také při diferenciální diagnostice bakteriálních a nebakteriálních onemocnění jsou spolehlivější hodnoty PCT [16]. Obrázek 8: Porovnání specifičnosti PCT a CRP k jednotlivým onemocněním [34]. 26

27 Proteiny akutní fáze 5.3 Pentraxin 3 Lidský PTX3 je prototypem skupiny dlouhých pentraxinů s molekulovou hmotností 45 kda [31]. PTX3 byl poprvé izolován v roce 1993 jako protein indukovatelný IL - 1 a TNF. Jeho gen byl původně označen jako TNF-stimulovaný gen - 14 (TSG-14) [4, 31]. PTX3 je kódován 381 aminokyselinami, jeho struktura je podobná krátkým pentraxinům, ačkoliv patří mezi pentraxiny dlouhé [2, 3]. PTX3 má s CRP totožnou vstupní sekvenci na C terminálním konci peptidu, tvořenou 203 aminokyselinami. N terminální konec PTX3 obsahuje unikátní sekvenci, která je složená ze 178 aminokyselin - obrázek 9. Výsledný protein je na N konci glykovaný [31]. Jednotlivé polypeptidové řetězce (monomery) PTX3 jsou uspořádány do vyšších multimerních komplexů, a to nejčastěji do dekamerů o molekulové hmotnosti 440 kda [1, 31]. Obrázek 9: Porovnání sekvencí aminokyselin dvou pentraxinů CRP a PTX3 [3] Geneze PTX3 byl objeven při hledání genů, které produkují látky jako možné markery zánětlivé reakce. PTX3 je produkován buňkami imunitního systému, je aktivován při zánětlivých procesech a působí jako faktor, který se váže na mrtvé buňky objevující se během zánětlivé reakce a zajišťuje jejich buněčnou diferenciaci [31]. Svým způsobem touto funkcí napomáhá hojení a předchází vzniku zánětu. Lidské periferní krevní buňky produkují tento protein v reakci na bakteriální lipopolysacharidy (LPS), IL - 1, a TNF Působí tedy jako induktory tvorby PTX3. Naopak krevní mononukleární buňky nejsou aktivní v produkci PTX3 v přítomnosti IL - 6, který působí inhibičně [1]. Pentraxin 3 není jako CRP tvořen v játrech, ale je vždy exprimován postiženou tkání, a to stimulovanými 27

28 Proteiny akutní fáze monocyty, endotelem kosterního svalstva, dendritickými buňkami, nediferencovanými a diferencovanými myoblasty či makrofágy [1, 2] Kinetika a etiologie zvýšených hodnot PTX3 Klinický význam stanovení PTX3 zatím není plně objasněn. Vysoké hladiny PTX3 se vyskytují u kriticky nemocných pacientů, s výrazným vzestupem u pacientů v septickém šoku. Normální koncentrace PTX3 v krvi je menší než 2 ng/ml. Po působení infekčního agens dochází k prudkému a výraznému vzrůstu hladiny, při septickém šoku na ng/ml v intervalu 6 až 8 hodin. Hladina PTX3 koreluje se závažností onemocnění. PTX3 má prognostickou funkci u pacientů po akutním infarktu myokardu, kde jeho stanovení může hrát větší roli než CRP. Hladina kulminuje v průměru 7 hodin od prvních klinických známek koronární příhody s hodnotami 6-11 ng/ml. Ve srovnání s CRP má tedy PTX3 mnohem rychlejší kinetiku, jelikož hladina CRP kulminuje téměř po 24 hodinách. Zvýšené hladiny je možné detekovat také u autoimunních poruch a vážných infekcí. Za těchto podmínek se jedná o velice rychlý marker, který disponuje funkcí primární lokální aktivace zánětlivé odpovědi [23] Stanovení Human Pentraxin 3/TSG - 14 Assay je kvantitativní test, který je určen pro stanovení koncentrace lidského PTX3 v plné krvi, séru, plazmě či slinách. Tento test využívá analytickou metodu zvanou ELISA (z angl. Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay), která pomocí imunochemické reakce s fotometrickou detekcí umožňuje stanovit v neznámém vzorku koncentraci analytu. ELISA je speciálním případem metody EIA (z angl. Enzyme ImmunoAssay) [6]. Enzymy byly v imunoanalýze aplikovány poprvé v roce 1971 Engvalem, Perlmannem, Van Weemanem a Schuursem. ELISA stanovení lze rozdělit podle uspořádání na heterogenní kompetitivní se značeným antigenem, heterogenní kompetitivní se značenou protilátkou a heterogenní nekompetitivní enzymoimunoanalýzu se značenou protilátkou [11]. Náš test využívá poslední typ metody. Obecným principem testu je reakce mezi dvojicí protilátek proti dvěma různým antigenním determinantám analytu. Jedna z protilátek je navázána na pevnou fázi a druhá je konjugována s enzymem. Pokud dojde k ustavení rovnováhy, vytváří se sendvičový 28

