ALERGIE A JEJÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd ALERGIE A JEJÍ LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Ivo Lochman, CSc. Hradec Králové 2010 Vladimíra Zembová

2 Poděkování Děkuji RNDr. Ivo Lochmanovi CSc, který se ujal vedení mé bakalářské práce a vždy mi ochotně poradil a svým vstřícným přístupem mi pomáhal po celou dobu, kdy jsem vypracovávala tuto bakalářskou práci. Zároveň děkuji RNDr. A. Lochmanové, PhD. za zpřístupnění své disertační práce a kolegyním, které mi byly oporou v praktických laboratorních záležitostech.

3 Obsah 1. Úvod Základní pojmy Faktory ovlivňující vznik a rozvoj alergie Genetické faktory Vliv prostředí Vliv infekce Imunologické základy alergické odpovědi Alergeny Obecné zákonitosti Nejvýznamnější skupiny alergenů Rekombinantní alergeny Diagnostika alergií Testy in vivo Laboratorní diagnostika Sérologická diagnostika Imunoglobulin IgE Specifické IgE Specifické IgG Stanovení mediátorů alergické reakce Biologické buněčné testy Bazotesty Uvolnění mediátorů po expozici alergenem Test degranulace krysích žírných buněk Testy na měření Th1 a Th2 odpovědi po stimulaci alergenem Srovnání metod pro diagnostiku alergií Srovnání laboratorních testů v dg. alergií provedená na odd. imunologie a alergologie CKL ZÚ Ostrava Současný stav a poznatky v laboratorní dg. Alergií Terapeutické možnosti alergických stavů Závěr Literatura

4 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. V Ostravě podpis: - 2 -

5 1. Úvod Alergie je přehnaná, nepřiměřená reakce organismu spouštěná podněty, na které většina jedinců nereaguje. Podstatou alergické reakce jsou děje navozené uvolněním určitých zánětlivých mediátorů, ke kterým dochází imunologickou nebo neimunologickou cestou. Za imunologicky podmíněnou reakci bývá nejčastěji označována reakce zprostředkovaná protilátkami třídy IgE. Dědičně podmíněný sklon k alergii, jehož podstatou je právě zvýšená protilátková odpověď ve třídě IgE na běžné alergeny zevního prostředí jako je pyl, prach, plísně, roztoči aj., se nazývá atopie. (Panzner a Špičák 2004, Johansson a kol. 2001, Johansson a kol. 2004) Výskyt alergických onemocnění v různých zemích světa kolísá v závislosti na klimatických podmínkách a industriálních faktorech. Zatímco v rozvojových zemích tyto choroby zatím nepředstavují závažnější problém, ve vyspělých zemích dochází od druhé poloviny 20. století k významnému vzestupu alergických onemocnění a stávají se závažným problémem zdravotním, sociálním a ekonomickým. Existuje předpoklad, že vzestupný trend počtu alergiků v populaci souvisí se změnami životního stylu a změnami životního prostředí. Z toho důvodu se alergie a alergická onemocnění dostávají do popředí zájmů jak odborníků tak laické veřejnosti. (Lochmanová, 2008) Objev IgE v roce 1966 Ishizakou se spolupracovníky položil základní kámen poznání alergické reakce, i když na existenci faktoru přítomného v krvi alergických pacientů upozornili již v roce 1921 Prausnitz a Küstner. Ačkoliv je úloha IgE v alergické reakci chápána stále jako klíčová, je třeba si uvědomit, že jeho tvorba je bezprostředně závislá i na celé řadě dalších faktorů účastnících se vzniku a průběhu tohoto složitého patofyziologického procesu. Současný výčet mechanismů, podílejících se na vzniku a projevu alergické reakce není zdaleka konečný a množství informací neustále narůstá. Přispívá k tomu i rozvoj laboratorních technik umožňujících sledovat jednotlivé procesy až na molekulární úrovni. Nárůst poznání v rovině teoretické, by měl přispět i k vývoji nových a efektivních terapeutických zásahů. (Lochmanová, 2008) - 3 -

6 2. Základní pojmy Základními pojmy, se kterými budeme operovat a jejich definice jsou: Alergie je klinická reakce přecitlivělosti navozená imunologickými mechanismy. Ve většině případů patří protilátky odpovědné za alergickou reakci do třídy IgE Alergeny jsou antigeny vyvolávající alergii Atopie je sklon k tvorbě IgE protilátek Přecitlivělost (hypersensitivita) je příčinou reprodukovaných příznaků nebo projevů, které jsou spouštěny kontaktem s definovaným podnětem, na který normální jedinci nereagují. Hyperreaktivita je přehnanou reakcí na normální podnět (Špičák, 2002) I dnes je ještě často používaná pro charakterizaci onemocnění, v jejichž patogenezi hraje podstatnou úlohu imunitní systém, klasifikace podle Coombse a Gella (Johansson a kol.,2001), přestože je již překonána a její používání se nedoporučuje. Podle této klasifikace jsou onemocnění řazena do pěti kategorií: I. Časná přecitlivělost II. Cytotoxická přecitlivělost III. Přecitlivělost z imunitních komplexů IV. Oddálená (buněčná) přecitlivělost V. Stimulační přecitlivělost Alergie jsou podle této klasifikace řazeny mezi reakce časné přecitlivělosti (I. typ). Názvy časná a oddálená přecitlivělost jsou historické a odráží časový průběh kožní reakce po intradermálním event. subkutánním podání antigenu. (Stites D.,Terr A.,1994) - 4 -

7 Buňky alergického zánětu Žírné buňky (mastocyty) Mastocyty jsou primární efektorové buňky a rozehrávači alergické reakce I. typu. Nacházejí se mezi epitelovými povrchy a parenchymem kůže, střeva a respiračního traktu. Zralé mastocyty necirkulují v krvi, ale dokončují svou diferenciaci až ve tkáních. Jsou to na rozdíl od bazofilů dlouho žijící buňky. Mají nečleněné oválné jádro a cytoplazmatických granul. Na svém povrchu nesou mj. vysoceafinitní receptor pro IgE (FcεRI), který je zásadní pro aktivaci žírných buněk po kontaktu s alergenem. Ve vysoké denzitě exprimují molekulu CD117, kterou je možné využít k identifikaci mastocytů ve tkáních. (Panzner, Špičák, 2004) Tab. 1: Funkce žírných buněk Fyziologická Antibakteriální Antiparazitární (červi) Hojení ran Angioneogeneze podle Boyce J.A., 2003 Patofyziologická Alergie, astma Fibróza Revmatoidní arthritida Roztroušená skleróza Vrozené srdeční vady Podle lokalizace a struktury se mastocyty rozdělují na dva typy: Mastocyty slizniční tkáně - vyskytují se v plících, ve sliznici nosu a gastrointestinálního traktu. V granulích obsahují histamin, tryptázu a proteoglykan-chondroitinsulfát. Poločas života je kratší než 40 dní. Mastocyty pojivové tkáně - vyskytují se v kůži, lymfatických uzlinách, podslizničním vazivu, tj. pojivu. V granulích obsahují histamin, heparin a kromě tryptázy i chymázu. Poločas života je delší 6 měsíců. (Panzner, Špičák, 2004) - 5 -

8 Bazofily Základní funkce je stejná jako u mastocytů, tj. degranulace a uvolnění prozánětlivých mediátorů jako odpověď na alergenní přemostění molekul IgE vázaných na jejich FcεRI receptory. Dozrávají v kostní dřeni, následně cirkulují v periferní krvi a mohou pronikat do tkání. Tkáň infiltrují až po několika hodinách od expozice alergenu a přispívají tak především ke vzniku pozdní fáze alergické reakce. Bazofily jsou nejmenší granulocyty, které mají jen malou schopnost fagocytovat. Obsahují menší počet granulí s histaminem než mastocyty. Jsou zodpovědné za alergické reakce na alergeny, které pronikly přímo do oběhu, tj. např. intravenózně aplikované léky nebo hmyzí jed. (Panzner, Špičák, 2004) Eozinofily Eosinofily jsou nejvýznamnější buňky uplatňující se v patogenezi chronického alergického zánětu a v obraně proti parazitům. Jádro je tvořeno dvěma segmenty a v cytoplazmě nacházíme velká cytoplazmatická granula s obsahem bazických proteinů. Jedná se o : MBP- hlavní bazický protein. Po degranulaci působí toxicky na parazity a nádorové buňky, po vazbě na bazofily způsobuje uvolnění histaminu. Vyskytuje se ve sputu astmatiků. ECP eozinofilní katonický protein EDN eozinofily tvořený neurotoxin EPO eozinofily tvořená peroxidáza (Panzner, Špičák, 2004) - 6 -

