CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 Ref. 2003 2017/04
POUŽITÍ SADY Sada CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 je určena pro separaci proteinů v lidském séru a moči kapilární elektroforézou systémem CAPILLARYS v alkalickém tlumicím roztoku (ph 9.9). Proteiny v normálním séru se rozdělí na šest hlavních frakcí. Po přípravě vzorků moči pomocí sady CAPILLARYS / MINICAP URINE (viz příbalové informace pro sadu CAPILLARYS / MINICAP URINE, SEBIA, kat. č. 2013) se proteiny v moči rozdělí na pět frakcí. CAPILLARYS provádí všechny operace automaticky a výsledkem je profil bílkovin pro kvalitativní nebo kvantitatívní analýzu. Bílkoviny separované v silika (kysličník křemičitý) kapilárách, jsou přímo detekovány při 200 nm. Vizuální interpretací elektroforeogramů lze zachytit řadu abnormalit. Přímá detekce poskytuje přesné relativní kvantitativní vyhodnocení jednotlivých proteinových frakcí. Určeno pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : v tomto návodu se název "CAPiLLARYS" používá pro poloautomatické přístroje CAPiLLARYS, CAPiLLARYS 2 a CAPiLLARYS 2 FLEX-PiERCiNG. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je běžnou technikou, rutinně používanou klinickými laboratořemi ke skríningu abnormalit bílkovin ve vzorcích. CAPILLARYS byl vyvinut ke kompletní automatizaci s rychlým dělením a přijatelným rozlišením. Tuto techniku lze zařadit mezi klasickou zónovou elektroforézu a kapalinovou chromatografii. Systém CAPILLARYS používá princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou separovány podle elektroforetické pohyblivosti v alkalickém pufru o určitém ph. Separace je rovněž závislá na ph elektrolytu a a elektroosmotickém toku. Systém má 8 kapilár, umožňujících 8 paralelních analýz. Ředění vzorku pufrem je připraveno a vpraveno aspirací na anodickém konci kapiláry. Potom následuje vysokovoltážní separace bílkovin a jejich přímá detekce při 200 nm na katodickém konci kapiláry. Kapiláry jsou ihned promývány promývacím roztokem a připraveny k další analýze. Proteiny jsou detekovány v následujícím pořadí : gamaglobuliny, beta-2 globuliny, beta-1 globuliny, alfa-2 globuliny, alfa-1 globuliny a albumin - v každé zóně obsahující jednu nebo více bílkovin. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 2003 Pufr (připraveno k použití) 2 lahvičky po 700 ml Promývací roztok (zásobní roztok) 1 lahv., 75 ml Diluční segment 1 bal. 90 ks Kapalinový filtr 3 ks OPTiMÁLNÍ ŘÍZENÍ vysledovatelnosti : všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁvANÝCH výkonů : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. 1. PUFR Příprava Tlumicí roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.9 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufr k analýze proteinů kapilární elektroforézou. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Před otevřením je pufr stabilní do doby expirace vyznačené na obalu kitu či na nálepce na nádobce s pufrem. POZNÁMKA : Před použitím je pufr po vynětí z chladničky nutno vytemperovat na pokojovou teplotu. NEMRAZIT! Po otevření lahvičky s roztokem a jejím vložení do přístroje CAPILLARYS je roztok při pokojové teplotě stabilní maximálně 2 měsíce (akumulovaný čas). Je-li plánované použití lahvičky s roztokem více než 2 měsíce, musí se po každém použití z přístroje vyjmout a uložit při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (mezi teplotami 2 a 8 C). V takovém případě je stabilní až do data exspirace uvedeného na štítku lahvičky s roztokem. Nepoužívejte, objeví-li se změna vzhledu roztoku - zákal v důsledku mikrobiální kontaminace! 2. PROMÝVACÍ ROZTOK Příprava Lahvička zásobního promývacího roztoku může být zředěna až na 750 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. K promývání kapilár po elektroforetické separaci bílkovin. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby promývacím roztokem se doporučuje promýt otevřenou nádobu, konektor a zkumavku velkým množstvím destilované nebo neionizované vody, aby se zabránilo tvorbě usazenin soli. - 125 - SEBIA NÁVOD - Czech
Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní roztok je stabilní nejméně do data expirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých lahviček. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Nepoužívejte, objeví-li se změna vzhledu roztoku - zákal v důsledku mikrobiální kontaminace! 3. DILUČNÍ SEGMENTY Segmenty k ředění na jedno použití pro přípravu biologických vzorků pro analýzu s použitím automatizovaného nástroje. Pro umístění na stojan na vzorky. Jeden segment k ředění je určený k analýze 8 vzorků (7 vzorků za přítomnosti rozpouštědla). VAROVÁNÍ : Se segmenty k ředění biologických vzorků je třeba po použití zacházet s opatrností. Jakmile je analýza dokončena, segmenty k ředění je nutné zlikvidovat spolu s biologickým odpadem a NIKDY se nesmí používat znovu. Skladování Před použitím skladujte segmenty k ředění v jejich uzavřeném obalu na čistém a suchém místě a při teplotě v rozmezí 2 a 30 C. 4. KAPALINOVÉ FILTRY Filtry na jedno použití k filtraci pufru pro analýzu, pracovního promývacího roztoku a destilované vody (používá se k vyplachování kapilár). DŮLEŽITÉ : Při výměně soupravy systematicky vyměňte všechny filtry. Při manipulaci a instalaci filtrů noste čisté rukavice. Našroubujte jeden filtr na konektor umístěný na konci každé hadičky rourky trubice ponořené do lahviček s pufrem, promývacím roztokem nebo s deionizovanou vodou. Skladování Filtry skladujte v originálních, utěsněných obalech, na suchém místě, při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA K vyplachování kapilár v automatickém systému CAPILLARYS, SEBIA, pro kapilární elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0,45 μm) a s vodivostí nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální funkci přidejte roztok CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička o objemu 5 ml) do destilované nebo deionizované vody nebo použijte přímo roztok CAPIprotect* připravený k použití (SEBIA, KAT. Č. 2061 : 2 nádoby o objemu 5 L destilované vody s CLEAN PROTECT). DŮLEŽITÉ : Vyplachovací kontejner je před naplněním nutno vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. * POZNÁMKA : Řešení CAPiprotect lze také použít k rozředění zásobního promývacího roztoku. Pak v takovém případě může zředěný promývací roztok vykazovat přechodnou, více či méně žlutou barvu bez jakýchkoliv negativních účinků na jeho výkon. 2. CAPICLEAN Složení Lahvička s koncentrovaným roztokem (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje : proteolytické enzymy, surfaktanty a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení testu, v koncentracích neohrožujících lidské zdraví. K čištění vzorkovací sondy v automatickém systému CAPILLARYS, SEBIA, pro kapilární elektroforézu, během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : - Je-li během týdne analyzováno méně než 500 vzorků, spusťte alespoň jednou týdně sekvenci čištění CAPICLEAN. - Jestliže je během jednoho dne analyzováno méně než 500 vzorků, ale během týdne je analyzováno více než 500 vzorků, spusťte čistící sekvenci CAPICLEAN po každých 500 analýzách. - Je-li během dne analyzováno více než 500 vzorků, spusťte sekvenci čištění CAPICLEAN jednou denně. viz návod k roztoku CAPiCLEAN, SEBiA. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte opakovaně diluční segmenty po vyčištění vzorkovací sondy. Skladování, stabilita a známky poškození CAPICLEAN skladujte v chladničce při 2-8 C. Je stabilní do data expirace vyznačeném na štítku lahvičky. NEMRAZIT! V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se shromáždit pouze supernatant. 