FUNKČNÍ VZOREK. ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama

VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, V.V.I. FUNKČNÍ VZOREK ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama MVDr. Martin Faldyna, Ph.D. Hana Kudláčková Eva Kotlářová MVDr. Zora Smržová Mgr. Radek Tesařík, Ph.D. prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. Mgr. Jitka Janková 2013

FUNKČNÍ VZOREK ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonugama Autoři MVDr. Martin Faldyna, Ph.D. 1 Hana Kudláčková 1 Eva Kotlářová 1 MVDr. Zora Smržová 1 Mgr. Radek Tesařík, Ph.D. 1 Mgr. Jitka Janková, Ph.D. 2 prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. 2 1 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno 2 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Funkční vzorek byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QI101A094), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202) a projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01) a projektu CEITEC Středoevropského technologického institutu (CZ.1.05/1.1.00/02.0068). ISBN 978-80-86895-38-3 2013

Funkční vzorek ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama MVDr. Martin Faldyna, Ph.D. Hana Kudláčková Eva Kotlářová MVDr. Zora Smržová Mgr. Radek Tesařík, Ph.D. Mgr. Jitka Janková, Ph.D. prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. 2013

OBSAH 1. Úvod 3 2. Cíl metodiky 4 3. Vlastní popis metodiky 5 3.1. Příprava komponent pro sestavení ELISA soupravy 5 3.2. Metodika ELISA reakce 9 3.3. Validace ELISA reakce 9 4. Srovnání novosti postupů 12 5. Popis uplatnění funkčního vzorku 12 6. Ekonomické aspekty 12 7. Seznam použité související literatury 13 8. Dedikace 13 1

1. Úvod Interferon-gama (IFN-γ) je jedním ze základních cytokinů výrazným způsobem ovlivňujícím funkci imunitního systému. Jeho role leží zejména v oblasti antiinfekční imunity, ale také v modulaci některých imunopatologických stavů. Jeho základním zdrojem jsou buňky imunitního systému přirození zabíječi, γδtcr-lymfocyty, ale tím zásadním producentem jsou Th1-lymfocyty. Hlavní biologickou funkcí je modulace spíše buněčného typu odpovědi, která je spojená s aktivací makrofágů (Murray, 1988). Imunitní odpověď zprostředkovaná Th1 lymfocyty je spojena s rozvojem IV. typu přecitlivělosti, který je někdy nazýván oddálený (DTH, delayed type of hypersenzitivity). Toho se v současnosti využívá pro detekci mykobakteriálních infekcí v chovech hospodářských zvířat při tuberkulinaci, která je založena na vpravení specifického antigenu (bovinního a aviárního tuberkulinu) do kůže testovaného zvířete. Výsledek reakce - detekce zduření v místě aplikace v pozitivním případě - se odečítá za 24-48 hodin podle druhu zvířete. Zduření je způsobeno akumulací aktivovaných makrofágů a lymfocytů v místě aplikace. Poznání, že za rozvojem lokální reakce je Th1 typ odpovědi, vedlo k zavedení laboratorní detekce buněčné imunity pomocí tzv. interferonového testu, jehož základem je analýza produkce IFN-γ imunitními buňkami po jejich in vitro stimulaci specifickým antigenem (Rothel a kol., 1990; Wood a kol., 1991). Je to test relativně jednoduchý na provedení. Z praktického hlediska má ale dvě nevýhody je nutné pracovat s funkčními buňkami, takže vzorek nelze skladovat, a je spojen s kultivací buněk, takže vzorek je potřeba odebrat sterilně. Vzorek nesrážlivé krve (zpravidla 1 ml) se inkubuje po dobu 20 hodin s testovaným antigenem. Jako kontrola slouží vzorek krve inkubovaný bez antigenu. Po inkubaci se vzorky odstředí. Pro následné analýzy se používá plasma - buď hned, nebo je možno jí skladovat ve zmraženém stavu. Vyprodukovaný IFN-γ je následně kvantifikován pomocí sandwichové ELISA metody (obrázek 1). Za pozitivní výsledek se považuje situace, kdy ve vzorku inkubovaném s antigenem je IFN-γ více než ve vzorku bez antigenní stimulace. Tato situace ale nastane pouze v případě, že v průběhu imunitní reakce na infekci nebo vakcinaci došlo u testovaného jedince ke klonální expanzi specifických Th lymfocytů, které antigen použitý ke stimulaci rozpoznaly. Jako každý test má i interferonový test svá úskalí. Bylo například testováno, zda může být jeho výsledek ovlivněn předchozí intradermální tuberkulinací (Gormley a kol., 2004; Roberty a kol., 1995; Rothel a kol., 1992; Ryan a kol., 2000). Závěry těchto studií nejsou jednoznačné. Jednoznačné nejsou ani závěry studií zkoumajících vliv zpoždění zpracování vzorků na dosažené výsledky (Gormley a kol., 2004; Rothel a kol., 1992; Ryan a kol., 2000; Whipple a kol., 1995). Naše vlastní výsledky ukazují, např. že použití EDTA jako antikoagulační látky je naprosto nevhodné nebo že pokud není možné vzorek dopravit do laboratoře bezprostředně po odběru, je možné jej skladovat bez ovlivnění dosažených výsledků minimálně 24 hodin a lépe při chladničkové teplotě (Satinská a kol., 2013). 2

I když je použití interferonového testu v intravitální diagnostice v terénní praxi nejvíce studováno u mykobakteriálních infekcí přežvýkavců, tyto infekce nejsou jedinou aplikací. Mezi další choroby, u nichž je možné použít interferonový test pro jejich diagnostiku nebo pro testování vyvíjených vakcín patří i některé infekce etiologie virové - bovinní virová diarrhea, slintavka a kulhavka, infekční bovinní rhinotracheitida (Pantarollo a kol., 2002; Parida a kol., 2006; Reber a kol., 2006) nebo například trichofytóza (Faldyna a kol., 2007; Lund a kol., 2001). Metodou volby pro detekci produkovaného IFN-γ je ELISA, která se skládá z následujících komponent: vazná monoklonální protilátka potřebná pro zachycení detekovaného IFN-γ v mikrotitrační destičce, křenovou peroxidázou konjugovaná polyklonální protilátka pro vizualizaci zachyceného IFN-γ a rekombinantní IFN-γ důležitý pro kvantifikaci. Obrázek 1 Schéma využití ELISA testu pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama v rámci tzv. interferonového testu (převzato z Faldyna, 2010) 2. Cíl metodiky Cílem metodiky bylo připravit klíčové komponenty pro sestavení a následnou validaci ELISA testu, který bude umožňovat kvantifikaci bovinního interferonu-gama. 3

3. Vlastní popis metodiky 3.1. Příprava komponent 3.1.1. Příprava rekombinantního IFN-γ (rboifn-γ) Zdrojem genetického materiálu pro expresi bovinního interferonu gama byla mrna ze stimulovaných lymfocytů skotu. Extrakce mrna byla provedena NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel) kitem. Izolovaná mrna byla následně přepsána do cdna a amplifikována pomocí specifických primerů kitem QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (Qiagen). Sekvence primerů byla navržena tak aby umožňovala klonování do pentr TM /SD/D-TOPO plazmidového vektoru (Invitrogen). Sekvence primerů použitá k amplifikaci boifn-γ genu byla: CACCTACTCCGGCCTAACTCTCTC sense primer AGGACCATTACGTTGATGCTCTCCG - antisense primer Klonování genu do plazmidového vektoru bylo provedeno dle návodu výrobce, vzniklá DNA konstrukcí byly transformovány kompetentní buňky E.coli, kmen TOP10 (Invitrogen). Následně byl genový fragment klonován do plazmidového vektoru pdest TM 17 Gateway Vector (Invitrogen) prostřednictvím rekombinační reakce zprostředkované enzymem LR Clonase TM II Enzyme Mix (Invitrogen). DNA insert byl umístěn v kontextu T7 transkripčních a translačních signálů a specifické sekvence kódující N-terminální polyhistidin. Exprese rekombinantního proteinu byla uskutečněna v bakteriálních buňkách E.coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen). Čerstvá noční kultura těchto buněk byla naředěna 1:50 ve 2L LB média suplementovaného ampicilinem (100 µg/ml) a kultivována při teplotě 37 C za neustálého třepání (250rpm) až do dosažení density OD 600 0.5. Indukce exprese proteinu byla uskutečněna přidáním IPTG do koncentrace 100mM po dobu 3 hodin. Poté byly buňky odstředěny (4500g /15 min) a sediment byl uchováván při teplotě -20 C až do další manipulace. Purifikace rboifn-γ byla provedena metalochelatační afinitní chromatografií za denaturačních podmínek. Buněčný pelet byl resuspendován ve 40ml denaturačního Tris pufru (20 mm Tris ph 7.8, 1 M NaCl, 0.1 % Tween 20, 5 mm Dithiothreitol, 8M močovina) s přídavkem 10mM Imidazolu. Buněčný pelet pak byl opakovaně zamražen a rozmražen a uvolněná buněčná DNA byla rozrušena sonikací za neustálého chlazení. Po odstředění byl bakteriální lyzát smíchán s Ni- NTA agarózou (Qiagen) ekvilibrovanou denaturačním pufrem a inkubován za neustálého míchání po dobu 45 minut. Následně byla agaróza s navázaným rekombinantním proteinem opakovaně promývána denaturačním pufrem s přídavkem 40mM Imidazolu s postupně klesající koncentrací močoviny a nakonec byl protein vytěsněn 10 ml Tris pufru bez močoviny s přídavkem 250mM Imidazolu. Výtěžek a čistota získaného proteinu byly analyzovány SDS-PAGE (obrázek 2), protein pak byl skladován při -20 C. 4

