HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) Ref. 4145 Ref. 4260* 2018/07
POUŽITÍ SADY Sada HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) k elektroforetickému rozdělení bílkovin lidského séra a moči do pěti hlavních frakcí na alkalicky pufrovaných agarózových gelech (ph 9.1). Normální bílkoviny lidského séra by se měly rozdělit na pět hlavních frakcí. Sada se používá ve spojení s poloautomatickým přístrojem HYDRASYS. Separované bílkoviny jsou obarveny roztokem amidočerni. Elektroforetické záznamy jsou vyhodnocovány z hlediska abnormalit vizuálně. Densitometrie slouží k přesnému kvantitativnímu určení jednotlivých zón. Každý agarózový gel je určen k analýze 54 vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU 1-15 Elektroforéza bílkovin je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření séra a některých dalších tělních tekutin pro zjištění proteinových abnormalit. Test je založen na principu zónové elektroforézy prováděné ve vhodném nosném médiu. Jako univerzální a efektivní nosné médium se používá agaróza. Agaróza slouží jako univerzální a efektivní podpůrné medium. V diagnostických aplikacích se v ní sérum dělí na pět hlavních frakcí dle jejich náboje při daném ph : Albumin, a1 a a2-globuliny, ß-globuliny a g-globuliny. Každá zóna obsahuje jednu nebo více sérových bílkovin. Uspořádání bílkovin moči je podobné rozdělení bílkovin v séru. Relativní intenzita frakcí a jejich přítomnost se však může výrazně lišit v závislosti na filtrační kapacitě ledvin. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 4145 KAT. Č. 4260* Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů 80 gelů Pufrované proužky (připraveno k použití) 10 balení po 2 kusech 80 balení po 2 kusech Ředicí roztok pro barvicí roztok (zásobní) 1 lahvička, 60 ml 8 lahviček, 60 ml Amidočerň (zásobní roztok) 1 lahvička, 20 ml 8 lahviček, 20 ml Aplikátory (připraveno k použití) 3 balení po 10 kusech (18 zoubků) 24 balení po 10 kusech (18 zoubků) Filtrační papíry 1 balení po 10 kusech 8 balení po 10 kusech * HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) MAXI-KIT OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 9.1 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu bílkovin. Skladujte gely v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Jsou stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady a na balení gelu (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT. Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelu a pokud struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu) ; (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně ; (iii) nadměrné množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ PROUŽKY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 9.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované proužky fungují jako zásobník pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt gelu a elektrod. Pufrované proužky skladujte ve svislé poloze v originálním ochranném obalu při pokojové teplotě nebo v chladničce (šipka na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku balení pufrovaného proužku. NEMRAZIT. Pokud je balení otevřeno a pufrovací proužky vyschlé, zneškodněte je. - 129 - SEBIA NÁVOD - Czech
3. ŘEDICÍ ROZTOK PRO BARVICÍ ROZTOK HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) - 2018/07 Zásobní ředicí roztok barvicího roztoku musí být použit podle pokynů v odstavci "AMIDOČERŇ". Obsahuje kyselý roztok ph 2. Pro přípravu barvicího roztoku amidočerni. Zásobní ředicí roztok pro barvicí roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. NEMRAZIT. Nepřidávat azid sodný. 4. AMIDOČERŇ Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvicího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správné rekonstituce barvicího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku velmi důkladně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. V případě potřeby opakujte tento krok dvakrát až třikrát. 6. Nalijte zbylý ředící roztok do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvicí roztok je připraven k použití. POZNÁMKA : Nesprávná příprava barvicího roztoku povede k podhodnocení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. 5. APLIKÁTORY Nařezané aplikátory pro jednorázové použití určené k nanášení vzorků. Skladování Aplikátory skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 6. FILTRAČNÍ PAPÍRY Nařezané bločky tenkého absorpčního papíru pro jednorázové použití jsou určeny pro odsátí přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před nanesením vzorků. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat č. 4540, 10 lahviček, 100 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 100 litrů. Praktické je zředit pouze 5 ml zásobního roztoku na 5 litrů, což je objem láhve na odbarvovací roztok. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztok je určen pro odstranění přebytečného barviva a odbarvení pozadí gelů. K opláchnutí barvicího oddílu po provedení mycí procedury. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). - 130 -
Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. NEMRAZIT. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 2. HYDRASYS - PROMÝVACÍ ROZTOK Každá lahvička Promývacího Roztoku HYDRASYS (SEBIA, kat č. 4541, 10 lahviček, 80 ml každá) může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. Slouží pro čištění barvicího prostoru systému HYDRASYS. Používejte jej pravidelně - například při každodenním používání přístroje promývejte barvicí prostor jednou týdně. Viz příbalový leták s návodem k použití. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách. Stabilní jsou do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. 3. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587, 5 ml) je připraven k použití. Ředění vzorků s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku (například viskózní nebo zakalené vzorky, jako jsou séra s obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu, vzorky s polymerizovaným Ig M, ) nebo s nízkou intenzitou elektroforetického záznamu. Skladovat při pokojové teplotě. Je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku lahvičky roztoku Fluidil. Fluidil nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Manuální nebo automatizovaný mikropipetor, SEBIA HYDRAPLUS, kat. č. 1216 nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217 nebo SEBIA ASSIST, kat. č. 1218 jako alternativu k vzorkovým aplikátorům. 3. Vlhká Zásobní Komora, kat. č. 1270, dodávána se systémem HYDRASYS. 4. Souprava nádob dodávaná se systémem HYDRASYS. 5. Pipety : 10 µl a 200 µl. 6. Densitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 102 mm : Software HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA nebo PHORESIS pro plochý skener. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky. Odběr séra a moči musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložené v chladničce (2 až 8 C) co nejdříve po odběru je možné uchovávat až jeden týden. Pro delší skladování vzorky zmrazte (stabilní nejméně jeden měsíc). Mražení sér s azidem sodným, 0.02 g/dl zvyšuje stabilitu při skladování. Obdobně zvyšuje stabilitu při skladování mražení moči s HEPES 0.1M (ph 6.75) a s azidem sodným 0.02 g/dl. DŮLEŽITÉ : Nepoužívejte kyselinu boritou jako konzervant. Rozmražený vzorek může obsahovat slabé aplikační značky vlivem denaturace proteinu nebo lipoproteinu. Skladování při 2 až 8 C i mražení způsobuje anodický posun beta-lipoproteinů z beta-1 zóny do zóny alfa-2 nebo alfa-1 ; čím je použito starší sérum, tím je posun výraznější. - 131 -
