DERIVATIZACE V HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII

Škola MS. Derivatizace DERIVATIZACE V HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRII Petr ŠIMEK Biologické centrum AV ČR, v.v.i. Laboratoř analytické biochemie Branišovská 31 CZ 370 05České Budějovice simek@bclab.eu, www.bclab.eu 1

Škola MS. DERIVATIZACE P. Simek as a lecturer at the Mass Spectrometric School, Seč, September 15-17

Škola MS. DERIVATIZACE 1. Definice derivatizace Cílená přeměna analytu A-X chemickou reakcí jeho reaktivní funkční skupiny s vhodným činidlem D-R na produkt (derivát) A-R s požadovanými fyzikálně-chemickými vlastnostmi A-X + D-R A-R + D-X Derivatizační technika ucelená strategie přípravy analytu pro jeho analýzu specifickou instrumentální analytickou technikou 3

Škola MS. Derivatizace 2. MS - proč DERIVATIZACE?? MS vysoce výkonná technika Derivatizace je v oboru MS často zvažována až jako jedno z posledních řešení Derivatizace analytu změny chemických vazeb vnáší nejistoty/rizika : - jaké derivatizační činidlo použít? - vlastnosti derivátu? (molekulová hmostnost, hmotnostní spektrum) - výtěžek reakce? - vedlejší produkty, nadbytek činidel atd.? - průběh reakce v matrici, rušivé složky? - pracnost, časová náročnost, nákladnost vývoje metody? Occamova břitva (Occam's Razor, William of Occam, 14.století) Nejjednodušší varianta z mnoha nabízených řešení je obvykle ta správná. 4

Škola MS. Derivatizace 2.MS - proč DERIVATIZACE?? Výkonná technika MS & analytický problém & derivatizace analytů 2.1. Obecné charakteristiky derivatizační metod pro MS Oproti jiným detekčním technikám větší výběr metod Popsáno enormní množství derivatizačních metod pro MS aplikace Širší uplatnění nalezl jen omezený počet metod Analyt musí mít vhodnou reaktivní funkční skupinu pro transformaci Výhodné jsou protické funkční skupiny s aktivním vodíkem Nejčastější typ reakce nukleofilní substituce Nejvýhodnější S N2 mechanismus s minimálním výskytem vedlejších reakcí, přesmyků či racemizace analytu Preference derivatizačníčinidla malé reaktivníčástice (silné nukleofily), snazší derivatizace stericky bráněných funkčních skupin, ale malé hmotnostní posuvy Preferované reakční médium polární aprotická rozpouštědla Preference jednostupňových, jednoduchých reakcí 5

Škola MS. Derivatizace 2. MS - proč DERIVATIZACE?? Výkonná technika MS versus derivatizace 2.2. Požadavky a kritéria pro aplikaci derivatizační metody v MS Derivatizace podstatně mění vlastnosti, převážně snižuje polaritu analytu, mění jeho rozpustnost ve vodné nebo organické fázi, těkavost, ionizační průřez analytu atd. Rychlost konverze v sekundách, max. minutách Vysoké výtěžky, minimum vedlejších reakčních produktů analytu i snadno odstranitelného derivatizačního činidla Jednoduchá příprava, která lze automatizovat Velmi efektivní postup představuje integrace derivatizační reakce s extrakčním krokem přípravy vzorku k analýze 6

Škola MS. DERIVATIZACE 2.3. Literatura: Derivatizace v MS Komárek K., Franc J., Churáček J., Reakční chromatografie v organické analýze, SNTL, Praha 1989 Blau K., Halket J., Handbook of Derivatives for Chromatography, Wiley, NY 1993 Kitson F.G., Larsen B.R., McEwen C.C., Gas Chromatography and Mass Spectrometry. A practival Guide. Academic Press, NY, 1996 Lunn G., Hellwig L.C., Handbook of Derivatization Reactions for HPLC, Wiley, NY 1998 Rosenfeld J.M. in Sampling and sample preparation for field and laboratory, Pawlyszin J. ed., Chapter.19, Elsevier 2002 Van Berkel G.J. a spol., Chemical derivatization for electrospray mass spectrometry, série článků v Anal. Chem., RC MS od roku 1999 7

