Komplement fixační antigen Influenza A (KF Ag Influenza A)

Komplement fixační antigen Influenza A (KF Ag Influenza A) OD - 109 Návod k použití soupravy VÝROBCE : VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II/365, Vestec, 252 42 Jesenice u Prahy, tel.: 261090565 www.vidia.cz 1. NÁZEV: Komplement fixační antigen Influenza A/H3N2 (KF Ag influenza A/H3N2) 2. POUŽITÍ: Influenza KF antigen je určen k důkazu a titraci IgG a IgM protilátek proti specifickým, strukturně konzervativním antigenům virů chřipky typu A/H3N2 ve vyšetřovaných sérech reakcí vazby komplementu. Průkaz protilátek proti influenza A KF antigenu v individuálním vzorku séra indikuje kontakt s virem nebo antigeny chřipky typu A v neurčitém čase. Sérokonverze nebo průkazný (nejméně čtyřnásobný) vzestup titru protilátek, prokázaný vyšetřením párových sér z akutní a rekonvalescentní fáze infekce v intervalu 2 3 týdny, indikuje recentní infekci nebo postvakcinační protilátkovou odezvu. Influenza A KF antigen obsahuje aktuálně cirkulující subtypy. 3. SLOŽENÍ PŘÍPRAVKU 1,0 ml částečně purifikované směsné suspenze formaldehydem inaktivovaného viru chřipky typu A aktuálních subtypů v alantoidní tekutině kuřecích embryí, konzervované glycerolem. Upozornění: přes průkazné snížení obsahu infekčních částic viru v přípravku je nutno při práci dodržovat předpisy BOZP pro práci s infekčním (biologicky nebezpečným) materiálem podle čl. 8. 4. OBSAH BALENÍ KF Ag Influenza A/H3N2, 1 ml 1 lahvička Pracovní ředění:minim. 1:32 Pozn.: pracovní ředění antigenu je uvedeno na štítku lahvičky. 5. LABORATORNÍ POTŘEBY, ZAŘÍZENÍ A REAGENCIE POTŘEBNÉ NA PROVEDENÍ REAKCE VAZBY KOMPLEMENTU MIKROMETODOU Mikrotitrační destičky typu U (96 x 300 μl) s víčky Automatické mikropipety10 50 μl, 25-1000 μl, příslušné špičky Automatická mikropipeta 8-12-kanálová 25 50 μl Vaničky na reagenční roztoky k vícekanálovým mikropipetám Eppendorfky 1,5 ml, stojan Sérologická třepačka Centrifuga laboratorní s výkyvným rotorem ( do 3 000 ot/min resp 1 500 x g) Kyvety centrifugační graduované Laminární box Chlazená pracovní deska (např. mrazicí vložkou ICE BOX) Termostat 37 C Chladnička +2 až +10 C Veronalový pufr ph 7,3-7,4 (VP) Hemolytický systém (Beraní nebo ovčí krev v Alseverově roztoku sterilní + amboceptor hemolytický) Komplement morčecí (alexin) Kontrolní a vyšetřovaná lidská séra Destilovaná voda 1

6. PRACOVNÍ POSTUP Upozornění: přesné dodržení pracovního postupu je jedním z předpokladů platnosti a reprodukovatelnosti výsledků! 6.1. Příprava reagencií 6.1.1. Příprava pracovního ředění KF antigenu - Pracovní ředění antigenu stanovené výrobcem je uvedeno na štítku lahvičky. Antigen se ředí v uvedeném poměru přidáním Veronalového pufru (VP). Např. při udaném ředění 1:16 se přidá ke 160 μl VP 10 μl KF antigenu. - Uchovávání naředěného antigenu: ve tmě při teplotě +2 až +10 C. - Použitelnost naředěného antigenu: 24 hodin 6.1.2. Příprava 2 % (V/V) suspenze beraních erytrocytů Pozn: Připravuje se v případě, že nepoužíváte Hemolytický systém r.t.u. - Beraní krev se odebere asepticky do sterilního Alseverova roztoku v poměru 1:1 (V/V) za důkladného míchání. Uchovává se, rozdělena na alikvoty vhodného objemu pro jednorázové použití, v chladničce při teplotě +2 až +10 C nejdéle po dobu 1 měsíce. - Před použitím se odsaje plazma nad sedimentem krvinek. Sediment se resuspenduje ve VP na dvojnásobek původního objemu krve v Alseverově roztoku. Provede se centrifugace 10 min v chlazené centrifuze při 2000 ot/min (1 000 x g!). Supernatant i případný buffy coat se odsávají. Resuspendování sedimentu a následná centrifugace se provede celkem 3x. Poslední centrifugaci je vhodné provést v přesně graduované kyvetě. Sediment krvinek se resuspenduje ve VP na koncentraci zásobní suspenze krvinek 10 % (V/V). Ze zásobní suspenze se připraví potřebný objem pracovní suspenze krvinek 2 % (V/V) ve VP. Pozn.: koncentraci pracovní suspenze krvinek se doporučuje standardizovat kolorimetricky vhodým interním postupem. - Uchovávání: při teplotě +2 až +10 C. - Použitelnost: zásobní i pracovní suspenze krvinek se použijí nejpozději následující den po přípravě. Pro delší skladování lze zásobní suspenzi krvinek stabilizovat směsí vhodných antibiotik. 6.1.3. Příprava zásobního roztoku amboceptoru Pozn. Použije se na přípravu hemolytického systému bod 6.2.2 d) - Amboceptor hemolytický - hemolyzin (protilátky proti erytrocytům) např. fy Sevapharma a.s. (lyofilizovaný) se rozpustí přidáním destilované vody do lahvičky podle návodu k použití. - Zásobní roztok se připraví za sterilních podmínek ředěním amboceptoru v poměru 1: 100 přidáním 100 ml sterilního VP. - Uchovávání: ve tmě při teplotě +2 až +10 C. - Použitelnost: 6 měsíců při zachování sterility roztoku zásobního roztoku sterilními odběry. Pracovní ředění amboceptoru viz Příprava hemolytického systému bod 6.2.2.d) 6.2. Titrace komplementu v přítomnosti antigenu Provádí se pro každou šarži komplementu, KF antigenu nebo amboceptoru. Cílem je stanovit titr resp. vhodné ředění komplementu do vlastní KF reakce a potvrdit použité pracovní ředění amboceptoru. Upozornění: komplement je termolabilní komplex. Při rozpouštění lyofilizátu a ředění je nutno používat vychlazené roztoky, ledovou lázeň pro ředění a vhodným způsobem chlazenou pracovní plochu! 6.2.1. Ředění komplementu - Lyofilizát morčecího komplementu (alexinu), např. výrobce Sevapharma se rozpustí přidáním předepsaného objemu ledové destilované vody. - Těsně před použitím se připraví ředicí řada komplementu (K) 1:10 až 1:120 v ledovém VP např. podle uvedeného schématu (v Eppendorfkách 1,5 ml, umístěných na chlazené pracovní desce): Ředění K (1: ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 K (μl) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 2

VP (μl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 6.2.2 Vlastní titrace komplementu v přítomnosti KF antigenu a) Uspořádání titrace na mikrotitrační destičce U se volí a označí takto: Řada A: titrační řada komplementu v přítomnosti antigenu. Ředění komplementu 1:10 až 1:120. Řada B: stejné uspořádání jako řada A (paralela). Řada C: titrační řada komplementu bez přítomnosti antigenu pro kontrolu antikomplementarity KF antigenu. Řada D: 4 jamky pro kontrolu hemolytického systému ( bez antigenu a komplementu). b) Aplikace reagencií - Mikrotitrační destička se umístí na chlazenou pracovní desku. - Do všech jamek řad A a B se pipetuje po 25 μl VP, do všech jamek řady C po 50 μl VP, do čtyř jamek řady D po 75 μl VP. - Do jamek řad A a B se pipetuje po 25 μl KF antigenu v pracovním ředění (bod 6.1.1). - Komplement v ředěních 1:10 až 1:120 se pipetuje po 25 μl do použitých jamek řad A, B a C sloupců 1 až 12. Ředění 1:10 do jamek A1,B1,C1 atd. až ředění 1:120 do jamek A12, B12, C12. Destička se uzavře víčkem. c) Inkubace - Inkubuje se v chladničce při teplotě +2 C až +10 C po dobu 16 20 h (přes noc). INKUBACE 2. den: d) Příprava hemolytického systému (HS) - HS se připraví těsně před jeho jednorázovým použitím. - Ze zásobního roztoku amboceptoru (1:100), bod 6.1.3, se připraví jeho pracovní ředění rovno dvěma jednotkám podle titru udaného výrobcem: Pracovní ředění amboceptoru = 2 jednotky = ( 1/2. titr amboceptoru ) : 100 Příklad: Titr amboceptoru udaný výrobcem..1 : 6000 Pracovní ředění = 2j. = (1/2. 