9 3. Faktory ovlivňující vznik a rozvoj alergie 3.1. Genetické faktory Z výsledků epidemiologických studií vyplývá, že existuje genetická dispozice pro rozvoj atopické reaktivity. Bylo popsáno zhruba 18 oblastí genomu, kde se pravděpodobně nacházejí geny, jejichž produkty jsou součástí abnormální atopické reaktivity. Lze je rozdělit na několik funkčních skupin: Geny pro specifickou odpověď IgE (např. geny pro HLA) Gen pro tvorbu vysoceafinního receptoru pro IgE Geny pro hyperprodukci IgE (např. geny pro cytokiny Th2) Geny pro vyjádření klinických projevů 3.2. Vliv prostředí V embryonálním vývoji a v časných údobích života člověka převládá fyziologicky aktivita subsetu Th 2 T lymfocytů. Vyzrávání imunitního systému, které spočívá v postupném utlumování aktivity Th2 a současném zvyšování aktivity subsetu Th1, je modulováno expozicí mikrobiálním podnětům, antigenním stimulům nacházejícím se v potravě a faktory, které souvisejí se znečištěním životního prostředí. Významnou úlohu hrají vzdušné polutanty, tj. chemické a biologické látky, např. tabákový kouř, CO 2, CO, NO 2, SO 2, ozón, organické těkavé látky, formaldehyd apod., které znečišťují životní prostředí a mohou působit velmi různorodě. Mohou snižovat toleranci organismu a podporovat primární senzibilizaci, mohou podporovat procesy alergického zánětu, poškozovat slizniční povrchy, zvyšovat tvorbu IgE protilátek. Pro alergii a vznik i ovlivňování alergických onemocnění mají mnohem větší význam vlivy prostředí bytového a domovního, především proto, že v tomto prostředí tráví člověk větší část svého času

10 3.3. Vliv infekce Existují četné důkazy o rozvoji hyperreaktivity dýchacích cest pod vlivem opakovaných nebo dlouhodobě probíhajících infekcí, zvláště u dětí. Tyto infekce vyvolávají ve sliznici chronické zánětlivé změny, dochází k narušení přirozené slizniční bariéry a viry, bakterie, plísně i aeroalergeny mohou snadněji pronikat do podslizničních prostorů a vyvolávat patologické procesy. Obecně je možno říci, že virové infekce (hlavně RSV, rinoviry, viry influenzy a parainfluenzy) zvyšují riziko rozvoje alergie zvláště průduškového astmatu. Četné studie ukazují, že v oblastech s nižší životní úrovní, větším znečištěním životního prostředí a větší četností infekčních onemocnění v dětském věku mají nižší incidenci alergických onemocnění. Na základě těchto zjištění byla formulována tzv. hygienická teorie nárůstu alergických onemocnění. Je založena na hypotéze, že sterilní prostředí a snížená antigenní stimulace imunitního systému dítěte v kojeneckém období nenavodí přeladění imunitních reakcí z převahy Th2 na rovnováhu Th1-Th2, která zabraňuje rozvoji alergické aktivity. (Panzner, Špičák, 2004) 4. Imunologické základy alergické odpovědi Alergické projevy se vyznačují značnou variabilitou. Přestože úloha IgE je v této reakci klíčová, není IgE jediným ani primárním faktorem na této reakci se podílejícím. Alergické reakce mohou být zprostředkovány i jinými imunitními mechanismy, např. buněčnými, protilátkami jiných tříd, aktivací komplementového systému (Johansson a kol. 2001) Většina alergických onemocnění je vzhledem ke své patogenezi řazena mezi reakce I. typu podle Coombse a Gella, tj. mezi reakce časné přecitlivělosti

11 Fáze alergické reakce I. typu: Senzibilizace Po inhalaci alergenu dochází k jeho proniknutí k epiteliím sliznic a dále do submukózy, kde dochází ke kontaktu s tkáňovými makrofágy a granulocyty, které mají schopnost prezentovat antigen. Alergen pak proniká dále mízními cévami ke spádové uzlině. Během antigenní prezentace se naivní CD4+ T lymfocyty (tzv.th0) diferencují vlivem interleukinu 4 (IL-4) do subpopulace pomocných lymfocytů T označovaných jako Th2 buňky s produkcí specifického spektra cytokinů, např. IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13. Nejvýznamnější je opět produkce IL-4, který podporuje tvorbu IgE protilátek plazmatickými buňkami po kooperaci Th2 s B-lymfocyty. IgE protilátky se dostávají do oběhu, ale infiltrují i tkáně. Váží se svými Fc-oblastmi na vysokoafinní receptor pro IgE FcεRI na žírných buňkách a bazofilech, dochází k tzv. senzibilizaci (obr.1) Volný IgE v cirkulaci má krátký poločas - 2,5 dne, zatímco na povrchu žírných buněk zůstává zachován i mnoho týdnů.(panzner a Špičák 2004, Krejsek a Kopecký 2004). Obr. 1: Senzibilizace (Převzato z:

12 Efektorová fáze alergické reakce Setká-li se senzibilizovaná buňka opakovaně s odpovídajícím alergenem, dojde k vazbě alergenu s IgE na povrchu žírné buňky (obr. 2) a tento děj vyvolá: přemostění sousedních receptorů nesoucích IgE a aktivaci mastocytu aktivaci enzymů asociovaných s membránou krátkodobé zvýšení c-amp (cyklický adenosinmonofosfát) propojením β- adrenergních receptorů s adenylátcyklásou zvýšení nitrobuněčného Ca 2+ aktivaci fosfolipázy A, která uvolní kyselinu arachidonovou z membránových fosfolipidů fúzi membrán cytoplazmatických granul mezi sebou nebo fúzi granul a plazmatické membrány žírné buňky - nastává degranulace Při degranulaci dochází k uvolňování preformovaných, ale i nově vytvořených mediátorů do tkání (v případě bazofilů do oběhu). (Panzner a Špičák 2004, Krejsek a Kopecký 2004) Obr. 2: Efektorová fáze alergické reakce (Převzato z

13 Preformované mediátory Histamin biogenní amin, který způsobuje bronchokonstrikci a vazodilataci, zvyšuje sekreci hlenu v dýchacích cestách a zvyšuje permeabilitu stěn venul. Působí na cílové buňky přes receptor H1. Heparin, chondroitin sulfát bazické proteoglykany, stabilizují proteázy Serinové proteinázy: Tryptáza serinová endopeptidáza, inaktivuje bronchodilatační peptidy, stimuluje proliferaci fibroblastů a syntézu kolagenu, má chemotaktický účinek na eozinofily, zvyšuje expresi adhezivních molekul (např. ICAM-1) Chymáza- serinová endopeptidáza, inaktivuje bronchodilatační peptidy Kininogenáza proteáza, působí na plazmatické kininogeny a podporuje tvorbu bradykininu ( vazoaktivní účinky), důležité při alergickém zánětu.(panzner a Špičák 2004, Krejsek a Kopecký 2004) Novotvořené mediátory žírných buněk Jedná se o metabolity kys.arachidonové. Kys. arachidonová může být metabolizována cyklooxygenázou u mastocytů je konečným produktem prostaglandin PGD 2 nebo 5-lipoxygenázovou cestou cílovým produktem jsou leukotrieny LTC 4, LTD 4 a LTE 4. Také prostaglandiny a leukotrieny ovlivňují vaskulární permeabilitu a bronchokonstrikci. Dalším produktem tohoto typu je faktor aktivující destičky (PAF), chemoatraktant a aktivátor eozinofilů. Cytokiny produkované žírnými buňkami: Mastocyty produkují celou řadu cytokinů zejména patřících do spektra Th2 např. IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF. Zvlášť významná je úloha IL-5, který podporuje vyzrávání eozinofilů a jejich přežívání ve tkáni