Škola MS. DERIVATIZACE 2.3. Literatura: Derivatizace v MS Zaikin V.G., Halket J.M., Derivatization in mass spectrometry, série přehledných článků v Eur. J. Mass Spectrom. Od 9 (2003),1. Halket J.M., Zaikin V.G., Analyte Derivatization Strategies for GC-MS The Encyclopedia of Mass Spectrometry, Volume 8 (Hyphenated \methods), W.M.A. Niessen ed.) Elsevier, 2006. Zaikin V.G., Halket J.M., Derivatization in Mass Spectrometry. The Encyclopedia of Mass Spectrometry, Volume 6 (Ionization Methods), M. Gross ed.) Elsevier, 2007. Firemní literatura: Derivatization Reagents, katalog Sigma-Aldrich 2007 aj.

Škola MS. Derivatizační techniky. 3. Rozdělení derivatizačních technik A. Podle způsobu ionizace molekul derivatizace pro: EI/CI ionizace (hard) GC-MS API/MALDI ionizace (soft) LC-MS, CE-MS, MALDI atd. B. Podle povahy reaktivní funkční skupiny analytu, která je podrobena derivatizaci C. Podle druhu použitého derivatizačníhočinidla 9

Program: Škola MS. DERIVATIZACE 1. Úvod definice předmětu 2. Derivatizační techniky v MS kritéria, požadavky, literatura 3. Derivatizační techniky 3.1. Derivatizace alkenů, alkynů 3.2. Alkylace 3.3. Silylace 3.4. Esterifikace 3.5. Derivatizace chlorformiáty 3.6. Derivatizace karbonylové skupiny 3.7. Cyklizační derivatizace 3.8. Derivatizace thiolové skupiny 3.9. Acylace 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS 3.11. Derivatizace se značením stabilními izotopy SIL 4. Závěr 10

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě Alkény, alkyny neutrální, nepolární sloučeniny Reakce na nenasycené (dvojné) vazbě (elektrofilní adice) Elektrofilní adice nejsou většinou stereospecifické, tvorba izomerních produktů GC/EI,CI MS a derivatizace - hlavní technika Strukturní analýza, určování polohy dvojných vazeb Oldham N.J., Jones R.G., J. Chromatogr. A 1999, 843: 199-236. API MS nefunguje (absence ionizace v roztocích), nutná derivatizace na nenasycené vazbě Van Berkel G. a spol., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14: 849-858. 11

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, Ad E ) Derivatizační techniky Dimethyldisulfid (DMDS) deriváty poskytují interpretovatelná EI spektra tolerance k jiným funkčním skupinám (acetáty, aldehydy,estery, alkoholy ) zvýšení mol. hmotnosti m/z + 94 / dvojná vazba 12

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, Ad E ) Derivatizační techniky Epoxidace/ oxidace Oxidace alkenu peroxykyselinou na oxiran s následnou hydrolýzou na 1,2-diol Alkene + mcpba oxidace oxiran hydrolýza trans-1,2-diol GC/MS LC/MS OsO 4, KMnO 4 cis-1,2-diol 13

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.1. Derivatizace na nenasycené vazbě (adice, Ad E ) Derivatizační techniky 5-nitro-2-pyridinsulfenyl chlorid (NPSC) alkén NPSC Alkenylsulfidy 2 izomery Podle Van Berkel G. a spol., RCMS 2000, 14: 849-858. 14

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.2. ALKYLACE (substituce, S N ) A-H + DR A-R R.. Alkyl Formální náhrada reaktivního vodíku alkylem Reagující funkční skupina Derivát A - OH A - COOH A - SH A - SO 3 H A - NH 2 A - NH-R + DR A-O-R A-COOR A-S-R A-SO 3 R A-NH-R A-NR -R Lze sem řadit 3.2.Silylace, 3.3.Esterifikace i 3.4 Derivatizace s chlorformiáty 15

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.2. ALKYLACE 3.2.A. Derivatizační techniky a činidla pro EI/CI MS Alkyl halogenidy, např. CH 3 I, pentafluorbenzylbromid (PFBr) Hydridy Diazoalkány, diazomethan CH 3 N 2 Dimethylsulfát Tetramethylamonium (TMAH), trimethylsulfonium (TMSH) hydroxidy derivatizace v GC injektoru Reakční podmínky Často bezvodé prostředí Alkylační činidla značně jedovaté/karcinogenní Produkty derivatizace deriváty ve vodných médiích stálé Počet aplikací poklesl s nástupem technologií API MS 16