3. ROZTOK CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkové jehly) Příprava Připravte roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % roztoku chloridu (koncentrovaného) do 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. K čištění dávkovací pipety vzorku v automatickém systému CAPILLARYS, SEBIA (týdenní údržba nutná k odstranění bílkovin usazených na jehle (pipety)). viz návody na CAPiLLARYS, SEBiA. Použijte stojánek na vzorky, určený k čištění kapilár (č. 100). Umístěte zkumavku obsahující 2 ml předem připraveného 2-3 % chlorovaného roztoku na pozici č. 1 stojanu na vzorky. Zasuňte vzorkový stojánek č. 100 k čištění do systému CAPILLARYS. V okénku "MAINTENANCE", které se objeví na obrazovce, zvolte "Launch the probe cleaning with chlorinated sodium hypochlorite solution" a potvrďte. - 126 -
Skladování, stabilita a známky poškození Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při pokojové teplotě. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 4. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 750 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Slouží k promývání kapilár systému CAPILLARYS. Tuto reagencii je nutno použít tehdy, pokud počet vzorků v sérii je menší než čtyřicet. DŮLEŽITÉ : Před naplněním nádoby promývacím roztokem se doporučuje promýt otevřenou nádobu, konektor a zkumavku velkým množstvím destilované nebo neionizované vody, aby se zabránilo tvorbě usazenin soli. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní promývací roztok je stabilní do data expirace uvedeného na obalu kitu nebo štítku lahvičky. Pracovní roztok je stabilní 3 měsíce. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok odstraňte. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Systém CAPILLARYS SEBIA : CAPILLARYS kat. č. 1220, CAPILLARYS 2 kat. č. 1222 nebo CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING kat. č. 1227. 2. Stojánky na vzorky dodáno se systémem CAPILLARYS. 3. Souprava nádobek dodávaná se systémem CAPILLARYS : nádobka na vyplachovací roztok (na destilovanou či deionizovanou vodu) a nádobka na odpad. ANALYZOVANÉ VZORKY ANALÝZA vzorků SÉRA Odběr a skladování vzorku Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky lze skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu až 10 dní. Na delší skladování by měly být vzorky zmrazeny na - 18 / - 30 C do 8 hodin po odběru. Zmražené vzorky séra jsou stabilní po dobu 2 měsíce. Bílkoviny ve vzorku skladovaném při teplotě 2 až 8 C nebo 15 až 30 C podléhají degradaci, zejména složka C3, u které je kinetika degradace při teplotách 15 30 C velmi rychlá a po třech dnech ji lze jasně pozorovat. Sérum skladované při teplotě mezi 2 a 8 C nebo mezi 15 a 30 C obsahuje frakci beta-2, jejíž obsah postupně klesá a může se objevit zkresleně (s dalšími malými frakcemi, které se objeví na straně gama nebo beta-1 následně po znehodnocení složky C3), a frakci alfa-2, jejíž tvar může být mírně změněn. Po 10 dnech skladování mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování mezi 15 a 30 C se frakce beta-1 začne deformovat rozpínáním a obsah frakce beta-2 se silně sníží. V závislosti na vzorcích může být po 10 dnech skladování při teplotě mezi 2 a 8 C nebo 3 dnech skladování při teplotě mezi 15 a 30 C potenciálně narušena automatická integrace frakcí provedená softwarem pro zpracování dat. POZNÁMKA : Každá laboratoř musí zajistit, že jsou vzorky přepravovány za optimálních podmínek, aby nedošlo k porušení jejich integrity (1). (1) iso 15189 : Zdravotnické laboratoře Požadavky na kvalitu a způsobilost. Příprava vzorků Používejte neředěná séra. Při skladování v ledničce (2-8 C) - nebo po zmrazení, se některá séra mohou stát viskózními nebo se vyvine zákal. Týká se to zvláště těch, která obsahují kryoglobulin. Tyto vzorky lze při pokojové teplotě přímo analyzovat. Vzorky obsahující polymerizované imunoglobuliny mohou být použity bez jakékoli úpravy. Vzorky před analýzou vždy prohlédněte (hemolýza, kryoglobuliny nebo zákal). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra hemolýza zvyšuje α2 frakci. Nepoužívejte stará a špatně skladovaná séra snižuje se frakce beta-2. Nepoužívejte vzorky plasmy. Fibrinogen migruje na pozici beta-2 (přesně na pozici beta-2 nebo navrstvený přes pásmo beta-2 s možným zesílením této frakce). Pokud je fibrinogen přítomný, může v některých vzorcích (plasma či sérum nejsou zcela defibrinované nebo se jedná o pacienta po léčbě antikoagulanty) interferovat s analýzou a způsobovat nepřesnost interpretace (podezření na monoklonální proužek nebo zvýšenou frakci beta 2). Pokud se analyzují starší vzorky plasmy (nedoporučuje se), doplňková složka C3, která je nestabilní a v průběhu času se rozkládá, potom pásmo beta-2 odpovídá v zásadě fibrinogenu. ANALÝZA vzorků MOČi viz příbalové informace sady CAPiLLARYS / MiNiCAP URiNE, SEBiA, kat. č. 2013. - 127 -
POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBiA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP Systém CAPILLARYS je multiparametrické zařízení, určené k analýze sérových bílkovin v osmi kapilárách v následujícím pořadí : Načtení čárového kódu až 8 zkumavek se sérem a kódu stojánku se zkumavkami. Ředění vzorků z primárních zkumavek v dilučních segmentech. Promytí kapilár. Nasátí (injektáž) ředěných vzorků do kapilár. Analýza proteinů a jejich přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují : Uložení zkumavek se vzorky do stojánků ; Umístění stojánků do přístroje CAPILLARYS ; Vynětí stojánků se vzorky po provedení analýzy. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. I. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ ANALÝZY 1. Zapněte přístroj a počítač. 2. Nastavte software, stiskněte "enter" a přístroj automaticky startuje. 3. Kit CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 je určen k použití v analytickém programu "PROTEIN(E) 6" přístroje. Před zvolením tohoto analytického programu a umístěním lahvičky s pufrem do přístroje pečlivě prostudujte manuál přístroje s návodem. 4. Stojánek na vzorky má 8 pozic k uložení zkumavek umístěte 8 zkumavek do každého stojánku, takovým způsobem, aby čárové kódy byly viditelné v otvorech stojánků. DŮLEŽITÉ : Pokud je počet zkumavek menší než 8, doplňte stojánek zkumavkami obsahujícími destilovanou nebo deionizovanou vodu. 5. Umístěte na každý stojan na vzorky nový diluční segment. Stojan na vzorky bude vysunut, pokud segment chybí. 6. Kompletní stojánky se vzorky a segmenty zasuňte do přístroje otvorem v jeho středu. Postupně v jednom sledu lze umístit do systému až 13 stojánků se vzorky. Doporučuje se použití stojánku s označením č. 0 pro kontrolní sérum. 7. Stojánky s již analyzovanými vzorky vyjměte z prostoru na levé straně přístroje. 8. Pečlivě odstraňte diluční segmenty ze stojánků se vzorky. UPOZORNĚNÍ : S dilučními segmenty, obsahujícími biologické vzorky, manipulujte opatrně. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATICKÝCH KROKŮ 1. Čárové kódy jsou načítány ze zkumavek i stojánků. 2. Vzorky jsou ředěny pufrem a ředící jehla je proplachována po každém vzorku. 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Zředěné vzorky jsou nasáty do kapilár. 5. Dělení (migrace) probíhá za konstantního napětí po dobu 4 minut, při konstantní teplotě (řízeno Peltiérovým článkem). 6. Proteiny jsou detekovány přímo, skenováním při 200 nm a na obrazovce systému se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA : Tyto kroky jsou popsány pro první stojánek se vzorky. výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. První dva kroky - čtení čárového kódu a ředění vzorků následujícího stojánku, jsou prováděny vždy během analýzy předchozího stojánku se vzorky. II. VÝSLEDEK ANALÝZY Ke konci analýzy je automaticky určeno relativní zastoupení jednotlivých zón a mohou být analyzovány profily. Po zadání koncentrace celkové bílkoviny systém vypočítá koncentraci každé frakce. Vizuální interpretací elektroforegramů lze zjistit vyskytující se abnormality. Elektroforetické profily jsou vizualizovány standartně použitím techniky přepsání : frakce alfa-1 se zobrazuje blíže k albuminu. Standardní technika umožňuje vizualizovat původní křivku s neupravenými údaji. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. III. UKONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé série analyzovaných vzorků musí operátor systém CAPILLARYS vypnout nebo přepnout do pohotovostního režimu, aby byly zabezpečeny optimální podmínky pro uložení kapilár. IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH KONTEJNERŮ CAPILLARYS automaticky kontroluje přítomnost reagencií. DŮLEŽITÉ : Prosíme, dodržujte instrukce pro výměnu reagenčních nádobek s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení následujících úkonů bude zobrazena zpráva : Vložte novou lahvičku z pufrem a / nebo ; Naplňte kontejner pracovním promývacím roztokem a / nebo ; Naplňte kontejner filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a / nebo ; Vyprázdněte kontejner s odpadem. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda pro čistoty pro nástřik. DŮLEŽITÉ : Doporučuje se důkladně promýt nádobku na vyplachovací roztok před jejím opětovným plněním větším množstvím vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. - 128 -
KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum. VÝSLEDKY Hodnoty Přímá detekce při 200 nm v kapilárách dává relativní koncentrace (procentuální hodnoty) pro jednotlivé proteinové zóny. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) jednotlivých hlavních elektroforetických zón sérových proteinů byly stanoveny na základě 246 sér dospělých osob zdravé populace (mužů a žen) s normálními hladinami trygliceridů. CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 Albumin 55.8-66.1 % Alfa-1 globuliny 2.9-4.9 % Alfa-2 globuliny 7.1-11.8 % Beta globuliny 8.4-13.1 % Beta-1 globuliny 4.7-7.2 % Beta-2 globuliny 3.2-6.5 % Gama globuliny 11.1-18.8 % Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. POZNÁMKA: Referenční hodnoty byly stanoveny použitím standardních parametrů softwaru PHORESiS (vyhlazení 2 a automatický posun). Interpretace Složka C4 komplementu migruje mezi zónami beta-1 a beta-2 ; CRP migruje do beta pozice, viz ELEKTROFORETICKÉ TYPY. Relativní nárůst pásma beta-2 v porovnání s beta-1 bez klinického kontextu zánětlivého onemocnění představuje varovný signál vyžadující doplňující analýzu. V případě pochybností ohledně interpretace záznamů a / nebo umístění minim (zejména při analýze externí kontroly) je nutno převrstvit získaný záznam záznamem séra Normal Control Serum (SEBIA, kat. č. 4785). Může dojít k podezření na monoklonální složku ve vzorku séra, když je elektroforetický vzor jediného proteinu opožděný nebo zkreslený nebo v případě, že software (PHORESIS verze 8.63) nedokáže vykreslit zónu albumin / alfa-1. Následně se na elektroforetickém vzoru zobrazí následující varovná zpráva : Warning: Migration time out of range (Varování: Doba migrace mimo rozsah) s červeným varovným signálem. Tento červený varovný signál se rovněž zobrazí na mosaice křivek ve výsledné tabulce pro dotčený vzorek. Totéž platí v případě opožděného nebo deformovaného elektroforetického typu. Pro potvrzení přítomnosti monoklonální složky v sérovém vzorku je nutné ošetřit vzorek ß-merkaptoethanolem a opakovat analýzu vzorku po tomto redukčním zpracování. V takovém případě (i) připravte 1 % ß-merkaptoethanol (BME nebo 2-merkaptoethanol, 2 ME) v roztoku Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička 5 ml), (ii) v připraveném systému CAPILLARYS přidejte 100 µl tohoto redukčního roztoku k 300 µl čistého séra, (iii) promíchejte