14 Časná a pozdní fáze alergické reakce Časná fáze alergické reakce vzniká několik minut po expozici alergenem a je způsobena hlavně účinkem histaminu. V kůži způsobuje zarudnutí, exsudaci (zduření) a svědění.během této fáze dochází k chemoatrakci a aktivaci buněk, které jsou zodpovědné za fázi pozdní.pozdní fáze alergické reakce nastává 6-12 hodin po expozici alergenem a uplatňuje se účinek prostaglandinů, leukotrienů a PAF. Pozdní fáze je závislá na nahromadění zánětlivých buněk v cílové tkáni eozinofilů, bazofilů, neutrofilů a lymfocytů. Eozinofily jsou nejvýznamnějšími buňkami pozdní fáze alergické reakce. Eozinofilní granula uvolňují četné mediátory (MBP,ECP, EDN, EPO a LTC 4 ), které přispívají k poškozování epitelu, poškození neuronů, bronchokonstrikci, zvýšení sekrece hlenových žláz, vazodilataci a zvýšené cévní propustnosti. Projevem této reakce je bolestivé zduření.(panzner a Špičák 2004, Krejsek a Kopecký 2004) 5. Alergeny 5.1 Obecné zákonitosti Množství látek, vyskytujících se ve vnějším prostředí, které mají alergenní potenciál, je nesmírné. Jsou to látky původu rostlinného, živočišného, fungálního i bakteriálního. Dříve se pro diagnostické a terapeutické manipulace používaly málo definované směsi získané purifikací přírodních materiálu. Dnes již známe aminokyselinové uspořádání většiny alergenů, definujeme alergenové epitopy senzibilizující buňky T, rozšiřují se naše znalosti o zkřížené reaktivitě a tyto znalosti dovolily rozlišit hlavní a vedlejší alergeny (tab.2)

15 Tab 2. Členění alergenů podle významu Alergeny HLAVNÍ Alergeny VEDLEJŠÍ PANALERGENY reaguje na ně většina vnímavých osob (50-90%) reaguje na ně menšina vnímavých osob (<10%) alergeny různého původu s vysoce homologní strukturou Jsou povinnou součástí diagnostických i léčebných preparátů Nejsou povinnou součástí diagnostických i léčebných preparátů Zkřížená reaktivita Profiliny,tropomyosin, lipid transfer protein Převzato z: Krejsek a Kopecký 2004 Alergeny, které jsou homologické aminokyselinovým složením na více než 50%, vykazují výraznou zkříženou reaktivitu. Je-li homologie alergenu vyšší než 80%, pak hovoříme o tzv. panalergenech. (Krejsek a Kopecký 2004) Nomenklatura alergenů Definované alergeny je možno zařadit na základě nomenklatury vypracované organizací IUIS (International Union of Immunological Societies), která pracuje pod záštitou WHO. Označení alergenu začíná velkým písmenem a skládá se z prvních 3 písmen rodového jména, následuje mezera a první písmeno druhového jména a následuje číslo, tj. pořadí v jakém byl alergen izolován. (Krejsek a Kopecký 2004) Příklady označení alergenů (tab. 3) Tab. 3: Zásady nomenklatury alergenů Označení diagnostických Zdroj alergenu Označení alergenů v databázi alergenů s obsahem uvedeného alergenu Dermatophagoides pteronyssinus Der p 1 d1 Betula verrucosa Bet v 1 t3 Felis domesticus Fel d 1 e1 Převzato z: Krejsek a Kopecký

16 Při stanovování alergen-specifických imunoglobulinů zůstává velkým problémem podobně jako u alergenů používaných v in vivo diagnostice a terapii stále standardizace alergenů používaných v diagnostických testech. Běžně používané alergeny jsou připravovány extrakcí z výchozího biologického materiálu a dále jsou různým způsobem purifikovány a standardizovány. Standardizace je prováděna fyzikálně-chemicky, imunochemicky nebo biologicky. Tyto tři způsoby jsou často zaměňovány a nebo nejsou řádně specifikovány, což vede k dezinformacím a dezinterpretacím výsledků testování. (Krejsek a Kopecký 2004) 5.2 Nejvýznamnější skupiny alergenů Alergeny interiérů, bytového a domovního prostředí tvoří bohatou směs antigenů a ukázalo se, že jejich hlavní alergenovou složku představují roztoči a plísně. Roztoči jsou mikroskopičtí členovci, kteří se živí kožním odpadem lidského těla a dalším biologickým odpadem. Hlavním zdrojem roztočových alergenů v našich podmínkách je Dermatophagoides farinae a D. pteronyssinus. Další významnou skupinou jsou zvířecí alergeny. Ty mají velkou schopnost udržovat se na povrchu předmětu interiérů a na šatech osob po dlouhou dobu a kontaminují i ty nejmenší prachové částice. Způsobují alergické projevy na kůži, oční projevy, většinou celoroční alergickou rýmu a astma. Nejagresivnějšími a nejdéle přetrvávajícími v prostředí jsou alergeny slin a kožních šupin kočky. Schopnost alergizovat je menší u psa, moči hlodavců, králíka a rizikovými alergeny jsou peří a vejce ptáků. Nejčastěji zmiňovanými inhalačními alergeny jsou alergeny pylové. Pylová zrna mají charakteristickou strukturu a jsou ideálně přizpůsobené k rychlému uvolnění svého obsahu s vlhkým povrchem sliznic.v rámci celé Evropy je možno vyčlenit 6 základních skupin zahrnující nejvýznamnější pylové alergeny: Bříza + příbuzné druhy( líska,habr,olše) Trávy + obiloviny Olivovník + jasan Pelyněk + ambrozie Drnavec + kopřiva Cypřišovité

17 Pacient může trpět přecitlivělostí omezenou na pyl jednoho konkrétního druhu nebo díky imunologické zkřížené reaktivitě na více strukturálně blízkých alergenů. Vedle těchto typů zkřížených reakcí existují zkřížené reakce způsobené panalergeny, jako např. profiliny, které jsou přítomny ve všech eukaryotních buňkách. Plísňové alergeny se vyskytují jak ve venkovním prostředí( rod Alternaria, Cladosporium - sezónně), tak v domácím prostředí (rod Aspergillus, Penicillium - celoročně) a nejlépe v teplém prostředí s vysokou vlhkostí. Hlavními potravinovými alergeny jsou proteiny jak rostlinného původu (tepelným zpracování dochází většinou k denaturaci a ztrátě alergenicity) tak živočišného původu (některé jsou agresivní i po zahřátí nad 60 C mléko, vejce, ryby). Nejvýznamnější jsou alergeny kravského mléka, vajec, ryb, korýšů, masa, obilnin, ořechů, ovoce, zeleniny, kakaa a čokolády. Jako alergeny se dále uplatňují i potravinová aditiva (barviva, konzervační látky, kontaminanty.) a léky (kys. acetylsalicylová, anestetika, penicilin,myorelaxancia). Alergeny pracovního prostředí (plastické hmoty, syntetická a přírodní vlákna, latex...) Alergeny jedu blanokřídlého hmyzu tvoří enzymy fosfolipáza A2, hyaluronidáza, melittin a kyselá fosfatáza. Alergické reakce na hmyzí jedy mohou být systémové a mít velmi závažný až život ohrožující průběh. Jedinou účinnou léčbou je správně vedená imunoterapie. Pro indikaci imunoterapie je nezbytné co nejpřesnější stanovení diagnózy. (Panzner a Špičák, 2004) 5.3. Rekombinantní alergeny Dnes již známe aminokyselinové uspořádání jednotlivých alergenů, definujeme alergenové epitopy senzibilizující buňky T, rozšiřují se naše znalosti o imunologické zkřížené reaktivitě mezi alergeny a konečně mnoho alergenů umíme připravit uměle jako tzv. alergeny rekombinantní. (Blumenthal, 1999) Rekombinantní technologie umožnily produkci alergenů v absolutně čisté podobě, které jsou využívány k diagnostickým a terapeutickým účelům. (Hamilton, Adkinson, 2004) Tato úzká monospecifičnost se však ukazuje jako problém. V praxi je většinou nemocný senzibilizován k mnoha hlavním i vedlejším alergenům dané alergenní substance současně. Pravděpodobně tedy alergenová vakcína připravená na základě rekombinantních alergenů bude muset být komplexní směsí mnoha rekombinantních