3.2. ALKYLACE 3.2.B. Derivatizační techniky a činidla pro API/MALDI MS Analýza alkoholů, fenolů 3,4-dikarboxylpyridin anhydride Škola MS. Derivatizační techniky. 2-Fluoro-1-methylpyridinium p-toluenesulfonate (FMP-Ts), Quirke J.M.E., Van Berkel G.J., J. Mass Spectrom. 2001, 36: 1294 1300. Dimethylglycin (DMG) Johnson D.W., J. Mass Spectrom. 2001,36: 277 283. Benzoylchlorid, ESI MS glykolů po derivatizaci ve vodném médiu Holčapek M. a spol., Anal. Chem. 1999, 71: 2288-2293. 17

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace R 3 -Si-X + A-H R 3 -Si-A + HX TMS - trimethylsilyl + 72 TBDMS - terc.butyldimethylsilyl + 114 18

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace R 3 -Si-X + A-H R 3 -Si-A + HX Reagující funkční skupina OH SH COOH TMS derivát O-TMS S-TMS COO-TMS POH konverze PO-TMS SOH NOH BOH NH2 =NH SO-TMS NO-TMS BO-TMS NH-TMS =NH-TMS 19

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace Reaktivita funkčních skupin (od nejvyšší k nejnizší) ROH > fenoly > RCOOH > aminy > amidy velký vliv sterické faktory reaguje také polární a iontové funkční skupiny fosfát, sulfát, guanidinová skupina Reakční podmínky bezvodé prostředí polární organická rozpouštědla MeCN, DMF, izooktan, toluen vialky těsněné PTFE-silikonová/neoprenová septa zahřívání, derivatizace řádově desítky minut katalýza reakcí přídavkem TMCS, TFA, pyridin, MeCOOK, TMBS, TMIS deriváty nestálé ve vodných médiích výhodné pro EI/CI GC-MS aplikace 20

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace - aplikace Aplikace: GC-EI/CI/MS polárních organických látek TMS deriváty BSTFA, BSTFA/TMCS MSTFA, MSTFA/TMIS TMSI TBDMS deriváty MTBSTFA, MTBSTFA/TBDMCS univerzální, organické kyseliny, báze polární sloučeniny, ketosteroidy reaguje obtížně s primární aminoskupinou pro cukry, alkoholy univerzální, objemná terc.-butylová skupina stabilnější deriváty s NH2 skupinami obtížnější silylace stericky nepřístupných protických míst 21

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace aplikace Cukry, polyhydroxylované alkoholy Oximace-TMS, GC/MS Śimek P., et al., BC AV ČR, J. Insect Physiology 2007, 53: 580-586. Mastné/organické kyseliny TMS, GC/MS Chrastina P. a spol., VFN Praha, organické kyseliny v moči Steroidy Oximace-TMS, GC/MS Hill M. a spol., Endokrinologický ústav Praha, Steroids 2007, 72: 792-801. 22

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace aplikace Aminokyseliny/hydroxykyseliny/aminoalkoholy TBDMS deriváty, GC/MS Šimek P. et al., HRC-J. High Resol. Chromatogr. 1993, 17: 145-152. Složky nukleových kyselin, pyridimidinové/purinové báze, nukleosidy TMS deriváty, GC/MS Šimek P. et al., J. Chromatogr. A 1993, 679: 195-200. 23

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.3. Silylace přednosti a omezení Přednosti univerzální, důkladně prozkoumané separace na nepolárních kapilárních GC kolonách EI spectra obsahují charakteristické m/z, 73, 147, M-15 (TMS), M-57 (TBDMS) lze kombinovat s předchozí oximací, acylací, alkylací dlouholetá osvědčená technika v GC/MS, rozsáhlé knihovny spekter derivátů Omezení příprava v bezvodém prostředí deriváty se ve vodném prostředí snadno rozkládají, dobré uzávěry pro uchovávání 24