na vortexu a vyčkejte maximálně 15 minut a potom následuje standardní postup. DŮLEŽITÉ : po redukční úpravě pomocí ß-merkaptoethanolu musí být vzorek neprodleně analyzován. V systému CAPILLARYS nesmí žádný stojan čekat na analýzu. Pokud se stejný varovný signál objeví u více elektroforetických vzorů, zavolejte Technický servis SEBIA. Doporučuje se provést identifikaci monoklonálních nebo oligoklonálních složek: - imunotypizací pomocí sady SEBIA CAPILLARYS IMMUNOTYPING nebo, - imunofixací pomocí sad SEBIA HYDRAGEL IF. Pro interpretaci nálezů viz LITERATURA. Zóna alfa-2 : V některých vzorcích, v závislosti na fenotypu haptoglobinu, bývá alfa-2 zóna rozštěpena, viz ELEKTROFORETICKÉ TYPY. Interference a Omezení Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Lipoproteiny / triglyceridy nebo biliární pigmenty (s charakteristickou žlutozelenou barvou séra) při vysokých koncentracích ve vzorku mohu způsobit vizuální dojem bisalbuminémie na elektroforetickém záznamu. V případě podezření na kontaminaci mezi dvěma vzorky (velmi vzácná), způsobené přítomností nějakých monoklonálních složek (ve vyšších koncentracích na vzorek) se doporučuje zopakovat test na již vyzkoušených vzorcích (kontaminujících a potenciálně kontaminovaných) buď v obráceném pořadí analýz, nebo volbou speciálního promývacího programu pro vzorkovací sondu mezi dvěma vzorky, přiřazené k programu analýzy PROTEIN(E) 6 (možnost Promýt vzorkovací sondu (Sample Probe Wash)). Tato možnost ve skutečnosti umožní provést speciální promývací program u všech vzorků analyzovaných postupem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (POZNÁMKA : analýza systému se sníží na polovinu). PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. Monoklonální komponent nemusí být detekován (například. polymerizovaný imunoglobulinový stěr nebo skrytý v polyklonálním pozadí). Naopak mírné zkreslení elektroforetického záznamu může naznačovat přítomnost monoklonálního imunoglobulinu. Ve všech případech je třeba analyzovat klinický kontext, a pokud je podezření na gamopatii, doporučuje se provést imunotypizační analýzu vzorku. Pokud nejistota přetrvává, ověřte výsledek imunofixačním postupem na agarovém gelu. Problémy Pokud dojde k problémům i při přesném dodržení pokynů pro přípravu a skladování veškerých komponent a instrukcí pro správné provedení metody, volejte Technický Servis dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. - 129 -
DATA PROVEDENÍ Výsledky získané metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 vykazují velmi dobrou reprodukovatelnost s průměrem CV % kolem 2.0 % pro každou frakci proteinů. Výsledky uvedené níže byly stanoveny za použití standardních parametrů přístrojového software (vyhlazení 2, automatický posun). Reprodukovatelnost v serii Pět různých vzorků séra bylo analyzováno v osmi kapilárách metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 se 2 šaržemi analytického pufru. Byly vypočítány průměry, SD a CV (n = 8) pro každý vzorek, každou zónu a každou šarži. Tabulka ukazuje hodnoty 5-ti testovaných vzorků, rozdělených na jednotlivé frakce za použití 2 šarží analytického pufru. FRAKCE ALBUMIN ALFA - 1 ALFA - 2 BETA - 1 BETA - 2 GAMA Sérum B : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 60.8 / 60.6 3.8 / 3.7 8.8 / 8.5 6.1 / 6.3 4.7 / 4.8 15.8 / 16.1 SD 0.3 / 0.4 0.1 / 0.1 0.2 / 0.2 0.1 / 0.1 0.1 / 0.2 0.1 / 0.2 CV% 0.5 / 0.6 2.6 / 1.9 2.8 / 1.8 1.8 / 2.2 2.6 / 3.4 0.9 / 1.2 Sérum B : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 61.8 / 61.9 4.5 / 4.4 10.7 / 10.4 5.9 / 6.1 4.3 / 4.4 12.9 / 12.9 SD 0.3 / 0.5 0.1 / 0.05 0.1 / 0.1 0.1 / 0.1 0.2 / 0.2 0.1 / 0.2 CV% 0.4 / 0.8 2.5 / 1.1 1.0 / 1.3 1.4 / 2.3 3.7 / 4.0 1.2 / 1.6 Sérum C : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 60.6 / 60.9 4.4 / 4.4 10.6 / 10.3 5.9 / 6.0 4.4 / 4.4 14.2 / 14.0 SD 0.5 / 0.3 0.1 / 0.1 0.1 / 0.1 0.1 / 0.1 0.2 / 0.1 0.1 / 0.2 CV% 0.8 / 0.5 3.0 / 3.0 1.3 / 1.3 1.5 / 1.8 3.6 / 2.9 0.9 / 1.3 Sérum D : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 62.6 / 62.5 4.1 / 4.1 9.0 / 8.8 6.3 / 6.6 4.3 / 4.3 13.6 / 13.7 SD 0.5 / 0.5 0.1 / 0.1 0.2 / 0.3 0.1 / 0.2 0.1 / 0.1 0.2 / 02 CV% 0.8 / 0.9 2.1 / 3.5 2.1 / 2.9 1.6 / 2.7 2.8 / 2.4 1.6 / 1.4 Sérum E : šarže č. 1 / šarže č. 2 PRŮMĚR (%) 47.6 / 47.0 5.2 / 5.2 7.5 / 7.3 5.5 / 5.7 5.4 / 5.5 28.8 / 29.3 SD 0.5 / 0.6 0.2 / 0.2 0.2 / 0.2 0.1 / 0.1 0.2 / 0.2 0.5 / 0.3 CV% 1.0 / 1.3 4.1 / 3.1 2.7 / 2.9 1.7 / 2.3 3.7 / 2.8 1.7 / 1.2 SD MAX 1.2 0.4 0.7 0.7 0.5 0.5 CV (%) MAX 2.0 7.0 7.0 7.0 7.0 4.0 POZNÁMKA : Maximální hodnoty standarní odchylky a koeficientu variace (SD MAX and Cv (%) MAX) byly určeny dodatečnou analýzou reprodukovatelnosti kontrolního sŕa provedené na řadě přístrojů. Jsou nezávislé na hodnotách ve výše uvedené tabulce výsledků. Reprodukovatelnost mezi sériemi Osm (8) různých vzorků séra bylo analyzováno desetkrát v osmi kapilárách, za použití metody CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 se třemi šaržemi analytického pufru. Pro každý vzorek, zónu a šarži byly spočítány průměry, SD a CV (n = 10). Tabulka ukazuje hraniční hodnoty osmi testovaných vzorků a 3 šarží pufru a průměr CV, vypočítaný z CV pro každou frakci (n = 24). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) Albumin 46.5-64.6 0.1-0.7 0.2-1.2 0.6 Alfa-1 3.0-5.3 0.04-0.2 1.1-4.0 2.6 Alfa-2 7.5-11.1 0.1-0.3 0.6-3.0 1.7 Beta-1 4.6-7.0 0.1-0.3 1.0-5.0 2.2 Beta-2 3.7-6.6 0.1-0.2 1.1-3.8 2.2 Gama 9.4-29.4 0.1-0.3 0.6-2.1 1.0 Reprodukovatelnost mezi šaržemi Osm (8) různých vzorků séra bylo desetkrát analyzováno v osmi kapilárách metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 se třemi šaržemi analytického pufru. Pro každý vzorek, zónu a šarži byly spočítány průměry, SD a CV (n = 30). Tabulka ukazuje hraniční hodnoty 8 testovaných vzorků a 3 šarží pufru a průměry CV vypočítané z CV pro každou frakci (n = 3). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) Albumin 46.7-64.4 0.3-0.6 0.4-1.1 0.7 Alfa-1 3.0-5.2 0.1-0.2 2.2-3.9 3.2 Alfa-2 7.7-10.8 0.1-0.3 1.2-3.3 2.2 Beta-1 4.6-6.7 0.1-0.4 1.8-5.5 2.9 Beta-2 3.9-6.6 0.1 1.7-3.4 2.5 Gama 9.5-29.2 0.1-0.3 0.7-1.6 1.2-130 -
Přesnost Byly analyzovány patologické a normální vzorky séra (n = 135) metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 a dalším, komerčně dostupným systémem, používajícím agarózový gel. Vypočítané korelační parametry mezi oběma porovnávanými systémy viz níže (y = CAPILLARYS PROTEIN(E) 6) : Frakce Korelační koef. y-úsek Sklon Rozsah hodnot V % Albumin 0.973-4.539 0.972 32.2-74.3 Alfa-1 0.975 1.199 1.519 2.9-13.9 Alfa-2 0.947 0.073 1.028 7.1-20.1 Beta-1 0.850-0.903 0.932 4.0-18.8 Beta-2 0.969 0.478 1.189 1.2-27.4 Gama 0.969 3.724 0.959 0.7-49.8 Senzitivita Sériová ředění vzorku séra obsahujícím monoklonální protein v koncentraci 0.429 g/dl (4.29 g/l) byla analyzována metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Nejvyšší ředění, kde byl ještě rozeznatelný proužek M-proteinu odpovídalo 1:16 nebo-li koncentraci 27 mg/dl (0.27 g/l) monoklonálního proteinu. POZNÁMKA : Detekční limit může kolísat podle polohy M-komponenty a polyklonálního pozadí v gama zóně. Linearita Roztoky albuminu o koncentraci 5,2 g/dl a gamaglobulinu o koncentraci 3,1 g/dl (koncentrace proteinu stanovená nefelometricky při 280 nm) byly smíchány v různých koncentracích od 10 ku 10 (100 % roztoku albuminu + 0 % roztoku gamaglobulinu, 90 % + 10 % atd..., až po 0 % roztoku albuminu + 100 % roztoku gamaglobulinu) a směs byla analyzován na elektroforéze metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Výsledky dokázaly, že získané procento každé frakce perfektně koreluje s teoretickým procentem každé frakce ve směsi, a že mohou být metodou CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 lineárně detekovány jakékoli varianty. Bylo určeno, že test CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 je lineární pro frakce albuminu a gamaglobulinu v celém studovaném rozsahu koncentrací (mezi 0,0 a 5,2 g/dl albuminu a 3,1 g/dl gamaglobulinu). - 131 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Clark R et al. Rapid capillary electrophoretic analysis of human serum proteins : qualitative comparison with high-throughput agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. A, 744, 205-213 (1996). 