29 Proteiny akutní fáze imunokomplex. Po přidání substrátu následuje reakce, na jejímž konci je výsledný produkt, který je analyzován spektrofotometricky - obrázek 10 [10]. Obrázek 10: Schéma standartní sendvičové ELISA metody [10]. Konkrétní test PTX3 probíhá v mikrodestičce, jejíž jamky jsou pokryty streptavidinem. V prvním kroku se do destiček pipetuje monoklonální specifická protilátka proti PTX3 konjugovaná s biotinem, který se váže velmi pevně na streptavidin. Reakce probíhá po dobu třiceti minut. Poté je destička promyta a následuje pipetování vzorků do jednotlivých jamek, přičemž PTX3 přítomný ve vzorku je po dobu dvouhodinové inkubace vázán na imobilizované biotinylované protilátky [5]. V dalším kroku je destička promyta a dochází k odstranění všech nenavázaných látek. Současně je přidána jednotlivě do každé jamky monoklonální protilátka proti PTX3 konjugována s křenovou peroxidázou (HRP, z angl. horseradish peroxidase). Mimo jiné dochází během další dvouhodinové inkubace k navázání konjugátu na antigen (PTX-3) a vytvoření sendvičového imunokomplexu. Následné promytí odstraní zbytky nenavázaného konjugátu. Po promytí je do jamek pipetován substrát, který reaguje s enzymem za vzniku produktu [6]. Substrátem je chromogen, v našem případě tetramethylbenzidin (TMB), reagující s peroxidem vodíku [6, 7]. Dochází tak k vratné reakci katalyzované enzymem HRP [9], při níž TMB redukuje peroxid vodíku na vodu, je tedy donorem vodíků a samotný TMB je oxidován na tetramethylbenzidin diimin, tzv. benzidinovou modř - obrázek 11. Ta indikuje vývoj modrého zbarvení [8]. Zastavení reakce je provedeno stop činidlem - 2N kyselinou sírovou za přeměny modrého zbarvení na žluté. Vzniklý konečný produkt je analyzován spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku [6]. 29

30 Proteiny akutní fáze Obrázek 11: Reakce TMB s peroxidem vodíku za vzniku benzidinové modři [7] 30

31 Proteiny akutní fáze 5.4 Presepsin Presepsin (scd14 - ST) je nový diagnostický marker sepse, který lze využít pro včasnou diagnózu a prognózu sepse, při posuzování a sledování míry závažnosti septických stavů a v rizikové stratifikaci kriticky nemocných septických pacientů. Jedná se o polypeptidový fragment složený z 64 aminokyselin, který vzniká štěpením membránového glykoproteinu CD14 (356 aminokyselin). Molekulová hmotnost presepsinu je 13 kda [29]. U septických pacientů je hladina presepsinu významně vyšší než u pacientů se SIRS a zvyšuje se mnohem dříve než hladina IL - 6 [24, 25] Membránový mechanismus sekrece presepsinu Na povrchu monocytů a makrofágů, tedy imunitních buněk, se nachází membránový glykoprotein CD14 (mcd14) [26], který slouží jako receptor pro komplexy lipopolysacharidů (LPS) a LPS vázajících proteinů (LPBP) [25]. Spolu s mcd14 se na membráně nachází také specifický bílkovinný toll - like receptor 4 (TLR4), který váže jako ligandy lipopolysacharidy gramnegativních bakterií na mcd14. Pokud dojde k navázání LPS - LBP komplexu na mcd14, je aktivován TLR4, který vyvolává zánětlivou reakci hostitele proti infekčnímu agens [27]. Současně dochází k uvolnění komplexu LPS - LBP - CD14 a vzniku rozpustného CD14 (scd14) o molekulové hmotnosti 55 kda. Následným působením plazmatických proteáz je scd14 štěpen za vzniku scd14 - ST (soluble CD14 subtype) o molekulové hmotnosti 13 kda, označovaný jako presepsin - obrázek 12 [25]. Obrázek 12: Vznik detekovatelného scd14-st z membrány monocytů [25] 31