18 alergenů v určitém poměru, který bude dán pravděpodobně víceméně individuálně. Předpokladem pro takový postup budou tedy i daleko selektivnější diagnostické metody (zejména kožní testy a stanovení specifických IgE-protilátek), které budou založeny rovněž na rekombinantních alergenech a budou schopny detekovat stupeň senzibilizace k jednotlivým hlavním a vedlejším alergenům samostatně. (Panzner, Špičák, 2004) 6. Diagnostika alergií K tomu, aby bylo onemocnění správně označeno a zařazeno mezi alergické choroby, musí být provedeno kvalitní alergologické vyšetření. To se skládá z několika součástí: z anamnézy, fyzikálního klinického vyšetření, kožní testace, laboratorních vyšetření a podle potřeby i testů provokačních, expozičních nebo epikutánních. (Panzner, Špičák, 2004) In vitro diagnostika v alergologii má jen vymezené místo a laboratorní metody patří mezi vyšetřovací metody první volby alergologa jen v omezeném množství případů Pokud je to možné, jsou v alergologické diagnostice při hledání alergenu, který u pacienta vyvolává alergickou reakci, upřednostňovány kožní testy.(lochman a kol., 2004) 6.1 Testy in vivo Kožní testy Kůže je vhodným orgánem k testování, neboť obsahuje všechny elementy, nezbytné k rozvoji místní kontrolované alergické reakce, i když choroba postihuje jiný orgán. Prick-test deponuje do dermis v jediném bodě nepatrné množství alergenu schopného reagovat s protilátkami IgE navázanými na kožní mastocyty a vyvolat tak uvolnění mediátorů, což vede ke vzniku kopřivkového pupenu s erytémovým lemem. V praxi na odmaštěnou pokožku předloktí naneseme kapku alergenového extraktu a hrotem lancety provedeme vpich do vrchní vrstvy epidermis. Intradermální test prokazuje imunitní odpověď zprostředkovanou IgE, IgG nebo efektorovými lymfocyty T. V praxi inzulinovou stříkačkou aplikujeme intradermálně 0,05 ml alergenu tak, aby vznikl pupen o průměru cca 3 mm

19 Hodnocení kožních testů se provádí za 15 minut po aplikaci, výsledek je vyjádřen jako průměr pupenu/erytemu v mm. Jakékoliv spektrum testovaných alergenů musí obsahovat negativní kontrolu (většinou fyziologický roztok) a pozitivní kontrolu (většinou histamin ředěný 1:1000). Nevýhodou kožních testů je nutnost přerušit podávání inhibičních léků antihistaminika, kortikoidy atd dní (podle druhu léků) před jeho provedením. Počet testovaných látek (alergenů) by neměl překročit (Panzner a Špičák 2004, Krejsek a Kopecký 2004) Epikutánní testy slouží k průkazu buněčné přecitlivělosti. Provádí se na kůži zad aplikaci testované látky formou náplastí. Výsledek se hodnotí za hodin. Není vhodné provádět testy v době přirozené expozice alergenu. (Krejsek a Kopecký,2004) 6.2. Laboratorní diagnostika Laboratorní testy používané v diagnostice alergií můžeme rozdělit na buněčné a humorální (tab. 4). V praxi výrazně převažuje využívání testů humorálních a mezi nimi především stanovování celkového a spec. IgE. Přitom zvláště u chronických alergií a při posuzování úspěšnosti alergenové imunoterapie jsou stále častěji doporučovány a budou se jistě stále více uplatňovat testy stanovující také celkové IgG. Komerční nabídka diagnostik pro stanovování alergen-specifických IgG je však zatím nesrovnatelně užší než pro stanovování alergen-specifických IgE. Zdá se ale, že stanovování spec. IgG začne postupně nacházet uplatnění především při monitorování alergen-specifické imunoterapie (ASIT). Přínos stanovování koncentrace alergenspecifických protilátek v podtřídě IgG4, které bývá využíváno především pro monitorování poměru Th 2 a Th 1 odpovědi u některých typů alergií, nebyl zatím jednoznačně prokázán, a proto bývá využíván jen zřídka

20 Tab. 4 : Přehled laboratorních testů využívaných v diagnostice alergií 1.Testy prováděné ze séra nebo plazmy vyšetřovaného jedince stanovení celkového IgE stanovení alergen- specifických imunoglobulinů ( IgE, IgG,IgG4) stanovení ECP, tryptázy aj. mediátorů alergického zánětu 2. Buněčné testy využívající bazofilů vyšetřovaného jedince Bazotesty ( exprese aktivačních znaků CD63 nebo CD203c) Testy měřící uvolňování histaminu z alergen- stimulovaných bazofilů Testy měřící uvolňování leukotrienů z alergen-stimulovaných bazofilů 3. Degranulační testy využívající zoogenní nebo xenogenní bazofily nebo žírné buňky 4. Testy na měření Th1 a Th2 odpovědi leukocytů testovaného jedince po stimulaci alergenem stanovení aktivace mrna pro vybrané vytokány po stimulaci leukocytů testovaného jedince alergenem stanovení vybraných cytokinů charakteristických pro Th1 (např.ifnγ, IL12, TNFα) a Th2 (např. IL4, IL5, IL10, IL13) odpověď po stimulaci leukocytů testovaného jedince alergenem Převzato z: Lochman, Kopřiva a kol Sérologická diagnostika Imunoglobulin IgE Molekula imunoglobulinu třídy E má stejnou základní strukturu jako molekuly ostatních imunoglobulinových tříd. Těžký řetězec obsahuje čtyři domény konstantní a jednu variabilní. Lehké řetězce jsou tvořeny jednou konstantní doménou C s jednou variablilní doménou V. Řetězce imunoglobulinových molekul jsou glykosylovány. V porovnání s jinými třídami imunoglobulinů se IgE vyskytuje v krvi ve velmi nízkých koncentracích a jeho poločas rozpadu je krátký, zhruba 2 3 dny.(ishizaka a kol.,1966)