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.4. ESTERIFIKACE A-COOH + R-OH A-COO-R + H 2 O Esterifikace A-COOR1 + R-OH A-COO-R + R1-OH Transesterifikace A. Esterifikační činidla/techniky pro EI/CI MS Stránský K., Jursík T., Fett-Lipid 1996, 98:65-77. 3M HCl < ROH Diazomethan BF 3 < ROH Methanolát sodný Dimethylformamid dimethylacetal (esterifikace v GC injektoru) Trimethylanilinium hydroxid (pyrolytická esterifikace) Pentafluorobenzyl chlorid/bromid (elektronegativní funkční skupina pro NICI MS) 25

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.4. ESTERIFIKACE A-COOH + R-OH A-COO-R + H 2 O Esterifikace B. Esterifikační činidla/techniky pro API/MALDI MS Nejběžnější příprava různě strukturovaných amidů Pentafluorobenzyl chlorid/bromid Fenacyl bromid Deriváty s kvarterní amoniovou nebo fosfoniovou skupinou Trimethylaminoethyl estery (TMAE). Blair I.A., J. Chromatogr. B 2007,850, 168-176. 26

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.4. ESTERIFIKACE B. Esterifikační činidla/techniky pro API/MALDI MS Tris(trimethoxyfosfonium)propylamin bromid (TMPPA) TMPPA RCOOH + + CMPI Aktivovaný karboxyl R = H Leavens W.J. a spol., RCMS 2002, 16:433-441 + 27

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.4. ESTERIFIKACE Reakční podmínky bezvodé prostředí polární organická rozpouštědla nejlépe příslušný ROH výhodná je eliminace vznikající vody, např. dimethoxypropanem Aplikace analytická chemie lipidů transesterifikace stanovení methylesterů mastných kyselin, identifikace a určování dvojných vazeb pomocí 3-methylpikolinyl, dimethyoxazolidinonyl (DMOX) esterů klinická chemie butylace karnitinů pro LC/MS/MS klinická vyšetření VFN, dr. P. Chrastina 28

Přednosti Škola MS. Derivatizační techniky. 3.4. ESTERIFIKACE přednosti a limity snižují aciditu analytů, např. lepší extrahovatelnost z biologických matric jednoduché reakce, snadno odstranitelné vedlejší produkty stabilní deriváty, lze kombinovat s jinými derivatizačními postupy, jako acylace, silylace zlepšují odezvu mnoha polárních analytů v API MS Omezení většinou vyžadují pro reakci bezvodé prostředí, a proto náročnější extrakce z komplexních biologických matric delší reakční doba 29

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Derivatizace chlorformiáty Jednoducháčinidla schopná reagovat s protickými funkčními skupinami ve vodném prostředí v sekundách O Vlastnosti C l O Alkyl Vysoké výtěžky ve vodných médiích v sekundách Klesá výrazně polarita analytu, snadno rozpustný v organické fázi, nemisitelné s vodou Derivatizační reakce a extrakce mohou probíhat současně tzv. phase-transfer extrakce, extractive alkylation Efektivní eliminace anorganických solí, polárních interferujících látek Reakce není ovlivněna běžnými pufry, probíhá ve fyziologickém roztoku, borátovém pufru Esterifikace karboxylové skupiny vyžaduje katalýzu pyridinem 30

A. AMINO skupina Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita COOCH 2 CH 3 NH 2 ClCOOCH 2 CH 3 HN R Vodné médium, ph > 8 R Amino skupina + (primární, sekundární) RCF Alkyl karbamát 31

B. HYDROXY -OH Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita NHCOOCH 2 CH 3 NHCOOCH 2 CH 3 COOH ECF COOH vodné, ph > 9 OH O COOCH 2 CH 3 A-OH + RCF alkyl karbonát (fenol, aktivované OH) 32

C. THIOL SH- Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Derivatizace chlorformiáty - reaktivita NH 2 NHCOOCH 2 CH 3 SH COOH ECF S COOH vodné, ph > 8 COOCH 2 CH 3 A-SH + RCF Alkyl thiokarbonát (alkyl) 33

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Derivatizace chlorformiáty - Reaktivita D. Karboxyl Hušek P., FEBS Letts 1991 NHCOOCH 2 CH 3 NHCOOCH 2 CH 3 COOH ECF, EtOH vodné, ph > 8, katalýza pyridinem alkoholýza COOCH 2 CH 3 Karboxyl + RCF alkyl ester (aromatický, alifatický) 34

