Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Afinitní chromatografie Tereza Vařilová, Věra Pacáková PřF UK Praha
Obsah přednášky 1. Úvod 2. Teoretický princip 3. Komerční stacionární fáze 4. Příprava vlastních stacionárních fází 4.1 Nosiče 4.2 Aktivace nosičů 4.3 Vazba ligandu 5. Aplikace 6. Závěr 2
Analýza biologicky aktivních látekl proteomika složité systémy vysoké požadavky na použité separační metody separační účinnost selektivita 3
Afinitní chromatografie princip metody Enzym Enzym Protilátka Hormon Substrát Inhibitor Antigen Receptor E + L E...L K = [ E... L] [ E] [ L] 4
Krok 1 Adsorpce vzorek nosič Krok 2 Promytí http://www.amershambiosciences.com Krok 3 Desorpce kovalentně vázaný ligand Krok 4 Regenerace Vařilová T. et al.: Chem. Listy 99 (2005) 570. 5
3 základní kroky analýzy * rovnováha ustálení startovacích podmínek * adsorpce nadávkování vzorku a promytí kolony * eluce vymytí zachycené molekuly z kolony ustálení http://www.amershambiosciences.com promytí neadsor.látky desorpce sorb. látky 6
Eluce Nespecifická změna ph nebo iontové síly pi Specifická přídavek disociačních činidel Izokraticky jednoduché látky s afinitou k ligandu Gradientovou elucí vhodná strmost 7
Typy afinitních ligandů Ligandy pro mono-specifické separace strukt. a biol. příbuzné s cílovou molekulou specifický ligand pro každý jedn. případ pepsin + 3,5-dijodo-L-tyrosin Ligandy pro skupinově-specifické separace šiřší aplikovatelnost komerčně dostupnější glykoproteiny + Konkanavalin A 8
Skupinově selektivní ligandy Konkanavalin A Lysin Arginin Benzamidin Specifita Glukopyranosylmanopyranosylové skupiny Ribosomální RNA Serinové proteasy Serinové proteasy Heparin Lipoproteiny, hormony, steroidní receptory 9
Malé ligandy nebezpečí stérických interferencí mezi matricí a ligandem nebo nízká přístupnost pro ligand oddalovací raménko (spacer arm) www.amershambiosciences.com 10
IMAC Immolized Metal Affinity Chromatography Afinitní chromatografie na vázaných v kovových iontech afinita někt. bílkovin k iontům TK, které jsou imobilozovány na pevném nosiči chelátovým komplexem Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+, Co 2+ čištění rekombinantních proteinů 11
Komerční afinitní stacionárn rní fáze Tosoh Bioscience TSKgel ABA-5PW p-aminobenzamidin napodobuje inhibitor serinové proteasy Aplikace: trypsin, urokinasa, krevní koagulační faktory 0,5 M NaCl + 2 mm CaCl 2 v 50 mm Tris.HCl ph 8,0 Eluce změnou hodnoty ph pufru na 2,8. Izolace surového trypsinu 12
Amersham Bioscience Con A Sepharose 4B Concanavalin A váže sacharidové složky Aplikace: analýza glykoproteinů Eluce přídavkem α-methyl-manosidu. Přečištění lidského membránového glykoproteinu 13
Příprava afinitní stacionárn rní fáze Příprava vlastní stacionární fáze Nosič aktivace Nosič s aktiv. skupinami Imobilizace afinitního ligandu Blokace nezreg. funkč.skupin naplnění kolony Afinitní stacionární fáze 14
Nosiče e pro afinitní chromatografii minimální nespecifické interakce chemická stabilita mechanická stabilita ph stabilita teplotní stabilita 15
Silikagel nutná modifikace povrchu: volné silanolové Si-OH skupiny zavedení reaktivní funkční skupiny (epoxy) snese tlaky omezené ph: 2<pH<8 nespecifické interakce 16
Anorganické oxidy Al 2 O 3, TiO 2 a ZrO 2 mnoho amorfních a krystalických forem Al 2 O 3 se rozpouští při ph>12 a ph<3 TiO 2 a ZrO 2 snáší i extrémní podmínky ph 17
Agarosové nosiče e a jejich deriváty 2 polysacharidové jednotky, β-(1,4)-o Sepharosa ph 4-9, hydrofilní, nespecifické interakce nestabilní za tlaků OH O mikrobiální atak CH2 OH O O OH O CH 2 O OH O n Varilova T. et al.: Curr. Proteomics 3 (2006) 55. 18
Polyakrylamidové gely syntetické kopolymery na bázi akrylamidu Bio-Gely ph 1-10 chemicky stabilní (sůl, močovina, Gdn.HCl) nízký stupeň porozity O H 2 C C H C NH 2 19
Hydroxyalkylmethakrylátov tové nosiče syntetické polymery HEMA hydroxyethylmethakrylát ph 2-12 Čoupek J., Vinš I.: J. Chromatogr. A 658 (1994) 391. Toyopearl ph 2-12, nižší nespec.interakce 20
Dextranové gely glukosové jednotky α-1,6/ větvené 1,2/1,3/1,4 Sephadex, Superdex O CH 2 O nejsou mechanicky stálé O CH 2 OH OH glykosidické vazby O OH CH hydrolýza při ph 2 CHOH CH náchylné k bakteriálnímu útoku 2 O O OH O HO OH O O O CH 2 Varilova T. et al.: Curr. Proteomics 3 (2006) 55. 21
Celulosa glukosové jednotky β-1,4 dostupná, levná využití v průmyslové oblasti vláknitá vazba pro DNA 22
Monolitické fáze kolona je zcela vyplněna polymerem o def. pórovitosti spotřeba vzorku a rozpouštědel rychlé separace, + pro labilní látky Monolitický disk (scanning electron mikroscopy) Tennikova T.B.: J. High Resol. Chromatogr. 23 (2000) 27. 23
Vtištěné polymery (imprinted polymers) založené na molekulovém rozpoznávání in-situ polymerace v koloně v polymeru zůstanou obtisky po vtištěné molekule chirální separace 24
Aktivace nosičů Epoxy skupinami (bisoxiranem) Bromkyanová metoda (CNBr) Divinylsulfonem (DVS) Organickými sulfonylchloridy tosylchlorid p-toluensulfonylchlorid tresylchlorid 2,2,2-trifluoroethansulfonylclorid nosič aktivace vazba afinant OH + CNBr O-CN + H 2 N-ligand O-CNH-ligand OH + ClSO 2 CH 2 CF 3 SO 2 CH 2 CF 3 + H 2 N-ligand NH-ligand + HOSO 2 CH 2 CF 3 upraveno podle Štulík K. a kol.: Analytické separační metody, Karolinum, Praha 2004 25
Imobilizace afinitního ligandu Aktivní skupina epoxy bromkyan divinylsulfon tresyl Reagující skupiny ligandu -NH 2 -OH -SH -COOH -NH 2 -NH 2 -OH -SH -NH 2 Reakční podmínky ph 5-12 doba 4-72 hod teplota 4-60 C ph 7-10, doba 1-12 hod, teplota 4-25 C ph 6-11, doba 2-24 hod teplota 4-25 C ph 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4-25 C upraveno podle Turková J.: Bioaffinity Chromatography, 2.vydání, Elsevier, Amsterdam 1993. 26
Blokace nezreagovaných fukčních skupin vazba vhodné látky na zbytkové aktivní skupiny nosiče glycin, glycerol, ethanolamin hydrolýza zbytkových aktivních skupin v OH - prostředí 27
Imobilizace ligandu a blokace zbylých skupin Vařilová T. et al.: J. Sep. Sci 29 (2006) 1110. 28
Stanovení množstv ství imobilizovaného ligandu diferenční analýza m celk -m nezreag přímá spektroskopie kyselá/enzymová analýza hydrolýza vazby mezi nosičem a ligandem elementární analýza S, I, N, P Radioaktivita 3 H, 32 P, 57 Co 29
Příklady použit ití prekoncentrace čištění analytů v komplexních směsích analýza látek oblast ŽP (např. pesticidy a toxiny) aplikace v lékařství (enzymy, hormony, viry a jejich genetický fond, rakovinotvorné markery, protilátky, proteiny semenné plazmy, léky/drogy ) proteomika stanovení vazebných konstant kombinace s 2-DE 30
nosiče HEMA E HEMA VS Toyopearl E ligand 3,5-dijodo-L-tyrosin blokace nezreag.skupin glycin vzorek prasečí pepsin A lidský pepsin eluce vzorku změnou ph mob. f. Pepsin A 214 [ma] 400 300 200 100 0 1 2 3,6-100 0 10 20 30 40 50 t [min] Prasečí pepsin A na koloně HEMA VS-DIT. 3 5,6 5,2 4,8 4,4 4,0 ph Vařilová T. et al.: J. Chromatogr. A 1084 (2005) 207. 31
Proteiny semenné plazmy nosič Toyopearl (komerční) ligand heparin vzorek proteiny semenné plazmy: kančí, býčí a lidské eluce vzorku změnou pi mob. fáze A 280 [ma] 560 2 480 1 400 320 240 160 80 0 0,15 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 t [min] Lidská semenná plazma. 1,5 1,0 c NaCl [M] 0,5 Vařilová T. et al.: J. Sep. Sci 29 (2006) 1110. 32
nosiče Toyopearl E Toyopearl T ligand konkanavalin A blokace nezreag.skupin glycin vzorek 4-nitroder. sacharidů glykoproteiny vybrané alergeny eluce vzorku přídavek manopyranosidu Glykoproteiny A 280 [ma] 20 15 10 5 0 1-5 0 6 12 18 24 30 36 t [min] Pylový alergen Phleum pratense na koloně Toyopearl E-Con A. 2 33
Papain nosič skleněná vlákna ligand papain vzorek papainové inhibitory z bramborové šťávy eluce vzorku 6 M močovinou Membrána ze skleněných vláken s imobilizovaným papainem. Guo. W. and Ruckenstein E.: J. Membr. Sci. 215 (2003) 141. 34
Závěr Afinitní chromatografie separace a izolace látek specifické interakce (molekulové rozpoznávání) nové stacionární fáze miniaturizace techniky (afinitní membrány) 35
Děkuji za pozornost! 36