21 Koncentrace IgE u lidí se liší nejen podle věku a pohlaví, ale i v jednotlivých rodinách. (Šedivá, 2004) IgE se vyskytuje také jako transmembránový protein ve formě klasického receptoru pro antigen na povrchu B lymfocytů.(lochmanová,2008) Kromě pacientů s alergií, resp. atopií, jsou zvýšené koncentrace sérového IgE nalézány rovněž u pacientů s hyper-ige syndromem, parazitárními infekcemi, u některých imunodeficiencí spojených s T lymfocyty, během akutní rejekční reakce štěpu proti hostiteli a u některých autoimunitních onemocnění.(aalberse, 2000) Mnoho studií potvrdilo, že celková koncentrace imunoglobulinu E (IgE) úzce koreluje s přítomností alergického onemocnění u vyšetřovaného jedince, ať jde o dospělého člověka, nebo o dítě. Specifita tohoto ukazatele je téměř 90%, ale senzitivita pouze 30-40%. U dospělých bývá obvykle hranice fyziologických hodnot IgE IU/ml, u dětí je závislá na věku. Jak je patrno z uvedené nízké senzitivity tohoto vyšetření, řada alergiků (60-70%) naopak hladiny IgE v séru nemusí mít zvýšeny. Normální celková koncentrace IgE nevylučuje přítomnost alergické choroby. Určujeme hladinu protilátek v séru a protilátky navázané ve tkáních tomuto měření unikají. I při normální hladině IgE mohou být zvýšeny některé specifické protilátky IgE, a to i dost podstatně.(bartůňková, Paulík, 2005) Celkové IgE stanovujeme nejčastěji imunoturbidimetricky, imunonefelometricky a enzymoimunoanalytickými technikami, mezi něž patří i CAP systémem Specifické IgE K vyvolání atopické odpovědi na expozici alergenu jsou funkčně významné protilátky IgE vázané na buňkách a nikoli protilátky cirkulující, a proto by k posouzení atopické reaktivity bylo významnější stanovování množství IgE vázaného na vysokoafinitních receptorech žírných buněk a bazofilů. (Stites,Terr 1994). To je dnes možné v laboratoři provádět v širší míře jen nepřímo pomocí buněčných testů (viz. kap. 6.4). Základní a nejpoužívanější metodou v laboratorní diagnostice stavů časné přecitlivělosti (alergické reakce I. typu) je dnes stanovování alergen-specifických IgE (sp.ige). Při stanovování sp. IgE je nutno mít na paměti, že alergeny jsou většinou antigeny proteinové povahy. Tak jako na každé proteinové antigeny i na alergeny je po jejich delším intenzivnějším působení v organismu vytvářena protilátková odpověď ve

22 třídě IgG, především pak v podtřídách IgG1 a IgG4. Platí to i pro atopiky, kteří mají tendenci odpovídat alespoň na některé antigenní podněty ve zvýšené míře ve třídě IgE. Protilátky ve třídě IgG a u potravinových alergenů i ve třídě IgA, jsou však produkovány v mnohem vyšších koncentracích než protilátky ve třídě IgE a mohou vážně interferovat při jejich stanovování (tab.5 ). Proto by měly být pro stanovování alergen-specifických IgE preferovány tzv. capture techniky, u nichž je na imunosorbent v prvním kroku vyvazováno veškeré IgE z analyzovaného vzorku a v dalších krocích tak eliminován vliv imunoglobulinů v ostatních Ig třídách. Ve standardních imunosorpčních technikách je však alergen vázán přímo na imunosorpční povrch a po přidání vzorku o něj soutěží imunoglobuliny všech tříd. Mezi standardními imunosorpčními technikami tak mají logicky výhodu ty techniky, které dokážou na sorbent navázat co největší množství alergenu. V tomto směru dominuje z komerčně dostupných diagnostických systémů CAP systém firmy Pharmacia. (Lochman a kol., 2003, Yman 1990) Tab. 5 : Vazebné a koncentrační poměry metod pro stanovení spec. IgE Pevná fáze Vazebná kapacita pro antigen* (pmol) Množství aplikovaného Ig** (pmol) medián a rozsah Poměr koncentrací lge/lgg** medián a rozsah Bežný plast upr. Papírový disk CAP ,016 <0,002-9,1 19, , , ,295 *Uvedeno podle údajů v práci Yman, 1990 pro IgG jako antigen, **Uvedeno podle naměřených dat v práci (Lochman a kol., 2003). Předpokládá se, že do reakce je aplikováno 50 μl vzorku

23 RAST (Radioalergosorbent test) Prototypem imunosorpčních testů v diagnostice alergen-specifických IgE je RAST, který byl vyvinut Widem a kol. v roce Princip: Alergen je navázán kovalentní vazbou na nitrocelulózovou pevnou fázi, kterou bývá papírový disk. Tento disk je inkubován s vyšetřovaným sérem, přičemž dochází k vazbě specifického IgE ze séra na disk. Po promytí disku je provedena druhá inkubace s protilátkou proti IgE, která je značena izotopem jodu 125. Intenzita navázané radioaktivity je pak přímo úměrná množství specifického IgE ve vyšetřovaném vzorku.(lochmanová, 2008) Během posledních let došlo k výraznému rozvoji různých technik, zejména takových, které jsou založeny na neizotopovém značení sekundární protilátky. Jde například o RAST Phadezym, FAST (fluorescenční alergosorpční test), MAST-CLA (chemiluminiscence), AlaSTAT (kolorimetrická detekce), CAP a další. U těchto technik jsou používány různé pevné fáze k navázání alergenů, různé alergeny, různé enzymy k označení protilátek proti IgE, různé substráty a z toho vyplývající různé systémy detekce výsledného signálu. Rovněž jsou používány různé systémy standard pro kalibraci. Z toho vyplývá, že každá technika má svá vlastní kritéria pro hodnocení. Jak již bylo řečeno, první používanou pevnou fází byla nitrocelulóza. Vazba na antigen je stabilní, ale má i své nevýhody. Jednak může dojít k zamaskování některých epitopů antigenu a jednak dochází k nespecifické vazbě IgE na nitrocelulózu v případě, že koncentrace celkového IgE jsou vysoké. Všechny metody, které jsou dnes používány pro stanovování sp.ige by měly splňovat alespoň kritérium citlivosti, tzn. že musí detekovat koncentrace vyšší než 0.35 IU/ml a měly být schopny stanovovat tento analyt minimálně s přesností na jednotlivé třídy RAST (tab.6). (Hamilton 2001, Kopecký a Krejsek 2004, Lochmanová 2008, Panzner a Špičák 2004)

24 Tab.6: RAST třídy-hodnocení koncentrace standard sp.ige standardy IU/ml <0,35 0,35-0,7 0,7-3,5 3,5-17,5 17, >100 RAST Hodnoc. Negativní Hraniční Převzato Dynex, 2010 Slabě pozitivní Pozitivní Silně pozitivní Velmi silně pozitivní Velmi silně pozitivní CAP Za zlatý standard je mezi ELISA technikami na pevné fázi označována metoda vyvinutá firmou Pharmacia známá jako CAP System TM, resp. UniCAP TM, která využívá fluorescenční detekce enzymatické reakce (obr.3). Oproti všem ostatním metodám má výhodu ve vysoce kapacitním vazebném sorbentu vnitřního povrchu speciálních kalíšků (caps), na něž jsou alergeny navázány a ve kterých reakce probíhá. Vnitřní povrchy těchto kalíšků umožňují navázat na jednotku plochy minimálně 3-krát více alergenu než aktivované papírové disky nebo až 50-krát více než běžné plasty používané ostatními výrobci. (Lochman a kol., 2003) Obr. 3: Princip metody CAP Převzato z :

25 RISA (Ring ImmunoSorbent Assay) RISA je metoda využívající papírové disky s navázanými alergeny, které mají uprostřed disku otvor. To umožňuje, aby celá enzymová imunoanalýza proběhla v jamce mikrotitrační destičky bez potřeby manipulace s pevným diskem. Výsledný barevný roztok se proměřuje otvorem ve středu kroužku (ring), na kterém je navázán příslušný alergen. Výrobcem tohoto testu je Doverton Ltd., Dublin, Irsko, dodavatelem soupravy v ČR je Dynex, spol. s. r. o. Princip metody je znázorněn na (obr. 4) Základem metodiky je vazba specifických protilátek IgE obsažených v séru pacienta na purifikovaný alergen. Alergen je imobilizován na pevný nosič, nitrocelulózový disk, který se vkládá do prázdné jamky mikrotitrační destičky s plochým dnem. V prvním kroku je do jamky s diskem s navázaným alergenem aplikováno sérum pacienta. Ve druhém kroku jsou použity enzymově značené protilátky proti lidským IgE protilátkám, které následně katalyzují barevnou enzymatickou reakci. Intenzita vzniklého zabarvení je měřena fotometricky a je úměrná množství alergenspecifického IgE ve vzorku.(dynex 2010, Lochmanová 2008, Krejsek a Kopecký 2004) Výhodou této metodiky je její nenáročnost na přístrojové vybavení, není nutnost vést dané disky s alergeny skladem, poněvadž firma Dynex připravuje destičky s disky podle individuálních požadavků laboratoří. Nevýhodou zde může být interference vysokých hodnot IgG, která může způsobit falešnou negativitu výsledku. Obr. 4: Princip RISA Převzato z: laboratorni diagnostika.pps