3.5.A. Derivatizace aminoskupiny arylchlorformiáty Schéma reakce s FMOC Škola MS. Derivatizační techniky. Typické prostředí reakce borátový pufr ph= 10 35

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5.B Derivatizace alkylchlorformiáty Methyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, isobutyl-, pentyl-, hexyl- chlorformiáty Univerzální použití jak v EI/CI MS, tak API MS EZ-Faast kit, Phenomenex Co., USA (propyl chlorformiát) Hušek P. Šimek P., LC-GC North America 2001, 19: 986-999. Current Pharm. Anal. 2006, 2: 21-41. nově popsány vlastnosti fluoralkylchlorformiátů (FCF) trifluorethyl (TFECF) pentafluorpropyl (PFPCF) heptafluorbutyl (HFBCF) Hušek P., Šimek P. a spol., J. Chromatogr. 2008, 1186: 391-400. F F F F F F F O Cl O FCF reaktivnější, esterifikace probíhá přímo s chlorformiátem analogické přednosti jako zavedené fluoracylanhydridy/fluoralkoholy 36

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Chlorformiáty Využití nových FCF činidel v profilové analýze metabolitů participujících v metabolismu jednouhlíkových skupin Použity zkratky běžné v klinické chemii 37

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Chlorformiáty Profilová analýza organických kyselin v krevním séru Šimek P., Hušek P., Zahradníčková H., Anal. Chem. 2008, 80: 5776-5782. Redukce vázaných thiolů R-SS-R R-SH 1,2- dimerkaptopropansulfonátem (DMPS) homocystin DMPS Homocystein Heptafluorobutylchloroformiát 38

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Chlorformiáty Profilová GC/MS analýza 32 metabolitů v séru po aplikaci nového postupu deproteinace/redukce RS-SR skupin/derivatice HFBCF MMA 2HPA Ala Gly Pro Ser2 Cys 3.76 4.61 4.86 7.15 5.75 5.16 5.56 6.52 Met Phe 7.42 Gln 8.04 Hcy 5.87 6.67 4.19 3.59 5.98 6.95 4.99 7.74 3.21 Orn Lys 8.56 8.24 8.92 3.76 4.86 5.75 7.03 7.15 8.45 8.65 9.33 4.61 5.59 5.16 7.72 8.31 7.42 5.56 8.24 6.52 Tyr γ-glucys + Trp CysGly 9.02 9.57 Cth 9.26 9.70 r 7.74 4.20 5.98 6.63 7.82 9.62 9.67 3.08 6.79 8.39 DMPS DTT 2.50E7 2.50E7 3 4 5 6 7 8 9 10 Time (min) 39

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.5. Chlorformiáty Ukázka GC/EI-MS detekce celkového homocysteinu (thcy) v séru 100 100 100 0 100 (a) Hcy Hcy Hcy 7.71 7.55 7.86 d4-hcy 7.75 Extr. m/z 282 Extr. m/z 285 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00 Time (min) 7.74 285 TIC 7.96 NL: 1.72E6 NL: 2.08E5 NL: 1.48E5 EI spectrum of Hcy+d4-Hcy 113 282 69 85 95 119 183 318 146 227242 271 342346 484 514 210 373 482 510 314 100 200 300 400 500 m/z EI spektrum Hcy a d4-hcy s přímo odečtené z TIC záznamu analýzy séra Koncentrace thcy = 9 umol/l. Vysoce účinná extrakce/derivatizace analytů z biologické matrice 40

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY A-C=O + NH 2 -R A-C=N-R + H 2 O Kondenzační reakce karbonylové skupiny (keton, aldehyd) obecně s aminem (Schiffova báze), konkrétně s hydroxylaminy, hydraziny Reagující činidlo Derivát NH 2 -O-R A-C=NH-O-R oxim NH 2 -NH-R + A-C=O A-C=NH-N-R hydrazon 41

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY Aplikace oximace ketokyselin (pro GC aplikace) oximace redukujících cukrů záchyt a analýza těkavých karbonylových sloučenin ze vzduchu oximace redukujících cukrů Derivatizační činidla O-methylhydroxylamin O-pentafluorobenzylhydroxylamin Dinitrofenylhydrazin Girardova činidla (kvarterní amonium) Dansyl hydrazin 42

