L. acidophilus_(psmm _ TIDE):

L. acidophilus_(psmm _ TIDE): 2010-04-06 Ivo Sedláček a Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů Přírodovědecká fakulta MU Tvrdého 14, 602 00 Brno Projekt FI-IM5/205

problematika taxonomie Polyfázová taxonomie -taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami -obsahuje dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup tzv. polyphasic approach Fylogenetická klasifikace v fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie a o chemotaxonomické údaje vpopis mnoha nových taxonů X co identifikovat? v identifikace taxonu X mobilní genetické elementy (bakteriofágy, ostrovy patogenity, chromozomové kazety, plazmidy), exoproteiny - genetický polymorfismus

problematika taxonomie DNA Celková DNA: % obsah G+C restriční profil (RFLP, PFGE) velikost genomu DNA reasociace Úseky DNA: PCR metody (rep-pcr, RAPD, AFLP) ribotypizace DNA sondy DNA sekvencování RNA RNA sekvencování analýza nízkomolekulárních RNA Polyfázová taxonomie, fylogenetická příbuznost plazmidová DNA Chemotaxonomické znaky mastné kyseliny (FAME) mykolové kyseliny polární lipidy chinony Proteiny elektroforetický profil celobuněčných peoteinů enzymový profil (MLEE) Fenotyp morfologie biochemie a fyziologie (API, Biolog) sérologie www.bacterio.cict.fr

Lactobacillus acidophilus komplex Lactobacillus =130 taxonů probiotická mikroflóra;?patogenita? L. acidophilus ústa, trávicí trakt, vagina L. acidophilus sensu stricto L. acidophilus sensu lato (obligátně homofermentativní) v velice rozsáhlá skupina bakterií: L. acidophilus sensu stricto, L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii (Fujisava et al., 1992); L. jensenii (Gasser et al., 1970) v fylogeneticky příbuzné x fenotypově podobné v L. acidophilus sensu lato - vaginální sliznice?!

Lactobacillus acidophilus komplex v externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace v cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu v 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO 2 /anaerobně, 36,5 C) v presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG 5 ) spolehlivá identifikace LAB

Lactobacillus acidophilus komplex: rep-pcr Shluk I in house databáze > 1600 LAB Shluk II Neprůkazné pro L. acidophilus komplex Shluk IIIa

Lactobacillus acidophilus komplex v externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace v cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu v 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO 2 /anaerobně, 36,5 C) v presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG 5 ) 24 izolátů L. acidophilus sensulato (20 žen) biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně) ribotypizace (RiboPrinter) MALDI-TOF MS

Lactobacillus acidophilus komplex: biotypizace API Kmen API 50CH ID Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID 01A L. acidophilus komplex 03A L. acidophilus 04A L. acidophilus komplex 06A L. acidophilus komplex 10A L. acidophilus 10E/1 L. brevis 11A L. crispatus výborná, dobrá ID: 10 11B L. acidophilus komplex nejistá, nepřijatelná ID: 14 14C/2 L. crispatus 15B L. crispatus 17A L. crispatus 18C L. acidophilus komplex 19A L. acidophilus 19C L. acidophilus 21A L. acidophilus komplex? růst při 45 C? 22A L. acidophilus variabilní bioprofil 28A L. acidophilus komplex 29B L. acidophilus 30B L. acidophilus 30C Lactobacillus sp. 32A L. acidophilus 33A L. acidophilus komplex 34A L. acidophilus 35A L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus komplex: rozšířená biotypizace Kmen API 50CH ID Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID 01A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 03A L. acidophilus L. gasseri 04A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 06A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 10A L. acidophilus L. acidophilus 10E/1 L. brevis Lactobacillus sp. 11A L. crispatus L. gasseri 11B L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 14C/2 L. crispatus L. gasseri 15B L. crispatus L. gasseri 17A L. crispatus L. acidophilus komplex 18C L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 19A L. acidophilus L. acidophilus komplex 19C L. acidophilus L. gasseri 21A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 22A L. acidophilus L. gasseri 28A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 29B L. acidophilus L. acidophilus komplex 30B L. acidophilus L. acidophilus komplex 30C Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. 32A L. acidophilus L. acidophilus komplex 33A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex 34A L. acidophilus L. gasseri 35A L. acidophilus L. acidophilus komplex 4% NaCl

Lactobacillus acidophilus komplex: dendrogram biotypizace 01A 06A 28A 04A 18C 32A 11B 21A 29B 35A 19A 10A 30B 17A 33A 03A 22A 14C/2 15B 11A 19C 34A 30C 10E/1 0% 10% 20% 30% Linkage Distance

Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter profil 1. (a) phes sekvencování profil 2.a L. gasseri profil 2.b

Lactobacillus acidophilus komplex: RiboPrinter Kmen API 50CH ID Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID 01A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 03A L. acidophilus L. gasseri L. gasseri 04A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 06A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 10A L. acidophilus L. acidophilus NI 10E/1 L. brevis Lactobacillus sp. NI 11A L. crispatus L. gasseri NI 11B L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 14C/2 L. crispatus L. gasseri NI 15B L. crispatus L. gasseri NI 17A L. crispatus L. acidophilus komplex NI 18C L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 19A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI 19C L. acidophilus L. gasseri NI 21A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 22A L. acidophilus L. gasseri NI 28A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 29B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI 30B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI 30C Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. NI 32A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI 33A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI 34A L. acidophilus L. gasseri NI 35A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI

Lactobacillus acidophilus komplex v externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace v cílená izolace L. acidophilus ze stěrů z cervixu v 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO 2 /anaerobně, 36,5 C) v presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG 5 ) 24 izolátů L. acidophilus sensu lato (20 žen) biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně) ribotypizace (RiboPrinter) MALDI-TOF MS 7 izolátů L. acidophilus sensu lato sekvencování phes genu

Lactobacillus acidophilus komplex: ribotypizace (a) phes sekvencování

Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS K`bsna`bhkktr K`bsna`bhkktr 0/ @^/8/ 804 10@ 10@ 00A 24@ 22@ 21@ 07B 08@ 0/ @ 00A /5@ 18A 10@ 2/ A /3@ 17@ 06@ 08@ /0@ K`bsna`bhkktr 23@ 03B^1 04A 11@ 11@ 11@ 08B 00@ K`bsna`bhkktr /2@ 2/ B K`bsna`bhkktr 0/ D^0 0/ // 8/ / 7/ / 6/ / 5/ / 4/ / Chrs`mbd 3/ / 2/ / 1/ / 0/ / /

Lactobacillus mucosae: MALDI-TOF MS x104 Intens. [a.u.] 1.0 4706 isolate 10E/1 0.8 0.6 0.4 0.2 4491 5135 3145 2742 3996 5304 6312 2352 3421 6842 7989 9403 7450 0.0 x104 Intens. [a.u.] 1.5 4706 L. mucosae CCDM 690 T 1.0 0.5 5136 2350 3144 4492 5304 2739 3687 3994 6313 6844 9406 7453 7990 0.0 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/z Fig. 2: Comparison between MALDI-TOF mass spectra of isolate 10E/1 identified as L. mucosae and the corresponding reference strain L. mucosae CCDM 690 T.

Lactobacillus acidophilus komplex: MALDI-TOF MS Kmen API 50CH ID Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID 01A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 03A L. acidophilus L. gasseri L. gasseri L. gasseri 04A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus 06A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus 10A L. acidophilus L. acidophilus NI L. crispatus 10E/1 L. brevis Lactobacillus sp. NI L. mucosae 11A L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii 11B L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus 14C/2 L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii 15B L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii 17A L. crispatus L. acidophilus komplex NI L. crispatus 18C L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 19A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus 19C L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii 21A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 22A L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii 28A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus 29B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 30B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 30C Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. NI L. frumenti 32A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 33A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) 34A L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii 35A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) (a) profil podobný L. ultunensis

Lactobacillus acidophilus komplex: finální identifikace Kmen API 50CH ID Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID 01A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus 03A L. acidophilus L. gasseri L. gasseri L. gasseri L. gasseri 04A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus (b) 06A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus 10A L. acidophilus L. acidophilus NI L. crispatus L. crispatus 10E/1 L. brevis Lactobacillus sp. NI L. mucosae L. mucosae 11A L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii (b) 11B L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus 14C/2 L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii 15B L. crispatus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii 17A L. crispatus L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus (b) 18C L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus (b) 19A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus 19C L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii 21A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus (b) 22A L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii (b) 28A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus L. crispatus 29B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus 30B L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus 30C Lactobacillus sp. Lactobacillus sp. NI L. frumenti L. vaginalis (b) 32A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus 33A L. acidophilus komplex L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus 34A L. acidophilus L. gasseri NI L. jensenii L. jensenii 35A L. acidophilus L. acidophilus komplex NI L. crispatus (a) L. crispatus (a) profil podobný L. ultunensis (b) sekvencování phes Finální ID = fenotypizace + shluková analýza ribotypizace + MALDI-TOF MS

Lactobacillus acidophilus komplex 24 studovaných izolátů z cervixu: L. crispatus (63%) L. jensenii (25%) L. gasseri, L. mucosae, L. vaginalis L. acidophilus sensu stricto MALDI-TOF MS ribotypizace biotypizace?databáze?

Děkuji za pozornost