2. Henskens Y et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin. Chem., 44, 1184-1190 (1998). 3. Jellum E et al. Diagnostic applications of chromatography and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B, 689, 155-164 (1997). 4. Jenkins MA and Guerin MD. Quantification of serum proteins using capillary electrophoresis. Ann. Clin. Biochem., 32, 493-497 (1995). 5. Jenkins MA et al. Evaluation of serum protein separation by capillary electrophoresis : prospective analysis of 1000 specimens. J. Chromatogr. B, 672, 241-251 (1995). 6. Jenkins MA and Guerin MD. Capillary electrophoresis procedures for serum protein analysis : comparison with established techniques. J. Chromatogr. B, 699, 257-268 (1997). 7. Jenkins MA and Ratnaike S. Five unusual serum protein presentations found by capillary electrophoresis in the clinical laboratory. J. Biochem. Biophys. Methods, 41, 31-47 (1999). 8. Katzmann JA et al. Identification of monoclonal proteins in serum : A quantitative comparison of acetate, agarose gel, and capillary electrophoresis. Electrophoresis, 18, 1775-1780 (1997). 9. Landers JP. Clinical Capillary Electrophoresis. Clin. Chem., 41, 495-509 (1995). 10. Oda RP et al. Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715-1723 (1997). 11. Wijnen PA and van Dieijen-Visser M. Capillary Electrophoresis of serum proteins : Reproducibility, comparison with agarose gel electrophoresis and a review of the literature. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 34, 535-545 (1996). 12. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. impact-internat, 1986 ; Sept : 93-97. 13. Le Carrer D, Bach-Ngohou K. L'électrophorèse capillaire automatisée en biologie clinique. Spectra Biologie, 146 : 47-52 (2005). 14. L. Guis, A. Chaumier, V. Le Gall, S. Havrez (Février 2013) Intégration du Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) dans un laboratoire de biologie médicale spécialisée. Revue Francophone des Laboratoires, 449, 47 56. 15. Blancher A., Boulestin A., Abbal M. (2007) Diagnostic biologique des gammapathies monoclonales en 2007 et leur identification immunologique. Feuillets de biologie, 48, N 279, 29 36. 16. Blessum C., Jeppsson J.O., Aguzzi F., Bernon H., Bienvenu J. (1999) L électrophorèse capillaire : principe et applications au laboratoire de biologie clinique. Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Numéro 6, 643-57, Novembre - Décembre 1999. 17. Chartier C. et al (2011) Evaluation of two automated capillary electrophoresis systems for human serum protein analysis. Clin. Biochem., DOI:10.1016/j.clinbiochem.2011.05.022. - 197 -
SCHÉMAS / FIGURES PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 1 Albumin Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Gammaglobulins C3 Complement C4 Complement Transferrin Hemopexin 2-2 Haptoglobin phenotype Alpha-2 macroglobulin Prealbumin Albumin α-lipoproteins preß-lipoproteins ß-lipoproteins Alpha-1 acid glycoprotein Alpha-1 antitrypsin Figure 2 1-1 Haptoglobin phenotype Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Albumin - 198 -
SCHÉMAS / FIGURES PROFILS ÉLECTROPHORÉTIQUES - ELECTROPHORETIC PATTERNS Figure 3 1-2 Haptoglobin phenotype Gamma Beta-2 Beta-1 Alpha-2 Alpha-1 Albumin - 199 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn