Dynamické procesy & Pokročilé aplikace NMR chemická výměna, translační difuze, gradientní pulsy, potlačení rozpouštědla, NMR proteinů
Chemická výměna jakýkoli proces při kterém dané jádro mění svůj stav / okolí a NMR charakteristiky k 1 k -1 chemický posun J vazba relaxační čas translační difuze + k 1 k -1 K eq K assoc Intramolekulární (konformační) výměna Intermolekulární výměna tautomerizace konformační rovnováha pohyb postranních řetězců proteinu sbalování proteinů struktura nukleových kyselin vazba ligandu protonace/deprotonace výměna labilních vodíků enzymaticky katalyzované reakce
Chemická výměna dimethylformamide pomalá k << ν ν ex = k π k π ν = 2 koalescence k >> ν rychlá ν ex ( ν ) π = 2k 2 analýza tvaru spektra k příspěvek k vlastní šířce čáry
Chemická výměna minoritní komponenta mizí dříve 0 90 180 0.5 : 0.5 0.75 : 0.25
Chemická výměna Cone inverted cone transformace kalixarenu analýza tvaru spektra inversion rate ~ 1 s -1 at 30 C G ~ 63 kj.mol -1
Změna chem. posunu s ph Chemická výměna - titrace rychlá výměna průměrný posun určení pk a Změna chem. posunu s koncentrací β-cd CHES určení disociační konstanty K d ( 1 p)( [H] p[g ) [ H][G] = = [HG] p 0 ] 0 K d
Chemická výměna a relaxační disperze Teplotní závislost 13 C spekter a relaxací kalixarenu 5 6 4 1 3 2 5 6 4 1 3 2 překlápění orientace vodíkových vazeb apparent true R 2 = R 2 + R ex
Chemická výměna a relaxační disperze R ex závisí na echo čase v CPMG experimentu p A ν, p populations B chem. shift difference k ex exchange rate
Chemická výměna a přenos magnetizace 19 F 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 rychlost výměny = rychlost počátečního nárůstu (po normalizaci)
Pulsy gradientu magnetického pole I gradientní echo G z rozfázování refokusace Odstranění chyb rf pulsů I G z 180 refokusace ve spinovém echu Čistší přenos koherence 1 H 13 C G z y 1 2 HSQC podmínka refokusace G G z1 z2 τ 1 γ = H τ γ 2 C
Translační difuze DOSY
Translační difuze DOSY rozdělení směsi podle velikosti molekul Studium komplexů K d =0.7 mm
Presaturace Potlačení signálu rozpoštědla 1 H 90 180 WATERGATE během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým rf polem G z gradientní echo se selektivním 180 pulsem 180 pro vše kromě vody
Typy NMR biomolekul proteiny a peptidy rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny a oligonukleotidy omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy omezení malou rozmanitostí chemického složení kombinace Dosažitelné informace prostorová struktura molekul, případně komplexů kinetické studie (vazba ligandu, denaturace, komplexace...) molekulárně-dynamické chování Měřená jádra 1 H, 13 C, 15 N, 31 P izotopové obohacení
Řešení prostorové struktury Vzorek NMR spektrometr pulsní sekvence NMR spektra obecné informace o molekule (primární struktura, koval. vazby,...) extrahování experimentálních dat přiřazení signálů extrakce strukturních NMR parametrů zpracování všech informací a predikce struktury validace konečného souboru struktur vzdálenosti vodíků dihedrální úhly orientace vazeb...
Proteinové NMR experimenty aminokyselina i-1 aminokyselina i Experiment HNCA korelace vodík dusík uhlík α (i a i-1) 15 N-NOESY-HSQC objem krospíku vzdálenost
Reziduální dipolární vazba částečně orientované molekuly proteinu kapalný krystal, lipidové bicely, zmáčknutý gel, samovolná orientace projev zbytkové přímé dipól-dipólové interakce ve spektrech 400Å 40Å S~0.0001 RDC ~ 0-20 Hz Informace o vzájemné orientaci pomalých pohybech Kummerlowe et al. Angew Int. 50 (2011), 2643