26 Kapalné alergeny Určitou výhodu mohou v diagnistice sp.ige představovat metody používající alergeny v kapalné fázi. U těchto metod nedochází k možné eliminaci diagnosticky důležitých epitopů alergenů v důsledku jejich vazby na pevný imunosorbent a způsobovat tak falešně negativní reakce, nebo naopak k expresi falešných epitopů, které u nativních alergenů nejsou přítomny a mohou způsobovat falešně pozitivní reakce. Princip těchto reakcí je prakticky shodný s klasickou RAST metodou (str.21), kde místo izotopu I 125 je pro značení alergenu použit enzym nebo jiná molekula, nejčastěji biotin. Je-li použit biotin, je pak využíván systém biotin- streptavidin a celé reakční schéma se prodlužuje o jeden krok. Metody využívající kapalné alergeny jsou také jednodušší pro zpracování pomocí automatických analyzátorů. Jako příklady takovýchto metod lze uvést systémy Adaltis, AlaSTAT a Immulite. Kompetitivní inhibici detekce sp.ige specifickými IgG protilátkami mohou částečně odstranit capture metody, Tyto metody jsou však v diagnostice sp.ige kupodivu využívány jen zřídka. Příkladem takovéto metody může být metoda C.A.R.L.A firma RADIM (obr.5). Obr.5: Schémata použitých ELISA technik (převzato z: Lochman a kol.,2004)

27 Multiplexové techniky Multiplexová metody jsou metody umožňující stanovit několik analytů v jedné reakční nádobce nebo na jedné reakční ploše najednou. Pro diagnostiku sp.ige jsou využívány dva postupy: 1. ALBIA 2. Line/dot immunoblot assays Ad1) ALBIA (Adderessable Laser Bead Immunoassays) jsou zatím v Evropě nedostupné. Dovolují v jedné reakční nádobce volit uživateli různé kombinace alergenů a sestavovat tak specifické, pro pacienta individuální, kombinace alergenů jak co do složení, tak i co do počtu v jednom panelu. V praxi je však tato technika využívající MAPx technologii firmy Luminex Corp. dostupná zatím jen v USA, a to jen pro velmi omezený počet alergenů. Teoreticky je možno touto technikou a technologií v jedné reakční jamce z objemu 50 μl vzorku stanovit sp.ige až proti 100 alergenům. (Macečková a kol., 2009) Ad2) Pro diagnostiku sp.ige jsou u nás z multipexových metod dostupné imunoblotovací techniky. Ty dovolují stanovit z jednoho vyšetřovaného vzorku séra spec.ige většinou maximálně proti 20 různým alergenům. Výběr alergenů na proužku je dán výrobcem.( tab. 7, obr.6 )

28 Tab.7: Imunoblotové techniky pro stanovení spec.ige dostupné v ČR Převzato z: Macečková a kol., 2009 Obr.6: Ukázka inhalačního panelu EuroLine firmy Euroimmun Novou multiplexovou metodou pro stanovení spec.ige na pomezí multiplexu a mikrochipu je systém ISAC firmy Phadia (Immuno Solid spec.ige FX23 <0,35 IU/ml ( RAST 0 ) phase Alergen Chip). Dovoluje stanovit v jednom vzorku sp.ige proti více než 150 alergenním komponentám, zatím ze 40 alergenních zdrojů. Použity jsou rekombinantní nebo vysoce purifikované alergenní komponenty. Spotřeba séra na jeden panel je 20 μl a i cena na jednu specifitu není vysoká. Pohybuje se mezi Kč

29 Dostupné jsou zatím však jen dva panely a cena jednoho panelu je kolem 4000 Kč. Otázkou je, zda nabízený počet a nabízené spektrum specifit, které jsou zatím dostupné, je pro běžnou diagnostiku a širokou aplikaci efektivní ( Lochman a kol., 2008) Multiplexové metody mají výhodu oproti klasickým jednoanalytovým metodám především tehdy, potřebujeme-li ve vzorku stanovit protilátkové specificity proti více než třem alergenům. Musí přitom samozřejmě svou kvalitou a citlivostí splňovat kritéria kladená na klasické jednoanalytové metody. Nevýhodou imunoblotovacích technik je skutečnost, že složení alergenů v jednotlivých panelech je dané a nemůže být voleno individuálně podle vyšetřovaného pacienta. Metody ALBIA, které by tento nedostatek mohly vyřešit, jsou však zatím pro rutinní diagnostiku nedostupné (Lochman, 2009) Specifické IgG Třídu protilátek IgG je možné na základě jemných rozdílů ve struktuře těžkého řetězce rozdělit na čtyři podtřídy. Rozdíly ve složení a flexibilitě konstantní části molekul podtříd imunoglobulinu IgG podmiňují i jejich odlišné imunobiologické vlastnosti. Úloha IgG při alergických reakcích časného typu není stále zcela jasná. Stanovení specifického IgG využíváme pro jiné typy přecitlivělosti než zprostředkované IgE, jako reakce na očkování při potravinových intolerancích. Metodami stanovení alergen-specifických IgG jsou různé ELISA a CAP. Naměřené koncentrace alergen specifických IgG, ať již celkových nebo IgG1 či IgG4 jsou vyjadřovány v mg /ml. Zvláštní postavení mezi podtřídami zaujímá podtřída IgG4. Hladina podtřídy IgG4 je v porovnání s hladinou jiných podtříd IgG zanedbatelná. Dokázána je významná úloha imunoglobulinů podtřídy IgG4 v atopické reaktivitě. Jejich hladina několikanásobně vzrůstá u nemocných, kteří byli léčeni imunoterapií alergenem. Má se za prokázané, že protilátky specifické pro alergen v podtřídě IgG4 vyvazují alergeny. Nejsou však přitom vázány na receptory žírných buněk a nemohou tedy spustit jejich degranulaci. IgG4 jsou tzv. blokující protilátky kompetují o vazbu na alergen se specifickým IgE a neaktivují při tom komplementový systém

30 Má se za to, že stanovování IgG4 je vhodné především pro sledování účinku specifické imunoterapie, kde je očekáván vzestup jejich koncentrace. Metody stanovení jsou shodné jako u specifického IgE, nejčastěji používané techniky jsou CAP a EAST (enzymové alergen-sorpční testy). (Krejsek a Kopecký 2004, Panzner a Špičák 2004) Stanovení mediátorů alergické reakce Stanovování biologicky aktivních látek typu histaminu, tryptázy, eosinofilního katonického proteinu (ECP), interleukinů a dalších v periferní krvi má v praxi jen omezený význam. Většina z těchto látek se totiž chová jako lokální hormony, tzn., že jsou z tělních tekutin se vzrůstající vzdáleností od místa produkce velmi rychle odstraňovány nebo je alespoň eliminována jejich aktivita. Jejich zvýšené koncentrace v celém organismu by mohly způsobit výrazné porušení homeostázy, které by mohlo vést až k jeho zhroucení. Výjimku tvoří tryptáza, která je významným markerem aktivace žírných buněk (ne bazofilů), která se sice v krvi objevuje ve zvýšené koncentraci až mezi min. po stimulaci organismu alergenem, ale přetrvává v krvi výrazně déle než histamin, je stabilní a může být použita k monitorování anafylaktické reakce i několik hodin po interakci s alergenem, dokonce i post mortem. (Kopřiva, 2003) Stanovení histaminu v séru nebo v plasmě nemá pro posuzování alergií praktický význam, neboť histamin je z tělních tekutin velmi rychle eliminován. 6.4 Biologické buněčné testy Jako biologické testy jsou označovány in vitro testy, při kterých je sledována biologická odezva buněk pacienta stimulovaných potenciálním alergenem. Odezva na příslušnou stimulaci může proběhnout formou buněčné proliferace, sekrece solubilních produktů nebo expresí aktivačních znaků. Biologické buněčné testy patří mezi specializovaná vyšetření, která si teprve hledají v diagnostice alergií své místo. Výsledky biologických testů nemusí vždy korespondovat s výsledky stanovení spec. IgE a obecně by měly poskytovat užší korelaci se skutečným in vivo stavem vyšetřovaného pacienta. Jedná se však o testy