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.6. DERIVATIZACE KARBONYLOVÉ SKUPINY Přednosti eliminace labilních keto-enol forem, tvorba definovaného derivátu analytu lepší separační a detekční vlastnosti Omezení zdlouhavější reakce, většinou v bezvodém prostředí, otázka výtěžků oximy tvoří syn-, anti- izomery, které se dělí na GC kapilárních kolonách 43

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE RCHO (aldehyd) acetal + RR CO (keton) ketal RB(OH) 2 cyklický boronát Analyt se dvěma funkčními skupinami v 1,2-, 1,3- nebo 1,4 polohách alkylové řetězce kondenzuje s vhodným činidlem za vzniku cyklického derivátu s 6>5>7 členným kruhem 44

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE Reakční podmínky 2 funkční skupiny ve stericky vhodné poloze Stabilní konfigurace vznikajícího kruhu, důležité stereochemie analytu Kyselá nebo alkalická katalýza Reagující analyt Reagující činidlo Derivát Dioly, aminoalkoholy aldehyd, keton cyklický acetal aj. 1,2- až 1,4- bifunkční analyty nebo ketal jako cukry s vicinálními dioly, aceton, DCDFA acetonid Nebo steroidy fosgen cyklický karbonát Alkyl/aryl boronát cyklický boronát brassinosteroidy, ekdysteroidy dansyl-3-aminofenylboronát 45

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.7. CYKLIZAČNÍ DERIVATIZACE Aplikace Derivatizace vicinálních diolů v brassinosteroidech Dansyl-3-aminofenylboronát Svatoš A. a spol., RCMS 2004, 18: 816 821. Guanidinová skupina malondialdehyd substituované hexafluoroacetylaceton pyridiny 12 M HCl, 1hod., laboratorní teplota 46

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY SH- Vlastnostmi podobná ROH a zejména aciditou fenolům (PhOH) negativní ESI spektra Problém: oxidační-redukční děje na SH- skupin 2* R-SH R-S-S-R A. Redukce disulfidových vazeb (RS-SR) B. Derivatizace SH-skupiny 47

3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY A. Redukce disulfidových vazeb (RS-SR) uvolňování thiolů vázaných v proteinech Borohydrid sodný Škola MS. Derivatizační techniky. Dithiothreitol (DTE), dithioerythritol (DTT), merkaptoethanol (ME) Tris(2-karboxyethyl)fosfin - stabilní, ve vodě rozpustný Krijt J. a spol., Clin. Chem. 2001, 47: 1821-1828. 1,2-Dimerkaptopropan-1-sulfonová kyselina Šimek P. a spol., Anal. Chem. 2008, 80: 1776-1782. Produkty polárního činidla zůstávají ve vodné fázi 48

3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY B. Derivatizace SH skupiny Iodacetamid Škola MS. Derivatizační techniky. Dansylaziridinin specifické činidlo pro thioly Ellmansovo činidlo, 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoová kyselina), DTNB 49

Škola MS. 3. DERIVATIZAČNÍ TECHNIKY N-ethylmaleinimid 3.8. DERIVATIZACE THIOLOVÉ SKUPINY N-(2-ferrocenethyl)-maleinimid (elektrochemicky aktivní funkční skupina) Karst U. a spol., Anal. Chem. 2007, 79, 7131-7138. Borohydrid sodný + 4,4 -dithiodipyridine (4-DPS). R-SH, R-SS-R v pmol koncentraci Winther J.R. a spol., Anal. Biochem. 2007, 363, 77-82. Van Berkel G a spol., Anal. Chem. 1998, 70: 1544-1554. MS elektrolyticky aktivních látek. 50

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.9. ACYLACE O O A-H + R-C-X A-C-R + HX S N s aktivovaným zbytkem karboxylové skupiny Reagující funkční skupina analytu A-H Derivát A- -NH 2, -NH= -NH-CO-R -OH, fenol konverze -O-CO-R -SH -S-CO-R A. Acylace pro EI/CI MS B. Acylace pro API/MALDI kap. 3.10. 51