Obrázek 2 SDS-PAGE analýza rboifn-γ získaného metodou popsanou v kapitole 3.1.1. 3.1.2. Příprava monoklonální protilátky Myš BALBc byla imunizovaná vnitrosvalovou aplikací 80 μg rboifn-γ na kus s kompletním Freundovým adjuvans a 3x reimunizovaná vždy po 3 týdnech s inkompletním Freundovým adjuvans. Imunizovaná myš byla usmrcena zlomením vazu a byla z ní vyjmuta slezina. Z ní byly mechanicky pomocí jehly, stříkačky a monofilu vyizolovány buňky, které byly 2x propláchnuty v bezsérovém médiu RPMI 1640 (PAA). Poté byly tyto buňky resuspendovány ve stejném médiu a spočítány. Myelomové buňky Sp2/0 byly po kultivaci v kultivačních lahvích setřepány, následně 2x promyty ve stejném médiu a spočítány. Vlastní fúze proběhla mezi slezinnými a myelomovými buňkami v bezsérovém médiu a v přítomnosti polyethylenglykolu (Sigma). Byly provedeny fúze dvě, a to A a B. Poměr slezinných a myelomových buněk byl v případě fúze A 4,3 : 1, u fúze B 4,8 : 1. Po fúzi a následném propláchnutí byly zfúzované buňky resuspendovány v médiu se sérem, fúze A v 20 ml, fúze B v 55 ml. Tyto suspenze buněk byly přeneseny na 96-jamkové kultivační destičky s plochým dnem, a to v objemu 100 µl/jamka. Kultivace probíhala v termostatu při 37 C a 5% vlhkosti. Druhý den bylo do každé jamky přikápnuto 50 µl selekčního média HAT (Sigma), jehož účelem je přežití pouze tzv. hybridomů, tj. soubuní, které vzniklo buněčnou fúzí mezi slezinnými a myelomovými buňkami. Každé 3-4 dny byla provedena kompletní výměna média opět za selekční médium HAT. Za 14 dnů po fúzi byly hybridomy převedeny ze selekčního HAT média do média bez HAT. Průběžně bylo sledováno hynutí buněk, případně růst přeživších buněk, resp. kolonií buněk. Za 14 dní po fúzi proběhlo první testování supernatantů technikou ELISA a dot-blot (viz níže) na přítomnost protilátek specifických pro rboifn-γ. Celkem bylo provedeno 14 sérií testování nově narostlých buněk, tj. otestovány byly buňky z cca 600 jamek. Vybrané pozitivní hybridomy byly naklonovány a po testování a následném výběru byl finální vybraný hybridom namnožen in vivo intraperitoneální aplikací 2 mil. buněk, které předcházela intraperitoneální aplikací 500 μl minerálního oleje. Získaná ascitická tekutina byla otestována a pomocí (NH 4 ) 2 SO 4 z ní byla vysrážena γ-frakce, která byla dále purifikována přes protein G. Takto získaný protein byl následně použit k sestavení soupravy. 5

Použití laboratorních myší bylo povoleno rozhodnutím resortní komise Ministerstva zemědělství ČR MZe 1218 (VÚVeL, v.v.i. č. 63/2010) 3.1.3. Testování supernatantů metodou ELISA vazba antigenu - rboifn-γ naředěný na koncentraci 10 μg/ml ve vazném pufru o ph 9,6 byl napipetován do jamek mikrotitrační desky Maxisorp (Nunc) v objemu 100 μl / jamku - vazba přes noc při chladničkové teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 blokování nespecifických vazebných míst - napipetování roztoku PBS + 2% ovalbuminu + 10% sacharózy - inkubace po dobu 60 min při laboratorní teplotě - mechanické vyklepnutí desky a její vysušení aplikace testovaných supernatantů - aplikace neředěných testovaných supernatantů z buněk - aplikace pozitivní (myší sérum odebrané před fúzí) a negativní (myší sérum před aplikací rboifn-γ) kontroly ředěné 10.000x v ředícím roztoku (PBS+Tween 20 + kaseinový hydrolyzát) - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 aplikace sekundární protilátky - aplikace křenovou peroxidázou konjugované komerčně dostupné sekundární protilátky (Donkey anti-mouse IgG firmy Jackson ImmunoResearch) v objemu 100 μl/jamku v předem otestovaném ředění 5.000x v ředícím roztoku (PBS+Tween 20 + kaseinový hydrolyzát) - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 vizualizace reakce - aplikace TMB substrátu (Test Line) v objemu 100 μl /jamku - doba působení 15 30 min., - zastavení reakce přidáním 2M H 2 SO 4 v objemu 50 μl/jamku - měření výsledné absorbance při 450 nm pomocí multikanálového spektrofotometru Synergy H1 (BioTek) 3.1.4. Testování supernatantů metodou dot-blot vazba antigenu - aktivace PVDF membrány (Amersham Hybond P) jejím namočením v metanolu a promytím v H 2 O - rboifn-γ naředěný na koncentraci 25 μg/ml ve vazném pufru o ph 9,6 byl napipetován na membránu v objemu 2 μl / dot - paralelně byl na membránu napipetován přirozený IFN-γ (2 μl bovinního séra po in vitro stimulaci krevních mononukleárních buněk mitogenem Concanavalin A po dobu 20 hodin) - vysušení membrány blokování nespecifických vazebných míst - nanesení 5 % mléka 6

- inkubace po dobu 60 min při laboratorní teplotě - 3x opláchnutí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 aplikace testovaných supernatantů - aplikace neředěných testovaných supernatantů z buněk - aplikace pozitivní (myší sérum odebrané před fúzí) a negativní (myší sérum před aplikací rboifn-γ) kontroly ředěné 300x v ředícím roztoku (PBS+Tween 20 + kaseinový hydrolyzát) - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x opláchnutí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 aplikace sekundární protilátky - aplikace křenovou peroxidázou konjugované komerčně dostupné sekundární protilátky (Donkey anti-mouse IgG firmy Jackson ImmunoResearch) v ředění 1.000x v ředícím roztoku (PBS+Tween 20 + kaseinový hydrolyzát) - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x opláchnutí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 vizualizace reakce - aplikace DAB substrátu, tj. 8 mg DAB a 20 µl H 2 O 2 do 20 ml PBS (Test Line) - doba působení 15 30 min., - zastavení reakce přidáním 2M H 2 SO 4 v objemu 50 μl/jamku - analýza výsledné reakce odečtením prostým okem 3.1.5. Příprava polyklonální protilátky Králík byl imunizován podkožní aplikací 500 μg rboifn-γ na kus s kompletním Freundovým adjuvans a 2x reimunizován vždy po 3 týdnech s inkompletním Freundovým adjuvans. Králík byl v celkové anestezii vykrven a ze získaného séra byla γ-frakce vysrážena pomocí (NH 4 ) 2 SO 4. Tato byla dále purifikována pomocí proteinu G. Takto získaná protilátka byla konjugována křenovou peroxidázou pomocí LL-HRP Conjugation Kit firmy Innova Biosciences podle návodu výrobce. Specifita polyklonální protilátky byla ověřena technikou westerblot (obrázek 3). Použití laboratorních králíků bylo povoleno rozhodnutím resortní komise Ministerstva zemědělství ČR MZe 1217 (VÚVeL, v.v.i. č. 62/2010) Obrázek 3 SDS-PAGE analýza rboifn-γ získaného metodou popsanou v kapitole 3.1.1. A prázdná dráha; B pouze anti-králičí konjugát; C negativní králičí sérum; D, E a F pozitivní králičí sérum ředěné 1.000x, 500x a 100x. 7

3.2. Metodika ELISA reakce vazba primární monoklonální protilátky - γ-frakce získaná z ascitické tekutiny naředěná na koncentraci 0,6 μg/ml ve vazném pufru o ph 9,6 byla napipetována do jamek mikrotitrační desky Maxisorp (Nunc) v objemu 100 μl / jamku - vazba 72 hodin při chladničkové teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 blokování nespecifických vazebných míst - napipetování roztoku PBS + 2% ovalbuminu + 10% sacharózy - inkubace po dobu 60 min při laboratorní teplotě - mechanické vyklepnutí desky a její vysušení aplikace testovaného vzorku - aplikace testovaných vzorků do příslušných jamek - aplikace sestupně ředěného rboifn-γ - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 aplikace sekundární protilátky - aplikace křenovou peroxidázou konjugované připravené sekundární protilátky v objemu 100 μl/jamku v předem otestovaném ředění 1.000x v ředícím roztoku (PBS+Tween 20 + kaseinový hydrolyzát) s 5 % myšího séra - inkubace 60 min při laboratorní teplotě - 4x promytí v roztoku PBS + 0,05% Tween 20 vizualizace reakce - aplikace TMB substrátu (Test Line) v objemu 100 μl /jamku - doba působení 15 30 min., - zastavení reakce přidáním 2M H 2 SO 4 v objemu 50 μl/jamku - měření výsledné absorbance při 450 nm pomocí multikanálového spektrofotometru Synergy H1 (BioTek) 3.3. Validace ELISA reakce 3.3.1. Homogenita potažení mikrotitrační desky: Test byl proveden na jedné mikrotitrační desce dle pracovního postupu uvedeného v kapitole 3.2. Jako analyzovaný vzorek byl použit rboifn-γ o koncentraci 35 μg / ml. Vzhledem k okrajovému efektu nejsou do výpočtu zahrnuty hodnoty absorbancí krajních jamek desky. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulce 1. Výsledek validace je vyjádřen pomocí průměrné hodnoty absorbancí vyšetřovaného analytu, směrodatné odchylky a variačního koeficientu vyjádřeného jako %. 8

Tabulka 1: Výsledky testu homogenity potažení mikrotitrační desky 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,669 0,641 0,581 0,545 0,529 0,489 0,450 0,571 0,515 0,535 0,512 0,590 B 0,578 0,554 0,564 0,541 0,547 0,554 0,554 0,590 0,551 0,523 0,558 0,633 C 0,542 0,534 0,512 0,517 0,544 0,441 0,552 0,614 0,548 0,620 0,615 0,608 D 0,541 0,551 0,539 0,547 0,572 0,594 0,435 0,588 0,511 0,563 0,600 0,630 E 0,644 0,547 0,550 0,538 0,599 0,611 0,600 0,593 0,555 0,642 0,589 0,599 F 0,559 0,559 0,533 0,558 0,589 0,524 0,544 0,569 0,588 0,556 0,535 0,610 G 0,576 0,515 0,579 0,532 0,532 0,523 0,531 0,544 0,581 0,569 0,581 0,579 H 0,507 0,466 0,482 0,509 0,568 0,241 0,378 0,517 0,498 0,542 0,554 0,560 průměrná hodnota absorbance: 0,55665 směrodatná odchylka výběrová: 0,03703 variační koeficient (%): 6,652608 3.3.2. Opakovatelnost (intra-assay variability): Tento test byl proveden v jedné mikrotitrační desce se 4 různě koncentrovanými vzorky 17, 35, 50 nebo 100 μg rboifn-γ dle pracovního postupu uvedeného v kapitole 3.2. Pro každý vzorek byla vypočítána průměrná hodnota absorbance, směrodatná odchylka a variační koeficient (Tabulka 2). Výsledkem analýzy je variační koeficient pro celý rozsah měření. Tabulka 2: Výsledky testu opakovatelnosti (intra-assay variability): 17 μg 35 μg 50 μg 100 μg 1 2 3 4 5 6 7 8 A 0,098 0,092 0,603 0,554 0,796 0,893 1,458 1,370 B 0,102 0,105 0,709 0,610 0,886 0,878 1,358 1,356 C 0,131 0,143 0,719 0,593 0,886 0,891 1,541 1,386 D 0,153 0,110 0,786 0,599 0,940 0,955 1,487 1,434 E 0,126 0,137 0,692 0,633 0,933 0,954 1,473 1,451 F 0,130 0,198 0,704 0,633 0,954 0,867 1,500 1,470 G 0,138 0,148 0,634 0,622 0,857 0,927 1,362 1,379 H 0,113 0,143 0,599 0,572 0,823 0,842 1,454 1,434 Ø 0,1291 0,6413 0,8926 1,4320 SD 0,0264 0,0629 0,0486 0,0572 CV (%) 20,48 9,81 5,44 3,99 variační koeficient (%): 11,84642 9