vzorků 1. Séra Používejte neředěné vzorky séra. Úprava sérových vzorků pomocí Fluidil: Úprava sérových vzorků přípravkem Fluidil se musí provést v následujících případech: - Sérové vzorky s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku, například viskózní nebo zakalené vzorky po skladování při teplotě 2 až 8 C nebo po zmrazení (zejména vzorky obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu). - Sérové vzorky s polymerizovaným Ig M. - Sérové vzorky s elektroforetickým záznamem s nízkou intenzitou. V takových případech přidejte 25 μl přípravku Fluidil na 75 μl séra a odstřeďujte na vortextu po dobu 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu. 2. Odstředěné vzorky moči Analýza se provádí se vzorky zahuštěnými tak, aby celková koncentrace proteinu byla 1.5-2.0 g/dl (s adaptovaným zařízením). DŮLEŽITÉ : Některé vzorky moči obsahují soli. V důsledku toho může dojít k narušení gelu při migraci a následně ke zkreslení migračních profilů. Toto zkreslení může být příčinou nepřesné interpretace výsledků a proto by soli v těchto vzorcích měly být odstraněny dialýzou. POZNÁMKA : Difúze vzorků moči do špičky aplikátorů může být narušena, pokud je moč (čistá nebo koncentrovaná) zakalená. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0.45 µm). Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra - hemolýza zvyšuje a-2 a ß-frakce. Nepoužívejte vzorky plazmy. Proužek fibrinogenu v gama zóně by mohl být považován za monoklonální imunoglobulin a mohl by zvýšit procento odpovídající zóny. Nepoužívejte vzorky staré, nesprávně skladované moči, u nichž mohla proběhnout enzymatická degradace proteinů. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. POSTUP Systém HYDRASYS je poloautomatický víceparametrický přístroj. Automatizované kroky zahrnují zpracování agarózových gelů HYDRAGEL v následujícím pořadí : nanesení vzorku, elektroforetická migrace, vysušení, barvení, odbarvení a závěrečné vysušení. Manuální kroky zahrnují manipulaci se vzorky a gely a nastavení přístroje k činnosti. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE UŽIVATELSKÝ NÁVOD K PŘÍSTROJI HYDRASYS / HYDRASYS 2. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte přístroj HYDRASYS. 2. Umístěte tři aplikátory na rovný povrch s čísly jamek vpravo nahoře (viz Obr. 1). - Naneste 10 µl čistého vzorku séra nebo zahuštěné moči do každé jamky. Každý aplikátor naplňte do 2 minut. - Vložte aplikátory do dvou vlhkých komůrek zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček) ; Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut od nanesení posledního vzorku. Pro pozdější použití (až po 8 hodinách) dejte celou komůrku do chladničky. Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku pro vlhkou komoru. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POZOR : Nikdy nezavírejte víčko, pokud jsou držáky zdviženy! 4. Z menu přístroje vyberte program migrace "54 PROTEIN(E)&B1-B2". 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované proužky uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče, přičemž musí plastikové vyztužení proužků směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte desku HYDRAGEL. - Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu, mohlo by dojít k dehydrataci gelu. - Naneste 200 µl destilované nebo deionizované vody do dolní třetiny rámu vyraženého na termoregulační destičce migračního modulu. - Opřete gelovou desku (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (Obr. 3). - Gel ohněte a zavěšte dolů na hladinu vody (Obr. 3). Ověřte, zda nedošlo k zachycení vzduchových bublin, že je voda rozprostřena po celém povrchu gelové desky, a že je gel vyrovnán s vyznačeným rámečkem. 7. Sklopte oba držáky dolů. V této pozici se pufrované proužky nedotýkají gelu. NESTLAČUJTE DRŽÁKY AŽ DOLŮ. 8. Vyjměte aplikátory z mokrých komůrek. Uchopte je při tom za ochranný rámeček. - Odlomte ochranný rámeček chránicí zuby aplikátoru. - Umístěte tři aplikátory, každý do polohy č. 2, 6 a 10. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátorech musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 9. Uzavřete víko migračního modulu. 10. Ihned zahajte proces stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou na levé straně klávesnice. DŮLEŽITÉ : Zkontrolujte, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. - 132 -
MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Oba nosiče jsou sklopeny a proužky s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu. Probíhá aplikace vzorků do gelu. Migrace se provádí při konstantních 20 W a 20 C řízených Peltieriho článkem až do akumulovaných 24 Vh (přibližně 5 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Teplota desky stoupne na 10 minut na teplotu 65 C, čímž dojde k vysušení gelu. Deska se poté začne chladit. Po ochlazení na 50 C zazní pípnutí a odjistí se víko migračního modulu. Teplota plotny zůstává až do otevření víka na 50 C. Teplota dále klesá, přičemž po dosažení 20 C (za méně než 5 minut) je možné začít další dělení. POZNÁMKA : Víko migračního modulu zůstává během migrace zavřené. II. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte a zneškodněte aplikátory. 3. Zdvihněte oba nosiče, vyjměte pufrované proužky za plastové konce a zneškodněte. 4. Vyjměte usušený gel pro další zpracování. 5. Po každém použití otřete elektrody i termoregulační plochu vlhkým tamponem. 6. Otevřete držák gelu. Položte jej na rovnou plochu a vysušený gel umístěte (gelovou stranou vzhůru) do žlábků obou tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že gel je uvnitř držáku správně umístěn (viz Obr. 5). 7. Držák gelu vložte do modulu pro vyvíjení a barvení. DŮLEŽITÉ : Před spuštěním programu pro vyvíjení/barvení zkontrolujte následující : - zda nádoba na barvicí roztok obsahuje nejméně 300 ml barvicího roztoku ; - zda nádoba na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 1 L odbarvovacího roztoku ; - zda je nádoba na odpad prázdná. Při připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte uzavřít nepoužité přívody. 8. Vyberte barvicí program "PROT./B1-B2" / "PROTEIN(E)/B1-B2" z menu přístroje a spusťte program stisknutím tlačítka "START". Během barvení, odbarvování a sušení je tento prostor uzamčen. Po ochlazení se odjistí víko migračního modulu (větrání zůstane zapnuté až do vyjmutí držáku gelu). III. DOKONČENÍ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Vyjměte držák gelu z modulu, otevřete jej a vyjměte vysušený gel. POZNÁMKA : Po obarvení / odbarvení a před densitometrií / skenováním může být gel navíc jednou propláchnut, pokud je to zapotřebí pro další vyjasnění pozadí gelu a odstranění zbytkového barviva, které by se mohlo projevit jako modré skvrny. Omyjte gel pomocí programu "WASH ISOENZ/GEL". 2. Je-li zapotřebí, očistěte zadní stranu (plastovou nosnou stranu) vysušeného filmu vlhkým jemným papírem. 3. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. POZNÁMKA : Délka jednotlivých elektroforetických migrací se může lehce lišit na gelech obsahujících vzorky ve 2 nebo 3 řadách bez vlivu na provedení testu. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum (Control Serum, SEBIA kat. č. 4785). VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých proteinových zón. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) hlavních elektroforetických zón proteinů byly stanoveny ze 158 sér dospělých osob zdravé populace (mužů a žen) na gelech HYDRAGEL 54 PROTEIN(E). Kvantifikace bílkovin v UV na CAPILLARYSu dává podobné hodnoty jako nefelometrie (zvláště u albuminu). SEBIA nabízí HYDRAGEL - CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC ekvivalentní jednotky na získané HYDRAGELu, po kalibraci skenovacích systémů. Bez HYDRAGELu CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC Ekvivalentní Hodnoty Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. S HYDRAGELem CAPILLARYS/NEPHELOMETRIC Ekvivalentní Hodnoty FRAKCE HYRYS - GELSCAN - PHORESIS HYRYS - GELSCAN - PHORESIS Albumin 59.8-72.4 % 53.8-65.2 % Alfa-1 globuliny 1.0-3.2 % 1.1-3.7 % Alfa-2 globuliny 7.4-12.6 % 8.5-14.5 % Beta globuliny 7.5-12.9 % 8.6-14.8 % Gama globuliny 8.0-15.8 % 9.2-18.2 % - 133 -
Interpretace 1-15 SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Některé vzorky séra mohou vykazovat lehké štěpení, jež závisí na koncentraci a pohyblivosti proteinů zóny alfa-2 (viz ELEKTROFOREOGRAM). Některá séra mají rozdílný fenotyp - (haptoglobin, GC globulin). Alfa-1 lipoprotein závisí na koncentraci a skladování vzorku. Pro pomoc při interpretaci výsledků elektroforézy sérových a močových bílkovin, použijte dostupnou LITERATURA. Interference a Omezení Lipoproteiny LDL a HDL jsou komplexní složky s velmi proměnlivou přirozenou elektroforetickou mobilitou mezi beta a alfa-2 pásmem. S cílem zabránit komplikacím při integraci a interpretaci, jsou gely HYDRAGEL vyráběny s konkrétním chemickým složením, které obecně zajišťují umístění HDL v pásmu alfa-2 a LDL v pásmu beta. Migrace je velmi citlivá na následující parametry : - skladování vzorku, - koncentrace lipoproteinů, - ošetření léky (například heparinem), - míru dehydratace gelu (skladování gelu), - odchylky v kvalitě surovin, i malé. Z těchto důvodů je možné pozorovat slabý anodický posun těchto lipoproteinů, které jsou více patrné při rozšíření nebo mírnému rozdělení oblastí alfa-2 a / nebo beta. 1) Procentuální obsah frakcí alfa-2 a beta zůstává zcela nezměněn přes mírné rozdělení v důsledku odchylek elektroforetické mobility. 2) Charakteristický tvar frakce beta-lipoproteinů (s významně zaostřeným a nepravidelným tvarem) by neměl vést k chybné interpretaci, protože se změnil pouze tento aspekt. Viz ANALÝZA VZORKŮ. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou touto metodou detekovány. Odstraňování problémů Pokud při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte Technickou Podporu svého dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. ÚDAJE O VÝKONU Analýza séra Reprodukovatelnost na gelu Tři (3) různé vzorky séra byly zanalyzovány na gelu HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) ze třech testovaných šarží v 54 stopách. Průměry, SD a CV (n = 54) byly spočteny pro každý vzorek séra, každou zónu a každou šarži (skener). Následující tabulka ukazuje rozsahy představující vzorek séra č. 1 a tři testované šarže. FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) Šarže 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 68.9 70.2 70.7 0.66 0.91 0.97 1.0 1.3 1.4 Alfa-1 2.1 1.8 1.7 0.17 0.16 0.14 7.9 8.8 8.3 Alfa-2 9.4 9.1 9.0 0.23 0.30 0.34 2.4 3.3 3.7 Beta 9.1 9.1 9.1 0.26 0.25 0.35 2.9 2.7 3.8 Gama 10.5 9.7 9.5 0.48 0.45 0.50 4.6 4.6 5.2 Následující tabulka ukazuje rozsahy představující vzorek séra č. 2 a tři testované šarže. FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) Šarže 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 59.6 61.5 60.2 0.67 1.08 1.13 1.1 1.8 1.9 Alfa-1 5.2 4.9 5.0 0.23 0.24 0.22 4.5 5.0 4.3 Alfa-2 14.8 14.8 14.8 0.26 0.27 0.30 1.8 1.8 2.0 Beta 13.6 13.3 14.0 0.30 0.33 0.41 2.2 2.5 3.0 Gama 6.8 5.5 6.1 0.37 0.56 0.56 5.5 10.1 9.2-134 -
Následující tabulka ukazuje rozsahy představující vzorek séra č. 3 a tři testované šarže. FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) Šarže 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Albumin 53.8 54.1 55.2 0.58 0.76 0.80 1.1 1.4 1.4 Alfa-1 2.5 2.3 2.2 0.12 0.13 0.17 5.0 5.6 7.7 Alfa-2 8.0 7.9 7.8 0.21 0.16 0.29 2.6 2.1 3.7 Beta 9.7 9.9 9.4 0.21 0.21 0.23 2.2 2.2 2.5 Gama 26.1 25.8 25.3 0.35 0.47 0.40 1.4 1.8 1.6 Reprodukovatelnost mezi gely Osmnáct (18) různých vzorků séra bylo zanalyzováno na 12 různých gelech pomocí 3 šarží gelů HYDRAGEL 54 PROTEIN(E). Průměrné hodnoty, SD a CV (n = 12) byly spočteny pro každý vzorek séra a každou zónu. Výsledky byly v zásadě stejné pro všechny vzorky (skener). Následující tabulka znázorňuje rozsahy SD a CV reprezentující všechny vzorky a průměr CV vypočtený ze zásobní CV pro všechny vzorky (n = 18). FRAKCE SD PRŮMĚR CV (%) Albumin 0.9-1.3 1.6-2.1 1.8 Alfa-1 0.2-0.3 5.3-12.3 8.4 Alfa-2 0.2-0.3 1.9-3.7 2.8 Beta 0.3-0.4 3.0-3.3 3.2 Gama 0.5-0.7 2.0-11.9 6.7 Přesnost Sto dva (102) různých vzorků (patologických a normálních sér) bylo podrobeno analýze na gelech HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) a HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30. Korelační parametry byly kalkulované pro jednotlivé zóny ze směsných hodnot na gelech HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) vs. srovnávací gelový systém (y-hydragel 54 PROTEIN(E)) byly (HYRYS) : Frakce Korelační koef. Y-úsek Sklon Rozsah % hodnot* Albumin 0.994 0.640 1.000 35.4-74.3 Alfa-1 0.994-0.070 1.078 1.1-10.5 Alfa-2 0.992-0.030 0.983 5.4-21.4 Beta 0.985 0.320 0.958 5.0-16.5 Gama 0.996 0.050 0.966 6.6-52.5 Korelační parametry byly kalkulované pro jednotlivé zóny ze směsných hodnot na gelech HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) vs. srovnávací gelový systém (y-hydragel 54 PROTEIN(E)) byly (skener) : Frakce Korelační koef. Y-úsek Sklon Rozsah % hodnot* Albumin 0.964 3.407 0.973 34.5-74.1 Alfa-1 0.980 0.030 0.994 1.2-9.4 Alfa-2 0.972 0.070 0.949 5.3-19.8 Beta 0.961 0.904 0.874 5.0-15.6 Gama 0.988 0.411 0.968 5.9-53.6 * Procentuální hodnoty jsou stanoveny pomocí systému HYDRAGEL 54 PROTEIN(E). Citlivost Tři vzorky patologického séra s monoklonální bílkovinou byly následně ředěny a takto ředěné vzorky byly elektroforeticky analyzovány na gelech HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) a HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30. Po vizuální kontrole jednotlivých gelů byla přepočítána koncentrace monoklonální bílkoviny v rozmezí 0.035 a 0.013 g/dl. Nejnižší detekovaná koncentrace monoklonální bílkoviny byla tedy 0.013 g/dl. POZNÁMKA : V závislosti na umístění monoklonální komponenty a polyklonálního pozadí v gama zóně, se může detekční limit lišit. Linearita Roztoky albuminu o koncentraci 5,2 g/dl a gamaglobulinu o koncentraci 3,1 g/dl (koncentrace bílkovin stanovená spektrofotometricky při 280 nm) byly smíchány v různých koncentracích od 10 ku 10 (100 % roztoku albuminu + 0 % roztoku gamaglobulinu, 90 % + 10 % atd..., až po 0 % roztoku albuminu + 100 % roztoku gamaglobulinu) a směs byla analyzován na elektroforéze metodou HYDRAGEL 54 PROTEIN(E). Výsledky prokázaly, že získané procento každé frakce perfektně koreluje s teoretickým procentem každé frakce ve směsi, a že mohou být metodou HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) lineárně detekovány jakékoli varianty. Bylo určeno, že test HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) je lineární pro frakce albuminu a gamaglobulinu v celém studovaném rozsahu koncentrací (mezi 0,0 a 5,2 g/dl albuminu a 3,1 g/dl gamaglobulinu). Analýza zahuštěných močí Výsledky na gelech HYDRAGEL indikují velice dobrou reprodukovatelnost na gelu a mezi gely po kvantitativní a kvalitativní analýze pro vzorky zahuštěné moči. Dvacet osm (28) různých vzorků (patologických i normálních močí) bylo analyzováno na gelech HYDRAGEL a jiném komerčně dostupném systému agarózových gelů. Mezi těmito dvěma systémy nebyly žádné vizuálně pozorovatelné rozdíly. Citlivost detekce byla určena z nejvyššího ředění monoklonálního močového proteinu poskytující rozeznatelný proužek při 0.048 g/dl. - 135 -
ELEKTROFOREOGRAM + Albumin Orosomucoid α1 Antitrypsin α1 Antichymotrypsin Ceruloplasmin GC Globulin α2 Macroglobulin Haptoglobin α Lipoprotein β Lipoprotein Transferrin Hemopexin Plasminogen Fibronectin C3 Complement γ Globulins G - A - M - D - E - Alfa-2 zóna: 2 (± 5) 2 (± 5) 1 + 2 + 3 + 4 + 5 1 + 2 + 3 + 4 (± 5) 1 + 3 + 4 (± 5) A B C 1 = α2 Macroglobulin 2 = Haptoglobin 3 = Ceruloplasmin 4 = GC Globulin 5 = α1 Lipoprotein - 136 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Brouet J.C. Les cryoglobulinémies. La Presse Médicale, 1983, 12, p. 2991 à 2996. 2. Brouet J.C. Orientation diagnostiquée en cas d anomalies des immunoglobulines plasmatiques (Ig E exclues). La Revue du Praticien, n 9, 21/03/91, p. 782 à 785. 3. Garnier J.P., Laurent D., Clauvel J.P., Danon F., Bousquet B., Dreux C. Dosages des protéines sériques : cause d erreur en cas d immunoglobuline monoclonale. Act. Pharm. Biol. Clin., 1987, 4, p. 275 à 278. 4. Guinan J.E.C., Kenny D.F., Gatenby P.A. Detection and typing of paraproteins : comparison of different methods in a routine diagnostic laboratory. Pathology, 1989, 21, p. 35 à 41. 5. Keren D. F., High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation, Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp. 6. Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Première partie : Les techniques de diagnostic protéinologique, principes et limites. L Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n 194, p. 203 à 212. 7. Le Carrer D. Gammapathies monoclonales : mise au point sur leur exploration biochimique en 1991 - Seconde partie : Diagnostic protéinologique du myélome, de la maladie de Waldenström et des autres gammapathies monoclonales. L Eurobiologiste, 1991, Tome XXV, n 195, p. 283 à 285. 8. Le Carrer D. Intérêt du profil protéique, cible immunitaire en biologie clinique. Revue Française des Laboratoires, 1993. 9. Le Carrer D. Électrophorèse et Immunofixation des Protéines Sériques, Interprétations illustrées. Laboratoires SEBIA, 1994, 120 pp, Ed. Hatier - Paris. 10. Le Carrer D. L interprétation de l électrophorèse des protéines. L Eurobiologiste, 1989 - Tome XXIII, n 182, p. 27 à 33. 11. North M.L. Détection et caractérisation d une immunoglobuline monoclonale. Revue Française des Laboratoires, Mars 1990, n 203, p. 54 à 58. 12. Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à 23. 13. Sicard D. Du bon usage de l électrophorèse des protéines. Le Concours Médical, 05.05.90, 1990, 112, 16, p. 1513 à 1515. 14. Van Den Abelle. Électrophorèse des protéines sériques. Intérêt, limites, apport du profil protéique. Larc Medical, 1987, n 7, Vol VI, p. 348 à 351. 15. Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - an out moded test. Ann. Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 à 139. 16. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, Septembre 1986. - 211 -
sebia sebia HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) - 2018/07 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 sebia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Figure 5 HYDRASYS HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15-212 -
sebia HYDRAGEL 54 PROTEIN(E) - 2018/07 SCHÉMAS / FIGURES HYDRASYS 2 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 sebia 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15-213 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn