NEKOPÍROVAT. Epidemiologie polyomavirových infekcí. Vojtěch Šroller. Oddělení imunologie, Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2, U Nemocnice 1

Transkript

1 Epidemiologie polyomavirových infekcí Vojtěch Šroller Oddělení imunologie, Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2, U Nemocnice 1 sroller@uhkt.cz Odborný konzultační den, HPV a HPyV, Charvátův sál, 9. června 2015

2 Historie - polyomaviry 1953 Ludwig Gross- myší polyomavirus - agens způsobující nádor slinných žláz u myší, různé typy nádorů u novorozených myší 1960 Bernice E. Eddy- opičí polyomavirus SV40 buněčná linie makaka rhesuse použitá pro přípravu inaktivované poliovakcíny obsahuje agens způsobující nádory u křečků Historické označení Papovaviridae králičí papillomavirus, myší polyomavirus, vakuolizující virus (= SV40) - dnes polyomaviry a papillomaviry 1971 objeveny lidské polyomaviry JCV a BKV 2008 Lidský polyomavirus Merkelových buněk (MCPyV) objeven v kožním karcinomu z Merkelových buněk

3 Polyomaviry - virion neobalené viry s ikosahedrální kapsidou ~45nm (příbuzné papillomavirům) celosvětově rozšířené, promořenost populace vysoká přenos fekálně-orální cestou, respiračně primární infekce bezpříznaková, celoživotní persistentní infekce oportunní patogeny, reaktivace viru během immunosuprese

4 Polyomaviry - genom genom tvoří kruhová dvojřetězcová DNA replikační počátek, oblast regulace transkripce geny pro časné nestrukturální proteiny (T-ag, t-ag, 57kT) (t = tumor antigen) regulace buněčného cyklu, replikace virové DNA 3 kapsidové proteiny (VP1,VP2,VP3) mikrorna autoregulace transkripce Large T 4000 Small t 1000 KIV-Stockholm bps 3000 ori 5000 VP VP1 VP3

5 tkáňová specifita dána interakcí virových a buněčných faktorů Životní cyklus polyomavirů Vazba na receptory, endocytoza, transport virové kapsidy do jádra, uvolnění DNA transkripce časná (T-ag), replikace virové DNA (T-ag a buněčná DNA polymeráza) spolu s transkripcí genů pro virové strukturní proteiny (VP1, 2, 3), tvorba kapsid lyze buňky, uvolnění virionů z jádra viremická fáze, silná imunitní odpověď, latentní infekce Převzato z Fishman (2002).

6 Polyomaviry a nádory Virové T-antigeny - onkogeny v infikované buňce interakce s p53 a prb, vstup do S-fáze a inhibice apoptozy deregulace buněčného cyklu, transformace a imortalizace infikovaných buněk v kultuře Schopnost polyomavirů vyvolat nádory u laboratorních zvířat myši, křečci 2008 první lidský nádorový polyomavirus MCPyV polyomavirus karcinomu z Merkelových buněk Zkoumá se úloha dalších lidských polyomavirů při vzniku nádorů

7 Polyomaviry - taxonomie Van Gheule, Rev.Med.Virol 2012

8 Polyomaviry rozšíření Polyomaviry infikují savce a ptáky, ale i ryby mezi jednotlivými druhy jsou nepřenosné; jejich vývoj pravděpodobně probíhal společně s jejich hostitelskými druhy, evolučně velmi staré viry lidských polyomavirů známe 13

9 virus rok poprvé nalezen JCV 1971 mozková tkáň, progresivní multifokální encefalopatie (PML), pacient s Hodgkinovým lymfomem BKV 1971 moč, imunosuprimovaný pacient po tranplantaci ledviny KIV 2007 respirační sekret, dítě, respirační problémy WUV 2007 respirační sekret, dítě, respirační problémy MCPyV 2008 karcinom z Merkelových buněk HPyV kůže HPyV kůže TSPyV 2010 kožní výrůstky Trichodysplasia spinulosa, pacient po transplantaci srdce HPyV sérum, pacient po tranplantaci ledviny MWPyV 2012 stolice, kožní výrůstky WHIM (Warts Hypogammaglobulinemia, Infections and Myelokathexis syndrome STLPyV 2013 stolice, dítě HPyV játra Lidské polyomaviry NJPyV 2014 Endoteliální buňky, nekrotická místa, pacient po transplantaci slinivky