3.3.3. Opakovatelnost (inter-assay variability): Tento test byl proveden v deseti mikrotitračních deskách se 4 různě koncentrovanými vzorky 17, 35, 50 nebo 100 μg rboifn-γ dle pracovního postupu uvedeného v kapitole 3.2. Testování bylo provedeno jako 10 samostatných analýz. Pro každý vzorek byla vypočítána průměrná hodnota absorbance, směrodatná odchylka a variační koeficient (Tabulka 3). Výsledkem analýzy je variační koeficient pro celý rozsah měření. Tabulka 3: Výsledky testu opakovatelnosti (inter-assay variability) číslo měření 17 μg 35 μg 50 μg 100 μg 1 0,306 0,594 0,808 1,367 2 0,302 0,583 0,789 1,255 3 0,300 0,633 0,753 1,280 4 0,319 0,587 0,853 1,275 5 0,279 0,613 0,751 1,249 6 0,294 0,629 0,808 1,266 7 0,305 0,597 0,707 1,245 8 0,334 0,642 0,642 1,216 9 0,354 0,585 0,824 1,298 10 0,278 0,584 0,870 1,291 11 0,330 0,602 0,796 1,341 12 0,272 0,595 0,813 1,282 13 0,337 0,587 0,850 1,262 14 0,302 0,580 0,790 1,273 15 0,249 0,580 0,813 1,231 16 0,281 0,607 0,768 1,232 17 0,281 0,556 0,799 1,367 18 0,297 0,586 0,798 1,222 19 0,279 0,607 0,755 1,190 20 0,328 0,635 0,721 1,041 21 0,291 0,525 0,780 1,112 22 0,315 0,550 0,756 1,021 23 0,287 0,534 0,703 0,964 24 0,386 0,640 0,638 1,029 25 0,334 0,609 0,759 1,061 26 0,349 0,543 0,725 1,067 10

27 0,397 0,630 0,750 1,108 28 0,419 0,509 0,681 1,223 29 0,384 0,581 0,797 1,049 30 0,421 0,524 0,699 1,065 31 0,408 0,504 0,781 1,030 32 0,380 0,528 0,675 1,052 33 0,324 0,554 0,796 1,270 34 0,292 0,610 0,886 1,356 35 0,274 0,593 0,886 1,286 36 0,297 0,599 0,840 1,134 37 0,291 0,633 0,733 1,251 38 0,315 0,633 0,754 1,170 39 0,247 0,622 0,857 1,179 40 0,280 0,572 0,823 1,234 průměrná hodnota absorbance: 0,3179 0,5868 0,7756 1,1961 směrodatná odchylka: 0,0468 0,0390 0,0584 0,1161 variační koeficient (%: 14,72 6,65 7,53 9,71 variační koeficient (%): 10,15033 4. Srovnání novosti postupů V současné době existuje na globálním trhu jediný kit pro detekci hovězího IFN-gama - BOVIGAM - který v roce 1988 uvedla australská firma CSL Ltd. Nicméně, tento test není kvantitativní. 5. Uplatnění funkčního vzoru ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama je možno využít v laboratoři autorů k výzkumným účelům. 6. Ekonomické aspekty Metoda je na pracovišti autorů zavedena. Její další případné komerční využití závisí na zájmu terénu o tuto metodu. Podle současného stupně poznání není možné ekonomické aspekty určit. 11