32 Proteiny akutní fáze Stanovení Pro stanovení presepsinu (scd14-st) z plné krve nebo plazmy se využívá imunochemický test [27] založený na analytické metodě CLEIA (z angl. ChemiLuminescent Enzyme ImmunoAssay). Principem testu je nekompetitivní chemiluminiscenční enzymová imunoanalýza kombinovaná se speciální technologií MAGRATION - obrázek 13 [25]. Vzorek se dávkuje do reagenční kazety a inkubuje s polyklonální protilátkou proti presepsinu značenou alkalickou fosfatázou (ALP) a monoklonální protilátkou proti presepsinu, pokrytou magnetickými mikročásticemi. Během této inkubace dochází k navázání presepsinu (antigenu), obsaženého ve vzorku, na protilátky za vzniku sendvičového imunokomplexu. V této fázi nachází své uplatnění technologie MAGRATION, která využívá B/F separaci (angl. bound/free) za použití magnetu, při níž dochází k oddělení vázaných a nevázaných částic v roztoku. Nenavázané částice se odstraní promytím. Proces se několikrát opakuje. Po jeho ukončení se do roztoku přidá chemiluminiscenční substrát CDP - Star, který enzymaticky reaguje s ALP za vzniku produktu. Dochází k chemiluminiscenci, vyvolané elektronově excitovanou látkou produkovanou chemickou reakcí, která emituje elektrony, aby dosáhla základního stavu. Měření emise se provádí spektrofotometricky při vlnové délce 461 nm za použití fotonásobiče, který zesiluje dopadající proud fotonů a převádí je na elektrické veličiny. Naměřená luminiscence přímo úměrně odpovídá koncentraci látky ve vzorku [25, 28]. Obrázek 13: Schéma procesu metody CLEIA [25] 32

33 Materiál a metodika Experimentální část 6. Materiál a metodika Stanovovaný soubor představuje celkem 85 pacientů. Z toho 52 pacientů v kardiogenním šoku (KŠ), 14 pacientů v septickém šoku (SŠ) a 19 pacientů s akutním infarktem myokardu s elevacemi ST bez kardiogenního šoku (STEMI). Pacienti byli zařazeni do studie při přijetí na Koronární jednotku (KŠ, STEMI) a Kliniku anesteziologické a resuscitační oddělení (SŠ) FN Brno v období od ledna 2008 do června Každý pacient byl podroben během týdne sedmi časovým odběrům: při přijetí, po 12 hodinách, po 24 hodinách, po 48 hodinách, po 4, 5 a 7 dnech. Vzorky byly ihned centrifugovány v chlazené centrifuze a vzorky séra a plazmy byly uchovávány až do zpracování při -80 C. Ve vzorcích plazmy byly stanoveny hladiny presepsinu, pentraxinu 3, C reaktivního proteinu a prokalcitoninu. Hladiny presepsinu byly měřeny pomocí diagnostické soupravy PATHFAST Presepsin metodou CLEIA na analyzátoru Pathfast (Mitsubishi Chemical Europe GmbH, Düsseldorf, Německo). Rozsah měření stanovení presepsinu: pg/ml, mez detekce: 20 pg/ml, referenční rozmezí: cut - off hodnota 337 pg/ml jako rozlišení mezi zdravými a pacienty se sepsí [25]. Přesnost v sérii (opakovatelnost) byla výrobcem stanovena na 4 hladinách (v rozmezí koncentrací pg/ml) jako CV: 2,9-4,4%. Přesnost mezi sériemi (mezilehlá preciznost) byla výrobcem stanovena na 4 hladinách (v rozmezí koncentrací pg/ml) jako CV: 3,8-5% [25]. Pentraxin 3 byl stanovován s využitím diagnostické soupravy Quantikine (R&D Systems) metodou ELISA na 96 jamkové mikrotitrační destičce. Koncentrace byla stanovena na spektrofotometrickém analyzátoru Reader Expert Plus (Biochrom Ltd. Asys, Cambridge, Velká Británie). Rozsah měření stanovení pentraxinu 3: 0, ng/ml, mez detekce: 0,025 ng/ml, referenční rozmezí 0-1,18 ng/ml [6]. Přesnost v sérii (opakovatelnost) byla výrobcem stanovena na 3 hladinách (v rozmezí koncentrací 2,61-14,4 ng/ml) jako CV: 3,7-4,4%. Přesnost mezi sériemi (mezilehlá preciznost) byla výrobcem stanovena na 3 hladinách (v rozmezí koncentrací 2,75-14,5 ng/ml) jako CV: 4,1-6,1% [6]. 33