31 zatížené značnou biologickou variabilitou s omezenou možností jejich validace a standardizace. (Lochmanová, 2008) Bazotesty Zvýšená buněčná aktivita je zpravidla doprovázená zvýšenou expresí určitých buněčných znaků nebo se exprimují znaky nové. Sledování exprese těchto znaků se provádí nejčastěji metodou průtokové cytometrie. Populace bazofilů je zpravidla definována pomoci monoklonální protilátky (MP) anti-ige, která se váže k vysoce afinitnímu FcεRI receptoru přítomnému na povrchu bazofilů. V současné době se objevily monoklonální protilátky proti dalším povrchovým antigenům bazofilů, umožňující definici této populace na technicky vyspělejší a specifičtější úrovni. Jedná se o MP proti antigenu CD203c, který je v současné době charakterizován jako znak s jedinečnou specifikou pro bazofily. Dalším povrchovým antigenem využívaným k identifikaci bazofilů je CD123 receptor pro IL3 (anti IL3Rα). Jedním z prvních (poprvé publikován v roce 1991) a technicky nejdostupnějších testů, který se už pomalu dostává do rutinní praxe a je řazen mezi tzv. zlaté standardy v oblasti biologických testů pro sledování alergií, je test zaměřený na stanovení funkční aktivity basofilů měřené pomocí exprese aktivačních znaků, tzv. bazofil aktivační test (BAT). Znakem buněčné aktivace a degranulace je molekula CD63, označovaná dříve jako gp53. V klidových bazofilech je molekula CD63 uložena především v intracytoplazmatických granulích a teprve po expozici příslušnému alergenu dochází u alergických osob k fúzi cytoplazmatických granul s plazmatickou membránou a translokaci CD63 na povrch bazofilu.(lochmanová A., 2008) V rutinní diagnostice je možno k průkazu exprese aktivačního znaku CD63 využít metodu průtokové cytometrie a komerční soupravy Basotest firmy Orpegen nebo FAST resp. Flow-CAST R firmy Bühlmann. Princip Bazotestu: Plná krev (event. suspenze leukocytů) je inkubována s alergenem. Současně je inkubována tzv. negativní kontrola, kde místo alergenu je přidán pouze ředicí roztok a pozitivní kontrola, kdy je přidána látka způsobující aktivaci co největšího počtu bazofilů (kultivace s anti-ige protilátkou nebo N-formyl-methionyl-leucylphenylalaninem tzv. FMLP). Po inkubaci s alergenem jsou vzorek, negativní i pozitivní kontrola smíchány se dvěma protilátkami, protilátkou označující bazofily (anti-ige nebo

32 anti-cd 203) a protilátkou vázající se na aktivované bazofily (anti-cd 63). Po inkubaci je provedena lýza erytrocytů. Měření je prováděno pomocí průtokového cytometru. Bazofily jsou gatovány na základě bočního rozptylu (side scatter) a specifického značení bazofilů (SS/anti-IgE nebo SS/CD203c) Na takto vybraných bazofilech je měřena exprese aktivačního znaku CD63. Výsledkem je procento aktivovaných bazofilů tj. anti-ige+/cd63+ nebo CD203c+/CD63+ v závislosti na typu použitých protilátek (obr. 7). Obr.7: Exprese aktivačních znaků CD63 na basofilech pacienta Negativní výsledek stimulace buněk alergeny vaječného bílku 3,7% CD203c/CD63+ Pozitivní výsledek - stimulace buněk alergeny pšeničné mouky 96,4% CD203c/CD63+ Optimalizace metody aktivace bazofilů pomocí průtokové cytometrie zahrnuje zejména tato doporučení: V rutinní praxi se lépe osvědčilo provádět vyšetření z plné krve. Jako protisrážlivé činidlo je nejvhodnější použít heparin, většinou je doporučován lithium heparin. Na jeden alergen je třeba 100 ml plné krve. Vyšetření je možno provádět i ze separovaných buněk. V tomto případě ale může docházet k nespecifické aktivaci buněk. Mimo to je tento postup náročný na množství odebraného materiálu (10 i 15 ml krve). K optimalizaci aktivace je vhodná preinkubace s IL-3, který pomáhá stimulovat bazofily

33 Stimulace je prováděna vodnými roztoky alergenů. Mělo by se využívat standardizovaných alergenů, pokud jsou k dispozici. Pro každý alergen resp. směs alergenů je třeba stanovit optimální koncentraci. Vzhledem k tomu, že IgE-zprostředkovaná aktivace bazofilů probíhá relativně rychle, doporučuje se poměrně krátká doba inkubace (15 30 min.). Bazofily jsou nejčastěji značeny protilátkou proti IgE. Toto značení používají i komerčně dostupné soupravy (Flow-Cast, fy Bühlmann a Basotest fy Orpegen). V poslední době se využívá značení monoklonální protilátkou specifickou pro bazofily (CD203c). Aktivací se ve většině případů zvyšuje exprese tohoto znaku a buňky jsou zřetelně odlišitelné. Doporučuje se hodnotit nejméně 500 buněk (minimálně 300). Klinický význam: Indikaci vyšetření Bazotestem (BAT) s inhalačními alergeny lze předpokládat spíše výjimečně, význam má toto vyšetření v situacích, kdy kožní testy není možno provést a je diskrepance mezi klinickým obrazem a výsledkem stanovení spec.ige, nebo v případech, kdy sice kožní testy byly provedeny, ale s nejasným nálezem a i vyšetření spec.ige nepřineslo objasnění příčiny alergie. U potravinové alergie, alergie na latex a hmyzí jedy je situace odlišná. Existují sice jak možnosti kožních testů s potravinovými alergeny, tak stanovení sige. Obě tato vyšetření však vykazují poměrně často zejména falešně negativní nálezy, ale ani falešně pozitivní nálezy nejsou výjimkou. Velmi nadějným se jeví využití BAT u lékových alergií. I zde je nutno si uvědomit, že toto vyšetření může detekovat pouze alergickou reakci časného typu. Tyto reakce na léky nejsou tak časté jako reakce zprostředkované jinými mechanismy, patří však k nejzávažnějším.(havranová,honzová, 2009) Uvolnění mediátorů po expozici alergenem Následující testy jsou v současné době určeny spíše pro výzkumné účely. Jejich rutinnímu využití brání poměrně vysoká cena a nároky na vybavení laboratoře. Rovněž senzitivita a specifita těchto testů může být v určitých situacích problematická. Perspektivně by testy detekující uvolnění mediátorů mohly najít uplatnění i v oblastech,