6000) : 100 = 30. Ze zásobního ředění připravíme amboceptor v pracovním ředění (1 díl zásobního roztoku + 29 dílů VP) - Do zkumavky se pipetuje 2% suspenze beranních krvinek a přidá se stejný objem roztoku amboceptoru v pracovním ředění (2 j.). Potřebný objem hemolytického systému = počet použitých reakčních jamek x 50 μl. - Suspenze se dokonale promíchá a inkubuje se v termostatu při teplotě 37 C po dobu 30 min. Po ukončení inkubace se promíchá a ihned aplikuje. e) Aplikace hemolytického systému (HS) - Destička po inkubaci se vytemperuje 10 minut při pokojové teplotě. - Do všech použitých jamek včetně jamek kontrol HS se pipetuje po 50 μl čerstvě připraveného hemolytického systému. Obsah jamek se dokonale promíchá protřepáním destičky pomocí sérologické třepačky. Destička se přikryje víčkem. f) Inkubace, ukončení inkubace - Inkubuje se v termostatu při teplotě 37 C po dobu 30 min. Po uplynutí 15 min inkubace se destička protřepe. - Po uplynutí celé inkubace se destička protřepe. Sedimentace krvinek se dosáhne buď: -centrifugací destičky v nosiči po dobu 5 min při 200 x g nebo -uložením destičky při teplotě +2 C až +10 C po dobu nejméně 2 h. - Výsledek se odčítá po sedimentaci krvinek uvedenými postupy ihned, nejpozději však do 2 h při uchovávání zakryté destičky při teplotě +2 až +10 C. 3

6.2.3. Hodnocení výsledku titrace komplementu v přítomnosti antigenu a) Hodnocení a odečet výsledku titrace Hodnotí se stupeň hemolýzy v závislosti na ředění komplementu. Stupeň hemolýzy resp. mohutnost sedimentu krvinek v každé reakční jamce se zaznamená pomocí užívané symboliky: 0 nebo - : bez sedimentu, úplná hemolýza. Čirý, hnědočervený roztok hemoglobinu. 1 nebo + : asi 25 % krvinek v malém zřetelném sedimentu. Čirý, načervenalý roztok hemoglobinu. 2 nebo ++ :asi 50 % krvinek tvoří sediment,. Čirý, růžový roztok hemoglobinu. 3 nebo +++ : asi 75 % krvinek tvoří mohutný sediment. Čirý, zřetelně narůžovělý roztok hemoglobinu. 4 nebo ++++ : 100 % krvinek v mohutném sedimentu. Čirý bezbarvý roztok nad sedimentem. b) Závěr Hodnotí se a odečítá: 1. Titr komplementu v přítomnosti pracovního ředění KF antigenu ( řady A,B): Titr komplementu je jeho nejvyšší ředění, které vyvolá úplnou hemolýzu (hodnocení 0 ). Jedna jednotka komplementu je obsažena v objemu 25 μl komplementu, v ředění rovném jeho titru. Pracovní ředění komplementu je rovno dvěma jednotkám komplementu. Do vlastní KF reakce při vyšetřování sér se použijí 2 jednotky komplementu v objemu 25 μl, tzn. komplement v ředění 2 x nižším než jeho titr. 2. Titr komplementu b e z přítomnosti KF antigenu ( řada C): Rozdíl titru komplementu, odečteného v řadách A,B (v přítomnosti antigenu) a v řadě C (bez antigenu) je mírou antikomplementárních vlastností KF antigenu. 3. Kontrola hemolytického systému (řada D): Krvinky v jamkách kontroly HS mají vykazovat úplnou sedimentaci bez stop hemolýzy (++++). 6.3. Titrace sér reakcí vazby komplementu Pozn.: výsledky jsou známy za 23 30 hodin Potřebné reagencie: - KF antigen v pracovním ředění použitém při titraci komplementu - komplement v pracovním ředění (2 jednotky) - hemolytický systém připravený podle bodu 6.2.2.d) - vyšetřovaná a kontrolní séra v pracovním ředění 6.3.1. Zásady pro sběr a uchovávání vyšetřovaných sér - Lidská krev a její deriváty se považují za potenciálně infekční (biohazard) materiál. - Pro vyšetření nejsou vhodná séra hemolytická, lipemická, ikterická a mikrobiálně kontaminovaná. - Séra se uchovávají při teplotě +2 až +10 C po dobu nejvýše 48 h, resp. při teplotě 20 C a nižší jestliže je časová prodleva mezi odběrem krve a vyšetřením séra delší než 48 h. Opakované zmrazování a rozmrazování sér může způsobit degradaci protilátek. - Párová séra z akutní a rekonvalescentní fáze se odebírají v intervalu 14 dní. Akutní sérum musí být odebráno v časné akutní fázi. Párová séra se vyšetřují paralelně. 6.3.2. Inaktivace vyšetřovaných a kontrolních sér - Doporučujeme zařadit do souboru vyšetřovaných sér vlastní kontrolní sérum se známým titrem KF protilátek. - Séra se inaktivují ve vodní lázni při teplotě 56 C po dobu 30 min. 6.3.3. Ředění vyšetřovaných a kontrolních sér - Inaktivovaná séra se ředí v poměru 1: 8 (V/V) ve VP mimo destičku. 4

Ředění 1:8 je výchozím ředěním sér pro titraci, obvyklým ředěním při screeningu sér a ředěním kontroly antikomplementarity sér ( KoAS - bez přítomnosti antigenu v reakci). - Séra se dále ředí ve VP dvojkovou řadou přímo v jamkách mikrotitrační destičky. 6.3.4. Doporučené schéma uspořádání titrace 11 sér včetně kontrol reakce Pozn.: Doporučujeme zařadit jedno sérum se známým titrem KF protilátek jako kontrolní. Ko Ředicí řady sér 1 až 11 AS 1 : 1:8 8 16 32 64 128 256 512 H G F E D C B A 1 2 3 Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 2 J 2 J 1 J 1 J 0,5 J 0,5 J KoHS Kontrola jednotek Kontrola komplementu hemolytického systému 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sérum 4 Sérum 5 Sérum 6 Sérum 7 Sérum 8 Sérum 9 Sérum 10 Sérum 11 Kontroly komplementu (2-1 0,5 jednotky ) a hemolytického systému 6.3.5. Aplikace a ředění vyšetřovaných sér včetně kontrol POZOR - popis se vztahuje na destičku orientovanou podle uvedeného schématu! V uvedeném pořadí se pipetují: - VP: po 25 μl do jamek F až A ředicích řad sér 1 až 11. Prvé dvě jamky H,G každé ředicí řady zůstanou prázdné. - Vyšetřovaná séra (1:8) : po 25 μl do prvých tří jamek H,G,F každé ředicí řady séra. Pomocí vícekanálové pipety se séra ředí dvojkovou řadou postupným přenášením 25 μl ze sloupce F (1:16) do sloupce A (1:512). - VP: po 25 μl do šesti jamek kontroly jednotek komplementu řady 12 a po 75 μl do jamek kontroly hemolytického systému (KoHS) řady 12. 6.3.6. Aplikace antigenu Pracovní ředění antigenu se připraví podle bodu 6.1.1. Pipetuje se: 5

- Po 25 μl do všech použitých jamek G až A včetně jamek kontrol jednotek komplementu, s výjimkou jamek kontroly hemolytického systému řady 12 (zde je VP místo antigenu). Do sloupce H se antigen neaplikuje, slouží jako kontrola antikomplementarity séra. - Obsah jamek se dokonale promíchá protřepáním destičky. 6.3.7. Ředění a aplikace komplementu Důležité upozornění: použijí se vychlazené roztoky, laboratorní potřeby a chlazená pracovní deska nebo ledová vodní lázeň. Použije se komplement v pracovním ředění. Pracovní ředění komplementu se stanoví na základě výsledku titrace komplementu v přítomnosti antigenu (bod 6.2.). Pracovní ředění komplementu ve VP (2 J = 2 jednotky komplementu) se připraví těsně před použitím. Současně se připraví z pracovního ředění komplementu (2 J) ředění 1 J a 0,5 J ve VP (pro kontrolu jednotek komplementu) : 0,1 ml komplementu 2 J + 0,1 ml VP. 0,2 ml komplementu = 1 J 0,1 ml komplementu 1 J + 0,1 ml VP. 0,2 ml komplementu = 0,5 J Pracovní ředění 2 J komplementu se pipetuje: - po 25 μl do všech jamek titračních řad sér a - po 25 μl do dvou jamek H,G řady 12 kontroly 2 J komplementu. Kontrolní ředění 1 J komplementu se pipetuje: - po 25 μl do dvou jamek F,E řady 12 kontroly 1 J komplementu. Kontrolní ředění 0,5 J komplementu se pipetuje: - po 25 μl do dvou jamek D,C řady 12 kontroly 0,5 J komplementu. Pozn.: do jamek kontroly hemolytického systému řady 12 se komplement nepřidává! - Obsah jamek se dokonale promíchá protřepáním destičky. Destička se překryje víčkem. 6.3.8. Inkubace - Inkubuje se v chladničce při teplotě +2 C až +10 C po dobu 16 20 h (přes noc). INKUBACE 2. den: 6.3.9. Příprava hemolytického systému (HS) Postupuje se podle bodu 6.2.2. d). 6.3.10. Aplikace hemolytického systému (HS) HS se pipetuje se po 50 μl na jamku do všech jamek - postupuje se podle bodu 6.2.2. e). 6.3.11. Inkubace, ukončení inkubace Postupuje se podle bodu 6.2.2. f). 6.3.12. Záznam, hodnocení a validace výsledku titrace sér a) Záznam: Záznam výsledku KFR titrace sér se provede pomocí užívané symboliky ( viz bod 6.2.3. a). b) Hodnocení: Titr specifických komplementfixačních protilátek v séru je roven nejvyššímu ředění séra, ve kterém je vazba 6

komplementu hodnocena nejméně +++ (tj. v reakční jamce tohoto ředění séra je lyzováno maximálně 25 % krvinek). Vyšetřované sérum s titrem specifických protilátek nejméně 1:8 se považuje za pozitivní. Za slabě ( ) pozitivní se považuje sérum, které v ředění 1:8 slabě váže komplement (+/++). Za negativní se považuje sérum, které v ředění 1:8 neváže komplement ( 0 resp. úplná hemolýza). c) Validace výsledku titrace sér: - Kontrola antikomplementarity séra (v ředění 1:8, bez antigenu) musí být negativní ( 0 resp. úplná hemolýza). Přítomnost sedimentu nelyzovaných krvinek indikuje nedostatek komplementu v reakční jamce v důsledku jeho vazby se sérem a možnost falešné pozitivity séra. Průkazné stanovení protilátek antikomplementárních sér v KFR není možné. - Kontrola hemolytického systému ( bez séra, antigenu a komplementu ) musí být pozitivní (++++ resp. úplná sedimentace krvinek bez hemolýzy). Amboceptor (hemolyzin) bez přítomnosti komplementu nesmí způsobit ani částečnou lýzu krvinek. - Kontrola komplementu (bez séra) musí být v ředění komplementu: Hodnocena: 2 J 0 1 J + 0,5 J +++/++++ Nadbytek/nedostatek komplementu v použitém pracovním (2 J) ředění snižuje/zvyšuje odečtené hodnoty titrů protilátek v sérech oproti skutečnosti. - Kontrolní pozitivní sérum (interní kontrola, vlastní sérum se známým titrem KF protilátek, titrované paralelně s vyšetřovanými séry): kontrola antikomplementarity séra (v ředění 1:8, bez antigenu) musí být negativní, odečtený titr kontrolního séra se nesmí lišit od jeho stanoveného (známého) titru. 6.3.13. Interpretace výsledků skríningového nebo titračního vyšetření sér 1. KFR detekuje IgG i IgM izotypy protilátek. 2. Séra, hodnocená 0 v základním ředění 1:8 se považují za negativní. 3. Séra, hodnocená + nebo ++ v základním ředění 1:8 se považují za slabě pozitivní s titrem protilátek 1:8 ( ). 4. Séra s titrem 1:8 a vyšším se považují za pozitivní (+) s titry 1:8 (+) a vyššími.. 6.3.14. Interpretace výsledků vyšetření párových sér Výsledek vyšetření (titr) séra Interpretace výsledku akutního rekonvalescentního ( ) ( ) Bez přítomnosti KF protilátek proti Infl A. Etiologie onemocnění nemá spojitost s chřipkou A. ( 1:8 ) (1:8 ) Suspektní přítomnost velmi nízké hladiny KF protilátek proti chřipce A. ( ) (1:8 ) Suspektní sérokonverze. Doporučuje se provést třetí odběr séra a paralelní vyšetření odběrů. ( ) Titry (1:8 +) Sérokonverze. Indikuje primoinfekci nebo recentní resp. probíhající infekci chřipkou A, popř. pozitivní postvakcinační protilátkovou odpověď. Titr (1:8 +) Titr ekvivalentní Indikuje stav po infekci v minulosti v neurčitém čase. 7

Titr (1:8 +) Titr vyšší než Vzestup titru indikuje právě probíhající u akutního séra infekci resp. A-chřipkovou etiologii onemocnění. Za průkazný se považuje nejméně čtyřnásobný vzestup titru. 7. DIAGNOSTICKÁ OMEZENÍ Výsledek vyšetření séra z jednoho odběru není průkazný pro stanovení etiologie onemocnění. K validnímu průkazu nebo vyloučení etiologie onemocnění je nutno použít co nejúplnější spektrum laboratorních diagnostických metod. Detekční mez KF reakce může být nízká pro průkaz postvakcinačních protilátek. 8. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY Influenza A KF antigen je určen pouze pro in vitro diagnostické účely. Přípravek se považuje za infekční materiál. Vyšetřovaná lidská séra (resp. krev a její deriváty) se považují za infekční materiál. Při jakékoliv manipulaci s antigenem a lidskými séry (krví, plazmou) je nutno dodržovat hygienický a sanitační režim infekčního úseku pracoviště, zejména: - Při práci nejíst, nepít, nekouřit, používat ochranný oděv pomůcky gumové rukavice a roušku. - Nepipetovat ústy - používat výhradně vhodná pipetovací zařízení, - Po ukončení práce pracovní plochu, veškeré použité laboratorní sklo, pomůcky a potřeby desinfikovat pomocí účinného desinfekčního prostředku, - s odpady nakládat podle čl. 9. 9. NAKLÁDÁNÍ S ODPADY 9.1. Nakládání s odpady vzniklými použitím přípravku podle návodu Nakládání s odpady se řídí vyhl. MŽP č. 41/2005 Sb., kterou se mění vyhláška MŽP č. 383/2001 Sb., o podrobnostech nakládání s odpady. Druh odpadu Kód a kategorie Doporučený způsob zneškodnění druhu odpadu Slitý obsah reakčních jamek mikrotitrační destičky 180103 N Desinfekce (Incidur 2%/2 h) po dokončení KFR a autoklávování ( minim. 170 kp/30 min) Mikrotitrační destička (PS) použitá 180103 N Separace ve vhodném kontejneru na a použité špičky mikropipet infekční odpad, likvidace akreditovanou firmou. 9.2. Nakládání s obalovými odpady podle ČSN 770052-2 a vyhl.mžp č.41/2005 Sb. Lahvičky jsou považovány za infekční odpad. Před likvidací dekontaminovat 2% roztokem Incidur, případně autoklávovat při 120 C minimálně 30 minut. Separovat ve vhodném kontejneru na infekční odpad.. 10. SKLADOVÁNÍ A EXSPIRACE Přípravek skladovat při teplotě +2 až +10 C. Za této podmínky je exspirace uvedena na štítku lahvičky. Sediment, který se může utvořit na dně lahvičky, nemá vliv na funkčnost komplement fixačního antigenu. Lze jej odstranit mírným protřepáním lahvičky. Přípravek je dodáván chlazený v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá vliv na exspiraci. Datum poslední revize tohoto návodu: 07/2015 8

9