7. Seznam použité literatury Faldyna, M., Oborilova E, Krejci J. a kol. A correlation of in vitro tests for the immune response detection: a bovine trichophytosis model. Vaccine 2007; 25 (46): 7948-7954. Faldyna, M.: Interferonový test: od teorie do praxe. Veterinářství, 2010, 60 (9): 526-530 Gormley, E., Doyle, M.B., McGill, K., et al. The effect of the tuberculin test and the consequences of a delay in blood culture on the sensitivity of a gamma-interferon assay for the detection of Mycobacterium bovis infection in cattle. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004; 102 (4): 413-420. Lund, A., Bratberg, A.M., Solbakk, I.T. In vitro release of interferon-gamma by trichophytin-stimulated whole blood cell cultures from ringworm-vaccinated and control calves experimentally inoculated with Trichophyton verrucosum. Vet. Dermatol. 2001; 12 (2): 75-80. Murray, H.W. Interferon-gamma, the activated macrophage, and host defense against microbial challenge. Ann. Intern. Med. 1988; 108 (4): 595-608. Parida, S., Oh, Y., Reid, S.M. a kol. Interferon-gamma production in vitro from whole blood of foot-andmouth disease virus (FMDV) vaccinated and infected cattle after incubation with inactivated FMDV. Vaccine 2006; 24 (7): 964-969. Pontarollo, R.A., Babiuk, L.A., Hecker, R., Van Drunen Littel-Van Den Hurk, S. Augmentation of cellular immune responses to bovine herpesvirus-1 glycoprotein D by vaccination with CpG-enhanced plasmid vectors. J. Gen. Virol. 2002; 83 (12): 2973-2981. Reber, A.J., Tanner, M., Okinaga, T. a kol. Evaluation of multiple immune parameters after vaccination with modified live or killed bovine viral diarrhea virus vaccines. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2006; 29 (1): 61-77. Roberty, M.L., Bassett, H.F., Quinn, P.J., Davis, W.C., Monaghan, M.L. Effects of dexamethasone on cellmediated immune responses in cattle sensitized to Mycobacterium bovis. Am. J. Vet. Res. 1995; 56 (10): 1300-1306. Rothel, J.S., Jones, S.L., Corner, L.A., Cox, J.C., Wood, P.R.: A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-gamma and its use for the detection of tuberculosis in cattle. Aust. Vet. J. 1990; 67 (4): 134-137. Rothel, J.S., Jones, S.L., Conner, L.A., Cox, J.C., Wood, P.R. The gamma-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis in cattle: conditions affecting the production of gamma-interferon in whole blood culture. Aust. Vet. J. 1992; 69 (1): 1-4. Ryan, T.J., Buddle, B.M., De Lisle, G.W. An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing. Res. Vet. Sci. 2000; 69 (1): 57-61. Satinská, Z., Vicenová, M., Kudláčková, H., Kotlářová, E., Faldyna, M.: Praktické aspekty provedení interferonového testu. Veterinářství, 2013 63 (12): 913-916. Whipple, D.L., Bolin, C.A., Davis, A.J. et al. Comparison of the sensitivity of the caudal fold skin test and a commercial gamma-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis. Am. J. Vet. Res. 1995; 56 (4): 415-419. Whipple, D.L., Palmer, M.V., Slaughter, R.E., Jones, S.L. Comparison of purified protein derivatives and effect of skin testing on results of a commercial gamma interferon assay for diagnosis of tuberculosis in cattle. J. Vet. Diagn. Invest. 2001; 13 (2): 117-122. Wood, P.R., Corner, L.A., Rothel, J.S. a kol. Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis. Aust. Vet. J. 1991; 68 (9): 286-290. 8. Dedikace Funkční vzorek ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama byl vytvořen v rámci projektu Národní agentury zemědělského výzkumu (QI101A094), Ministerstva zemědělství České republiky (MZe 0002716202), projektu AdmireVet (CZ.1.05/2.1.00/01.0006, ED0006/01/01) a projektu CEITEC Středoevropského technologického institutu (CZ.1.05/1.1.00/02.0068). 12

Vydal: Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Hudcova 70, 621 00 Brno Název: ELISA test pro kvantifikaci bovinního interferonu-gama Autoři: MVDr. Martin Faldyna, Ph.D. Hana Kudláčková Eva Kotlářová MVDr. Zora Smržová Mgr. Radek Tesařík, Ph.D. Mgr. Jitka Janková, Ph.D. prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. 13