34 kde reakce nejsou zprostředkovány IgE mechanismem (některé léky, potraviny) (Panzner, 2006). Test uvolnění histaminu Test uvolnění histaminu je založen na kvantifikaci histaminu uvolněného z bazofilů po inkubaci s alergenem. Metoda se provádí kultivací plné, heparinizované krve v příslušném kultivačním médiu a princip stanovení uvolněného histaminu v tkáňovém supernatantu využívá kompetice mezi známým množstvím značeného histaminu a neznačeným histaminem přítomným ve vzorku o vazbu na limitované množství příslušné protilátky. Kvantifikace histaminu se dnes provádí prakticky pouze ELISA nebo RIA technikou s využitím monoklonální protilátky proti histaminu. Tento test má však jistá omezení vzhledem k poměrně vysokému spontánnímu uvolňování histaminu z leukocytů. Diagnostický přínos byl zaznamenán zejména u potravinových alergií. U jedinců s funkčním útlumem imunitního systému, tzv. non-responders je tento test neprůkazný. (Lochmanová, 2008) Test produkce sulfidoleukotrienů (CAST - Cellular Antigen Stimulation Test) Metoda stanovení: kultivace + ELISA, výrobce Bűhlmann Princip: Izolované periferní leukocyty stimulované IL-3 a alergenem uvolňují sulfidoleukotrieny (LT), které se stanoví ELISA metodou s využitím monoklonální protilátky proti společné determinantě leukotrienů (LTC4, LTD4, LTE4). Jedná se o kompetitivní ELISA metodu pomocí enzymového konjugátu s alkalickou fosfatázou a substrátem p-nitrofenyl fosfátem. Měření probíhá kolorimetricky při 405 nm a hladinu LT ve vzorku lze stanovit odečtením z kalibrační křivky. Indikace: - není možné provést jiné testy nebo je diskrepance mezi nimi vhodné pro diagnostiku latexové alergie a potravinových alergií test má vysokou sensitivitu pro diagnostiku polékových alergií a reakcí, zvláště na betalaktamová antibiotika, myorelaxancia, analgetika, acylpyrin a další Výsledek je vyjádřen jako koncentrace mediátorů (slt) v pg/ml

35 6.4.3 Test degranulace krysích žírných buněk Jedná se o jeden z prvních funkčních testů k průkazu reakce okamžité přecitlivělosti publikovaný Shelleym v roce Princip spočívá v pasivní senzibilizaci krysích žírných buněk sérem pacienta s předpokládanou přítomností spec. IgE protilátek. Přidání monospecifického králičího antiséra proti lidskému IgE nebo alergenu vede v pozitivním případě k degranulaci žírných buněk, která se hodnotí mikroskopicky. Tento test byl využíván k testování okamžité přecitlivělosti zejména v 60.letech, dnes se již nepoužívá.(lochmanová, 2008) Testy na měření Th1 a Th2 odpovědi po stimulaci alergenem Cytokiny se uplatňují na všech stupních rozvoje alergické odpovědi od prvního setkání s alergenem, během procesu senzibilizace a významně se podílejí i na rozvoji samotné alergické reakce. Jedná se o cytokiny, které zasahují do maturace krevních buněk IL3, cytokiny produkované Th2 lymfocyty IL-4, IL-5, IL-13 a cytokiny produkované buňkami prezentujícími antigen jako IL-1, IFN-γ, IL-12, IL-18 a IL-8. Z posledně jmenovaných má klíčové postavení IL-12, regulační cytokin(diferenciační faktor směrem k Th1 cestě), působící na počátku kaskády imunologických pochodů, který může ovlivnit Th1/Th2 polarizaci. Nedostatečná stimulace přirozené imunity bakteriálními produkty vede ke snížené produkci IL-12 a IFN-γ a přesmyku k TH2 typu buněčné odpovědi. Ukázalo se, že mononukleární leukocyty alergických pacientů produkují menší množství IL-12 a IL-18 než tytéž buňky zdravých osob a důvodem by mohla být zvýšená exprese receptoru pro IL-4 na monocytech, která vzniká v důsledku zvýšené produkce IL-4 a IL-13 v rámci Th2 buněčné odpovědi. Významnou roli dále hraje IL-10, regulační cytokin, který je produkován subpopulací lymfocytů, kterým se přisuzuje regulační funkce Treg. Pro tyto buňky je charakteristická také tvorba TGFβ. Jsou důležité pro udržení Th1 a Th2 rovnováhy, prevenci alergických onemocnění a uplatňují se i v indukci tolerance k alergenům navozené alergenovou imunoterapií především v důsledku zvýšené produkce IL-10. Vzhledem k tomu, že Th2 buňky jsou označované jako protizánětlivé, nabízí se otázka, jak se mohou podílet na rozvoji alergického zánětu. Ukázalo se, že existuje další typ TH2 buněk, vyznačující se produkcí IL-4, IL-5, IL-13, velkým množstvím TNFα, ale minimální produkcí IL

36 Tato populace vzniká pod vlivem nově popsaného thymus stromálnímu lymphopoetinu (TSLP) a což je zřejmě klíčový cytokin TH2 buněčné diferenciace. Tato subpopulace je označovaná jako zánětlivá, resp. inflamation ith2. Naproti tomu Th2 populace produkující IL-4, IL-5, IL-13 a taky IL-10 je označována jako konvenční cth2 a uplatňuje se u parazitárních nákaz, ale ne u alergií. ( Lochmanová, 2008) Detekci cytokinů lze v současné době provádět: Metodou ELISA v séru, plazmě nebo tkáňových supernatantech Molekulárně genetickými metodami, které pracují na principu průkazu mrna cytokinů ve stimulovaných buňkách metodou PCR Metodou průtokové cytometrie, která slouží k intracytoplazmatickému průkazu tvorby cytokinů Metodou ELISPOT ( Enzyme Linked ImmunoSPOT) ( Lochmanová, 2008) 7. Srovnání metod pro diagnostiku alergií 7.1.Srovnání laboratorních testů v dg. alergií provedená na odd. imunologie a alergologie CKL ZÚ Ostrava V laboratořích oddělení imunologie a alergologie je stanovováno celkové IgE metodou CAP, alternativně i nefelometricky na nefelometru BN II. Obě metody spolu dobře korelují. Pro diagnostiku alergen-specifických IgE je používána metoda RISA, CAP a od loňského roku také multiplexová metoda Optigen. CAP metoda se využívá především jako screeningová metoda pro diagnostiku inhalačních a potravinových alergií (Phadiatop pro inhalační alergie, směs fx5 pro potravinové alergie). Roztypovávání jednotlivých pozitivit těchto screeningů nebo speciální užší sreeningy na sp.ige se provádějí metodou RISA. CAP metoda je vzhledem k ceně v případě testování pozitivit na jednotlivé alergeny nebo specializované směsi alergenů využívána jen výjimečně, většinou jen pro konfirmaci. Od r jsou nabízeny také čtyři panely multiplexové metody Optigen (obr.8), firmy Hitachi Chemical Diagnostics,Inc., vyšetřované na přístroji (obr.9). Jak je známo a jak vyplývá z (tab.8), nelze u jednotlivých metod při použití stejně nazývaných a popisovaných alergenů očekávat dosahování shodných

37 výsledků. Používání tří rozdílných metod pro diagnostiku sp.ige však přináší klinikům možnost verifikovat nebo ověřovat nálezy, které nekorelují s jimi předpokládanými anamnézami u některých pacientů ( Lochman a kol.,2008). Z buněčných testů je v současné době používán v laboratořích OIA bazotest, a to jen v případech nejasné nebo obtížné diagnostiky, kdy kožní testy ani stanovování sp.ige neposkytují očekávané výsledky. Jako alergeny se kromě komerčních alergenů dodávaných pro tento test firmou Bühlmann i vhodně naředěné a předem otestované alergeny používané pro kožní testy. Obr. 8: Panely metody Optigen ( převzato z: Macečková a kol.,2009)

38 Obr.9 : Systém Optigen (Hitachi Chemical Diagnostics, Inc.) (ukázka systému umístěného na pracovišti oddělení imunologie a alergologie CKL ZÚ se sídlem v Ostravě) Tab.8: Srovnání výsledků stanovení sp.ige metodou Optigen, Euroline a CAP Srovnávané metody n senzitivita specificita efektivita Optigen/CAP ,0 94,5 72,9 Euroline/CAP 45 61,5 84,2 71,1 Optigen/Euroline ,0 87,1 83,4 Převzato z: Macečková a kol.,2009 Referenční metoda pro každé srovnání je uvedena za lomítkem, srovnávaná před lomítkem. Senzitivita % pozitivních výsledků mezi skutečně pozitivními Specificita - % negativních výsledků mezi skutečně negativními Efektivita - % správných výsledků mezi všemi testovanými vzorky