34 Materiál a metodika C reaktivní protein byl stanoven imunoturbidimetricky pomocí diagnostické soupravy CRPL3 na analyzátoru Cobas 8000 (Roche, Basilej, Švýcarsko). Rozsah měření CRP: mg/l, detekční limit 0,3 mg/l, referenční rozmezí: < 5 mg/l [41]. Přesnost v sérii (opakovatelnost) byla výrobcem stanovena na 4 hladinách (v rozmezí koncentrací 0, mg/l) jako CV: 0,9-3,7%. Přesnost mezi sériemi (mezilehlá preciznost) byla výrobcem stanovena na 4 hladinách (v rozmezí koncentrací 0, mg/l) jako CV: 1,6-4% [41]. Prokalcitonin byl stanoven metodou ECLIA s využitím kitu Elecsys BRAHMS PCT na analyzátoru Cobas 8000 (Roche, Basilej, Švýcarsko). Rozsah měření PCT: 0, ng/ml, mez detekce: 0,02 ng/ml, referenční rozmezí: hodnoty < 0.5 ng/ml znamenají malé riziko závažné sepse anebo septického šoku, hodnoty > 2.0 ng/ml znamenají velké riziko závažné sepse anebo septického šoku [37]. Přesnost v sérii (opakovatelnost) byla výrobcem stanovena na 3 hladinách (v rozmezí koncentrací 0,08-54,4 ng/ml) jako CV: 1,1-7,1%. Přesnost mezi sériemi (mezilehlá preciznost) byla výrobcem stanovena na 3 hladinách (v rozmezí koncentrací 0,08-54,4 ng/ml) jako CV: 1,6-8,7% [37]. 34

35 Statistika dat 7. Statistika dat K vyhodnocení naměřených hodnot (dále statistických dat) bylo využito několik statistických parametrů a provedeny testy v biomedicínském softwaru MedCalc. Ze základních statistických parametrů byl vypočítán aritmetický průměr, medián, 5. a 95. percentil a vybrána nejvyšší a nejnižší hodnota. Pomocí Mann - Whitney testu byly porovnávány signifikantní rozdíly mezi jednotlivými skupinami pacientů. V softwaru MedCalc byla provedena ROC analýza důležitá pro stanovení cut - off hodnot. Diagramy Box-and-Whisker Plot byly využity pro deskriptivní statistiku - vizualizaci numerických dat pomocí jejich kvartilů. Všechny tyto parametry byly zpracovány pro jednotlivé markery a skupiny pacientů a byly zavedeny do tabulek a grafů. 7.1 Základní statistika Aritmetický průměr je mírou centrální tendence. Jde o nejčastěji používanou charakteristiku střední hodnoty. Vypočítá se jako podíl součtu všech individuálně naměřených hodnot v souboru a počtu členů souboru. Medián je hodnota, která se nachází přesně uprostřed všech hodnot statistického souboru dat seřazených vzestupně či sestupně. Pokud se jedná o soubor, který má sudý počet dat, je medián aritmetickým průměrem dvou prostředních hodnot souboru. Medián rozděluje všechny hodnoty na dvě poloviny. Základní výhodou mediánu jako statistického ukazatele je fakt, že není ovlivněn na rozdíl od průměru extrémními hodnotami. Percentily dělí statistický soubor na setiny. Metoda stanovení 95. percentilu odděluje 5% nejvyšších hodnot od zbylých 95% hodnot všech využitých dat, u stanovení 5. percentilu je tomu naopak. Pro porovnání extrémů jednotlivých skupin byly do statistiky uvedeny nejvyšší a nejnižší hodnoty. 7.2 Mann - Whitney test Jedná se o neparametrický test, který se používá pro porovnání dvou různých souborů statistických dat, u nichž nelze předpokládat Gaussovo normální rozdělení sledovaného znaku. Neparametrické testy testují nulovou hypotézu - H 0 : rozdělení dvou skupin je shodné a alternativní hypotézu - H 1 : rozdělení dvou skupin se liší. Tato hypotéza se týká pouze obecných vlastností rozdělení sledované veličiny ve statistických souborech. 35