10 Lidské polyomaviry - BK BKPyV Seroprevalence % přenos orálně/respiračně v dětství, bezpříznaková infekce Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%) Reaktivace u immunodeficientů: Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny (1-10%, rejekce štěpu 15-50%) Hemoragická cystitida u příjemců HSCT (cidofovir) Existence až 5 serotypů (Ib1, Ib2, II, III, IV), odlišitelné neutralizačním testem Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN)

11 Polyomavirus JC JCPyV Seroprevalence 50-80% Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%) Geografické varianty, 14 genotypů (Evropa 1-4) Reaktivace u immunodeficientů: invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů, abortivní infekce astrocytů, přestavby - regulační oblast virového genomu, gen pro kapsidu Progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) - AIDS, transplantovaní, imunosupresivní terapie při léčbě roztroušené sklerózy (RS) natalizumab Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku

12 Seroprevalence 50-90% Polyomavirus MCPyV Součást kožní mikroflory, běžně na povrchu kůže zdravých jedinců (DNA) Karcinom z Merkelových buněk (MCC) MCPyV etiologickým agens u 80% virus se masivně pomnoží, integrace do buněčného genomu, charakteristická mutace v genu pro velký T-antigen, ztratí schopnost replikovat DNA Diagnostika- Q-PCR Karcinom z Merkelových buněk (MCC) vzácný, maligní kožní nádor kůže, incidence / /rok Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření, imunosuprese (AIDS, CLL, 3-30x vyšší riziko) MCC

13 Další lidské kožní polyomaviry HPyV6, HPyV7 a TSPyV Seroprevalence HPyV % HPyV % TSPyV 70-80% Na kůži, nízká prevalence HPyV6 může přispívat ke vzniku proliferační chorby kůže u osob léčených BRAF inhibitory (?) HPyV7 - kožní vyrážky u pacientů po transplantaci plic (?) TSPyV vzácné kožní onemocnění u pacientů po tranplantaci srdce (trichodysplasia spinulosa, TS) TS

14 Seroprevalence KIPyV 55-90% WUPyV 69-98% Polyomaviry WU a KI Nalezeny v nasopharyngeálním aspirátu dětí s repirační infekcí V respirační traktu prevalence 0.5 7%, patogenze není známa

15 Lidské polyomaviry HPyV9, MwPyV, STLPyV, HPyV12 a NJPyV Seroprevalence HPyV % MwPyV 75 % STLPyV 68-70% HPyV % NJPyV 20% Patologie není známá

16 Seroprevalence (%) Seroprevalence MCPyV, JCPyV a BKPyV podle věku ČR Itálie zdravé osoby (991) pacienti-různí (947) >59 Age group (years) MCPyV JCV BKV Viscidi RP, et al. Clin Vaccine Immunol. 2011

17 OD index OD index OD index Hladiny protilátek proti PyV podle věku MCPyV BKV >59 Age group (years) JCV >59 Age groups (years) >59 Age groups (years)

18 Polyomaviry SV40 a LPV Opičí viry SV40, makak rhesus, LPV, kočkodan SV40, onkogenní u hlodavců, kontaminanta injekční polio vakcíny v letech 20. století SV40 DNA nalezena v některých lidských nádorech (90. léta 20. století) LPV - protilátky nalézány u 20% lidí od 80.let 20. století Možná křížová reaktivita s velmi podobným HPyV9, objeven 2011

19 Martina Saláková Viera Ludvíková Eva Hamšíková Šárka Němečková Jan Musil Ruth Tachezy

20 Polyomaviry SV40 a LPV

21 Polyomaviry BK a JC BK Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%) Reaktivace u immunodeficientů: Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny Hemoragická cystitida u příjemců HSCT Existence více (2?) serotypů Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN) JC Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%) Reaktivace u immunodeficientů: invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku

22 Polyomaviry BK a JC BK Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%) Reaktivace u immunodeficientů: Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny Hemoragická cystitida u příjemců HSCT Existence více (2?) serotypů Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN) JC Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%) Reaktivace u immunodeficientů: invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku

23 Polyomaviry BK a JC BK Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a močových cest, vylučován močí (5%) Reaktivace u immunodeficientů: Polyomavirová nefropatie u příjemců Tx ledviny Hemoragická cystitida u příjemců HSCT Existence více (2?) serotypů Diagnostika- Q-PCR v krvi, moči, ISH v biopsiích (PVN) JC Persistence v epiteliálních buňkách ledvin a v B lymfocytech, vylučován močí (20%) Reaktivace u immunodeficientů: invaze do CNS, produktivní infekce oligodendrocytů a abortivní infekce astrocytů Progresivní multifokální leukoencefalopatie, AIDS, transplantovaní, imunosuprimovaní, natalizumab při léčbě MS Diagnostika- Q-PCR v krvi, mozkomíšním moku

24 Cíle práce 1. Stanovení protilátkové odpovědi proti polyomavirům u naší zdravé populace 2. Získání informace o výskytu DNA polyomavirů

25 Detekce protilátek proti virové kapsidě MCPyV JCV a BKV v lidském séru Protilátky jsou měřeny metodou ELISA Antigen prázdné kapsidy (VLP) složené z proteinu VP1 MCPyV, BKV nebo JCV připravené v bakulovirovém expresním systému bac-to-bac (Invitrogen) HPyV6 a HPyV7 VP1, kromě VLP také příprava antigenu v E.coli (GST fúzní protein) Pozitivní kontrola séra z myší imunizovaných hotovými VLP nebo DNA vakcínou (Gene gun) exprimující příslušný VP1 protein (rychlejší)

26 Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Invitrogen)

27 Kapsidový protein VP1 na elfo a EM VLP 50 kda MCPyV BKV JCV MuPyV MCPyV ~45 nm BKV ~45 nm HPV 16 ~55 nm

28 sub populace Prevalence anti-vp1 PyV u populace ČR N anti-mcpyv + anti-bkv + anti-jcv + všichni ,4 % 68,7 % 56,6 % děti 6-9 roků ,9 % 72,9 % 47,7 % ženy ,3 % 70 % 55,4 % muži ,2 % 67,1% 58 %

29 Seroprevalence (%) Seroprevalence MCPyV, JCV a BKV podle věku ČR Itálie zdravé osoby (991) pacienti-různí (947) >59 Age group (years) MCPyV JCV BKV Viscidi RP, et al. Clin Vaccine Immunol. 2011

30 OD index OD index OD index Hladiny protilátek proti PyV podle věku MCPyV BKV >59 Age group (years) JCV >59 Age groups (years) >59 Age groups (years)

31 Existuje křížová reaktivita protilátek proti VP1 MCPyV, JCV a BKV v lidském séru? BKV OD index Korelační test MCPyV OD index 50 vzorků séra, věk let BKV X MCPyV r 2 =0,029 JCV X MCPyV r 2 = 0,010 JCV X BKV r 2 = 0 r 2 =0.029

32 Prevalence anti-vp1 HPyV6 a HPyV7 u dárců (skupina z r. 2010) Dárci N HPyV6 HPyV7 Ženy 86 Muži 220 Všichni (90%) 193 (88%) 270 (88%) 53 (62%) 148 (67%) 201 (66%)

33 Metody - Detekce MCPyV DNA v lidských tkáních ve stěru a výplachu DNA ekvivalentní 30,000 buněk z tkáně nebo 5 ul DNA z kožního stěru Vzorky pozitivní na RNAsuP (buněčný gen) v real-time PCR (TaqMan proba a primery) byly dále testovány TaqMan proba a primery pro realtime PCR (Q-PCR) v oblasti v T- antigenů (LT3) a kapsidového proteinu VP1 (Toracchio et al., 2010). VP1 LT3

34 Prevalence HPyV-DNA u zdravých dobrovolníků Populace Materiál Počet osob Zdraví dobrovolníci Kožní stěr Immunosuprimovaní Orální výplach Kožní stěr Orální výplach MCV DNA + HPyV6 DNA + HPyV7 DNA % 4% 8% 25 40% 0% 0% 14 43% 0% 0% 10 20% 0% 0%

35 počet genomů MCPyV Virová nálož u zdravých osob Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, stanovení virové nálože MCPyV pro jednotlivce. HPyV6 a HPyV7 detekujeme pouze desítky kopií ve stěru. 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 Stěr Výplach 1,0E dobrovolník

36 CLL a MCPyV Prevalence MCPyV DNA v PBMC u zdravých a imunosuprimovaných jedinců (B-CLL) Skupina počet pozitivní (%) Zdraví 9 1 (11) CLL 24 2 (8) Množství DNA v PBMC u obou skupin bylo <0.01 genomu/buňku V MCC je běžně nalézáno >1 MCPyV genomu/buňku

37 Prevalence (%) Prevalence polyomavirů MCPyV, HPyV6 a HPyV7 ve zdravých tonsilách (60 parafinových vzorků) ,3 3,3 0 21,7 33,3 21,7 MCPyV HPyV6 HPyV7 TTV TTMV TTMDV

38 MCPyV a další polyomaviry v ČR SOUHRN Protilátky proti MCPyV nalezeny u 63% obyvatel, což odpovídá publikovaným údajům z Evropy a USA MCPyV DNA je běžně přítomna v kožních stěrech a výplachu z krku zdravých dobrovolníků. Záchyt a kvantita vyjádřená počtem kopií genomu MCV v kožních stěrech je vyšší než ve výplachu z krku. Přítomnost protilátek a nález MCV DNA na kůži a v dutině ústní spolu korelují. HPyV6 a HPyV7 DNA se na kůži vyskytuje vzácně, nenašli jsme ji ve výplaších z krku. MCPyV DNA jsme nalezli pouze asi v 10 % PBMC CLL pacientů a zdravých jedinců. V tonsilách od zdravých jedinců jsme nalezli MCPyV DNA a HPyV6. DALŠÍ CÍLE Zjistit seroprevalenci HPyV6 a HPyV7 v obecné populaci ČR

39 Martina Saláková Viera Ludvíková Eva Hamšíková Petra Vochozková Šárka Němečková Jitka Forstová Martin Freiberk Práce je podporována grantem P304/10/1511 GAČR

40

41 GST VP1 HPyV 6 a 7 fuzní proteiny: pgex v E.coli BL21 Ptac GST VP1 26kDa 46kDa ~ 75kDa GST VP1: HPyV6 HPyV7 GST ELISA Flag Izolace: French press

42 Prevalence anti-vp1 HPyV 6 a 7 u dárců (skupina z r. 2010) Dárci N GST6 Bac6 GST7 Bac7 Ženy 86 Muži 220 Všichni (90%) 184 (84%) 77 (90%) 193 (88%) 67 (78%) 170 (77%) 261 (86%) 270 (88%) 237 (78%) 53 (62%) 148 (67%) 201 (66%)

43 Genom tvoří ds DNA ~5200 bp, replikační počátek, oblast regulace transkripce geny pro časné nestrukturální proteiny (T-ag, t-ag, 57kT) (t = tumor antigen) regulace buněčného cyklu, váže prb (p53), replikace virové DNA pozdní agnoprotien (může chybět) 3 kapsidové proteiny (VP1,VP2,VP3) virová mirna stěpí časné virové mrna Genom polyomavirů

44 Polyomaviry BKV - polyomavirová nefropatie (PVAN) hemoragická cystitida (HSCT) JCV - progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) AIDS, transplantace, natalizumab MCPyV - MCC, imunosuprese, CLL TSPyV- trichodysplasia spinulosa, tranplantace Large T 4000 Small t ori 5000 VP KIV-Stockholm bps VP VP1

45 Lidské polyomaviry virus výskyt komplikace seroprevalence JC BK běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin, B- lymfocytech běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin, reaktivace při imunodeficitu (transplantace) terapie,aids), do CNS, progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) reaktivace při imunodeficitu, hemoragická cystitida (HSCT), polyomavirová nefropatie (transplantace ledviny) ~ 50-80% ~ 90% KI respirační trakt, děti respirační? ~ 55-90% WU respirační trakt, děti respirační? ~ 69-98% MCPyV kůže karcinom z Merkelových buněk ~ 45-80% HPyV6 kůže? ~ 69% HPyV7 kůže, sliznice? ~ 35% TSV kůže trichodysplasia spinulosa při imunodeficitu HPyV9 sérum???

46 serokonverze v dětství většina dospělých seropozitivní Metody stanovení protilátek proti kapsidě hemaglutinace (MCPyV-ovce) ELISA založená na kapsidových proteinech nebo prázdných kapsidách (VLPs) neutralizační test založený virionech nebo VLPs s reportérovým genem. Seroprevalence polyomavirů virus seroprevalence JC % BK % KI % WU % MCPyV % HPyV % HPyV % TSV % HPyV % HPyV10

47 Comparison of anti-merkel cell polyomavirus (MCV) VP1 antibody titers in 68 patients with Merkel cell carcinoma (MCC; blue) and 82 controls (gold). Touzé A et al. JCO 2011;29: by American Society of Clinical Oncology

48 Karcinom z Merkelových buněk (MCC) a MCPyV polyomavirus MCPyV objeven v roce 2008 v 8 z 10 nádorů (80%) karcinomu z Merkelových buněk (MCC) MCC vzácný, agresivní nádor kůže, incidence 0.5/ /rok Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření, imunosuprese (AIDS, CLL) MCC MCPyV+, genom viru je náhodně vložen v jedné nebo více kopiích do buněčné DNA virus se nereplikuje, nejsou produkovány virové kapsidové proteiny (VP1, VP2, VP3) produkována zkrácená forma virového T-ag (důsledek mutace či delece), přispívá k transformaci buněk (vazba prb, aktivace 4E-BP1, regulace translace) Virus hraje roli při vzniku MCC Polyomaviry HPyV6 a HPyV7 polyomaviry HPyV6 a HPyV7 byly nalezeny na kůži zdravých jedinců není známo, zda způsobují nějaké onemocnění MCC

49 Úloha MCPyV při vzniku karcinomu z Merkelových buněk (MCC) MCC MCC vzácný, agresivní nádor kůže (CK20), snadno metastazuje, incidence 0.5/ /rok Rizikové faktory jsou světlá pokožka, věk, UV záření (často na kůži vystavené slunci), imunosuprese (AIDS, CLL) MCC a MCPyV virovou DNA lze nalézt v ~80%, nádorů genom viru je náhodně vložen v jedné nebo více kopiích do buněčné DNA ve virové DNA je gen pro T-ag je zkrácen (chybí C-konec proteinu, ztráta replikační funkce), zkrácený protein je produkován, přispívá k transformaci buněk v MCC nejsou produkovány virové kapsidové proteiny VP1 Feng H et al., Science 2008;319:

50 Úloha MCPyV při vzniku karcinomu z Merkelových buněk (MCC) MCPyV DNA jako prognostický marker u MCC pacientů Pokud je v primárním nádoru MCPyV DNA v množství > 1 genom/buňku je prognoza přežití (roky) výrazně lepší než pokud je < 1 genom/buňku či MCPyV negativní protilátky proti MCPyV jako prognostický marker u MCC pacientů Pro pacienty s vyšší hladinou anti-mcpyv protilátek je prognoza přežití lepší Dva různé typy MCC?

51 Výsledky 1 Detekce MCPyV DNA v karcinomu z Merkelových buněk FFPE vzorky MCC od 19 pacietů (průměrný věk 75 let, rozmezí let), 19 primárních karcinomů, navíc od 2 pacientů recidivy, z Vinohradské nemocnice a 12 FFPE z FN Bulovka barvení IHC na T-ag MCPyV (protilátka CM2B4) metoda detekce DNA (Q-PCR) pozitivní /celkem % 25/ IHC (CM2B4) 15/ DNA Q-PCR, 19 T-ag+VP1, 4 T-ag většina MCC >1 kopie virové DNA/buňku (Q-PCR) 12 kontrolních FFPE melanomů negativní pro MCPyV

52 Výsledky 1 Zmražený MCC - mutace v genu pro T-ag MCPyV 1540 delece 2866 M1, M2 Shuda M et al. PNAS 2008;105: V nádoru celý genom MCPyV V nádorech (MCC) charakteristické mutace T-ag které vedou k předčasnému zkrácení T- ag v C-koncové části. Takový protein není schopen replikovat virovou DNA ale může vázat prb. Část ORF pro T-ag ORF může být zkrácena během integrace do genomu. Replikace viru může být znemožněna i mutací ve virovém replikačním počátku. Příkladem je bodová mutace v jednom z osmi T-vazebných motivů GAGGC nalezena u izolátu z nádoru (MC350).

53 MCC, IHC barvení protilátkou proti MCPyV T-ag (CM2B4), 10x, 20x, 40x, (MUDr T.Jirásek)

54 Výsledky 2 Prevalence MCPyV, HPyV6, HPyV7 DNA u zdravých a imunosuprimovaných jedinců Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, zdraví jedinci a pacienti AML po transplantaci kostní dřeně (5 měsíců), detekce virové DNA Q-PCR Group Material Tested MCPyV positive (%) HPyV6 positive (%) HPyV7 positive (%) Healthy Skin swabs (72) 1 (4) 2 (8) Oral rinses (40) 0 (0) 0 (0) Immunosupressed Skin swabs 14 6 (43) 0 (0) 0 (0) Oral rinses 10 2 (20) 0 (0) 0 (0)

55 Percent Výsledky 2 Prevalence MCPyV, HPyV6 a HPyV7 DNA u zdravých jedinců Kožní stěry a výplachy dutiny ústní, detekce Q-PCR pro jednotlivé viry

56 Výsledky 2 variabilita kapsidového proteinu VP1 MCPyV 2 sekvence od zdravých jedinců CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment 12a MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA 100 MCC339 MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA 100 R17a MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA 100 V_30 MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA 100 V_5 MAPKRKASSTCKTPKRQCIPKPGCCPNVASVPKLLVKGGVEVLSVVTGEDSITQIELYLNPRMGVNSPDLPTTSNWYTYTYDLQPKGSSPDQPIKENLPA 100 **************************************************************************************************** 12a YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETI 200 MCC339 YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTQYPKTTNGGPITIETV 200 R17a YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV 200 V_30 YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV 200 V_5 YSVARVSLPMLNEDITCDTLQMWEAISVKTEVVGISSLINVHYWDMKRVHDYGAGIPVSGVNYHMFAIGGEPLDLQGLVLDYQTEYPKTTNGGPITIETV 200 ************************************************************************************:**************: 12a LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM 300 MCC339 LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM 300 R17a LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM 300 V_30 LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM 300 V_5 LGRKMTPKNQGLDPQAKAKLDKDGNYPIEVWCPDPSKNENSRYYGSIQTGSQTPTVLQFSNTLTTVLLDENGVGPLCKGDGLFISCADIVGFLFKTSGKM 300 **************************************************************************************************** 12a ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ 400 MCC339 ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ 400 R17a ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ 400 V_30 ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ 400 V_5 ALHGLPRYFNVTLRKRWVKNPYPVVNLINSLFSNLMPKVSGQPMEGKDNQVEEVRIYEGSEQLPGDPDIVRFLDKFGQEKTVYPKPSVAPAAVTFQSNQQ 400 **************************************************************************************************** 12a DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL 423 MCC339 DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL 423 R17a DK---GKAPLKGPQKASQKESQTQEL 423 V_30 DKQDKGKAPLKGPQKASQKESQTQEL 426 V_5 DK---GKAPLK----ASQKESQTQEL 419 ** ****** ***********

57 Výsledky 3 Prevalence anti-vp1 MCPyV protilátek a MCPyV DNA u dobrovolníků materiál detekce testováno pozitivní % sérum anti- MCPyV kožní stěr DNA výplach z krku DNA U 78.6 % (11 z 14) seropozitivních jedinců jsme nalezli MCPyV na kůži

58 Výsledky 3 Seroprevalence anti MCPyV, BKV a JCV protilátek u zdravé populace 991 vzorků sér, serologické přehledy 2001 (Státní zdravotní ústav). Všechny věkové skupiny od 6 let výše. ELISA testy pro VLPs MCPyV, BKV a JCV. věk/ protilátky do 21 (%) n=351 >21 (%) n=640 MCPyV BKV JCV 48 63

59 Procent pozitivních Výsledky 3 MCPyV, BKV a JCV specifické protilátky u zdravé populace Počet osob s BKV protilátkami se s přibývajícím věkem snižuje, u JCV a MCPyV protilátek je to naopak. Vysoká seroprevalence pro všechny PyV je již ve věkové skupině 6-10 let. věk

60 Výsledky 3 prevalence anti-vp1 MCPyV protilátek u dárců krve průměrný věk 35 let, rozmezí let, Dárci krve n anti - MCPyV % ženy muži celkem

61 Průběh infekce MCPyV u zdravých a imunosuprimovaných jedinců Screening sér zdravých a imunosuprimovaných jedinců na přítomnost anti-mcpyv protilátek - MCPyV VP1 gen (kodonově modifikovaný, AddGene Ch.Buck) do vektoru pfastbacdual pod polyhedrynový promotor - ELISA založená na VP1 MCPyV VLPs produkovaných rekombinatními bakuloviry v hmyzích buňkách (Vierka Ludvíková) - pozitivní myší séra myši imunizované DNA vakcínou, GeneGun, VP1 gen ve vektrou pbsc Testování buněčné imunity u zdravých jedinců -buněčná imunita proti virovým proteinům (T-ag, VP1) ELISPOT, produkce IL-2, IL-4, IFN-gamma (Šárka Němečková)

62 Soubor FFPE MCC od MUDr Jiráska 23 vzorků od 19 pacietů (19 primární karcinomy, 4 reidivy od 2 pacientů) IHC na markerů (Ck20, Ck7, TTF-1, CgA, NSE) IHC na T-ag MCPyV u 18 primárních karcinomů (protilátka CM2B4) pozitivních 13 (72 %) negativních 5 (28 %) Izolace DNA na detekci MCPyV (Q-PCR - MCPyV, RNaseP)

63 Sledování infekce dalšími lidskými polyomaviry - příprava rekombinantních bakulovirů produkujících VLPs z VP1 HPyV6 a HPyV7 (kodonově modifikovaný, AddGene) - rekombinantní bakuloviry produkjící VLPs z VP1 dalších polyomavirů (BKV, JCV, MuPyV) (PřFUK) - detekce DNA z virů HPyV6, HPyV7, HPyV9 (ELISA?) u zdravých a imunosuprimovaných jedinců - místa integrace MCPyV v MCC, také CLL

64 Průběh infekce MCPyV u zdravých a imunosuprimovaných jedinců - zjišťování DNA sekvence izolátů Vp1 ori LT3/LT3i Část genomu MCPyV amplifikovaná při nested PCR pomocí samdy primerů LT3/LT3i, další sady primerů jsou používány pro amplifkaci delších genomových fragmentů, pro celé genomy RCA (podle Feng et al. Science 2008, upraveno). T

65 Děkuji za pozornost