36 Statistika dat Mann - Whitney test je využíván pro hodnocení nepárových pokusů, kde je porovnáván totožný kvantitativní znak ve dvou populacích. Výsledkem hodnocení je P - hodnota, která udává, zda je významný statistický rozdíl mezi dvěma skupinami dat. Pokud je P - hodnota nízká (p < 0,05), je zamítnuta nulová hypotéza a přijímána alternativní hypotéza, že mezi skupinami je signifikantní rozdíl [43, 44]. 7.3 ROC analýza ROC (z angl. receiver operating characteristic) analýza je statistický postup pro vyhodnocení laboratorních testů z hlediska správné a falešné pozitivity a správné a falešné negativity laboratorního testu. Výsledkem ROC analýzy je ROC křivka popisující vztah mezi diagnostickou senzitivitou a specificitou laboratorního testu při různých hodnotách cut - off. Cut - off je hodnota, která rozděluje pozitivní a negativní skupinu pacientů (např. nemocnou a zdravou). ROC křivka znázorňuje vztah mezi senzitivitou a specificitou jako závislost senzitivity na 1 - specificity, jedná se o vztah mezi správnou pozitivitou a falešnou pozitivitou. Hodnocení úspěšnosti ROC analýzy je prováděno pomocí parametru AUC (z angl. area under curve), tedy plochy pod křivkou. Plocha může nabývat hodnot 0,5-1. Pokud má AUC hodnotu menší než 0,5, test není kvalitní a má velice nízkou senzitivitu a specificitu. Pokud nabývá parametr AUC hodnoty 1, je test ideální a má 100% senzitivitu i specificitu. Ideální ROC křivka nejprve stoupá téměř svisle vzhůru, teprve poté se zvyšuje míra falešné pozitivity. Tabulka 1: Zhodnocení kvality testu pomocí parametru AUC Hodnota AUC Kvalita testu 0,50 až 0,75 oprávněná 0,75 až 0,92 dobrá 0,92 až 0,97 velmi dobrá 0,97 až 1,00 vynikající Pokud pozorujeme určitý parametr u dvou skupin dat, u nichž víme, že jedna skupina má pozitivní diagnózu a druhá negativní diagnózu, je typické, že dochází k překryvu těchto dvou skupin a vzniku falešně negativních (FN) a falešně pozitivních (FP) výsledků. Podíl FN a FP se mění v závislosti na volbě cut - off hodnoty. Zároveň se 36

37 Statistika dat vznikem FN a FP skupin hodnot vznikají skupiny pacientů, jejichž hodnoty jsou vyhodnoceny jako správně pozitivní (TP) a správně negativní (TN) - obrázek 14. Obrázek 14: Graf zahrnující rozdělení hodnot měřeného parametru do jednotlivých diagnostických skupin v závislosti [47] ROC graf porovnává relativní četnost skutečně pozitivních případů TP, tedy pravděpodobnost, že jako správný bude vyhodnocen pozitivní případ (svislá osa) a relativní četnost falešně pozitivních případů FP, tedy pravděpodobnost, že jako správný bude vyhodnocen negativní případ (vodorovná osa). Kvalita testu je popisována pomocí senzitivity a specificity. Senzitivita neboli citlivost testu, nabývá hodnot od 0 do 1 a vyjadřuje poměr správně pozitivních pozorování proti všem pozitivním případům, tedy úspěšnost, s níž test zachytí přítomnost sledovaného stavu (nemoci) u daného subjektu. Specificita je poměr správně negativních pozorování proti všem negativním případům, tedy schopnost testu přesně vybrat případy, u nichž zkoumaný znak (nemoc) nenastává. Čím vyšší je senzitivita a specificita, tím je metoda užitečnější [45, 47]. Obrázek 15: ROC křivka, závislost senzitivity (TP) a specificity (FP) [47] 37