3.9. ACYLACE Acylační činidla pro EI/CI MS Anhydridy kyselin Škola MS. Derivatizační techniky. Acetanhydrid Trifluoracetyl- (TFA), pentafluoropropionyl- (PFP), heptafluorobutyryl- (HFB) Halogenidy kyselin Např. perfluoroktanoyl, pentafluorobenzoyl- (PFBO) Acylimidazoly TFAI, PFPI, HFBI pro derivatizace analytů citlivých na kyseliny, např. indoly Acylamidy N-methylbis(trifluoracetamid) (MBTFA) Lze zařadit také alkylchlorformiáty (acylace aminoskupiny) 52

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.9. ACYLACE pro EI/CI MS Reakční podmínky a vlastnosti bezvodé prostředí kyselá katalýza - kys. octová, bazická katalýza - CH 3 COONa, pyridin preference fluoroalkylovaných činidel, reaktivní, po reakci lze snadno odpařit derivatizační produkty fluoroalkylamidy nestálé ve vodných médiích perfluoralkylový skelet s acylem - zvyšuje výrazně těkavost derivátů - výborné chromatografické vlastnosti derivátů v GC aplikacích - deriváty výborně záchycují elektrony poskytují NICI MS spektra s detekcí derivátů mnoha látek na attomolové (fg) hladině Lze kombinovat: - s oximací ve formě acetátů analýza cukrů - silylací, esterifikací analýza aminokyselin, steroidů - chirální separace na Chirasil-Val GC kolonách 53

Škola MS. Derivatizační techniky. 3.9. ACYLACE aplikace GC/EI-MS Chirální GC/MS analýza optické čistoty aminokyselin Stanovení s přesností 0.1% vyžaduje aplikaci deuterovanýchčinidel pro derivatizaci a GC-MS analýzu, provádí CAT GmbH, Tubingen PFP acyl isopropyl ester deriváty, kolona Chirasil Val Frank H. et al., J. Chromatogr. 1978, 167: 187 54

3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API/MALDI MS Aminoskupina Dostatečně bazická, protonizuje se snadno v kyselých roztocích Velmi reaktivní, přednostní derivatizovaná funkční skupina Největší množství aplikací v API MS Každé činidlo má určité přednosti a nevýhody Kritické faktory : - rušivý nadbytek derivatizačního činidla - rušivý vliv matrice vzorku Škola MS. 3. DERIVATIZAČNÍ TECHNIKY - nestabilita produktů, tvorba více derivátů - omezená rozpustnost činidel ve vodných pufrovaných médiích, což snižuje reaktivitu činidel a ovlivňuje celkově separační procesy a zejména kvantitativní stanovení 55

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API/MALDI MS Derivatizace fenylisothiokyanátem (PITC) Reaguje s primární i sekundární aminoskupinou během 5 min 56

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS Derivatizace fenylisothiokyanátem (PITC) Biocrates AbsoluteIDQ TM, metabolomický kit přesné stanovení 160 metabolitů v krevním séru (> 10 ul) po derivatizaci PITC a LC/MS/ MS analýze v MRM režimu vyvinuto na ABI platformě pro API4000 a API 4000 QTrap stanovení metabolitů ze 4 skupin látek: aminokyseliny, acylkarnitiny, glycerofosfo- a sfingolipidy, hexosy součástí kitu je MET/Q SW pro automatické zpracování dat 57

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC) 58

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC) Charakteristiky derivatizační metody Reakce probíhá ph=8.5-10 v sekundách Tyr, Orn, Lys, Cys reagují 2 funkční skupiny Jednoduchá příprava, velmi dobrá stabilita produktů. Waters AccQ. Tag TM Ultra kit 59

Škola MS. 3.10. Derivatizace aminoskupiny pro API MS Derivatizace 6-aminochinolinyl-N-hydroxysukcinimidyl karbamátem (AQC) UPLC separace aminokyselin po derivatizaci AQC Ukázka UPLC/MS separace 10 pmol 27 fyziologických aminokyselin pomocí UPLC na koloně Xbridge C18, 2,1x100 mm, sorbent 1,7 µm. Waters, 55.ASMS konference, Seattle 2006.

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL (selective isotope labeling) DERIVATIZACE IZOTOPICKY ZNAČENÝMI ČINIDLY aktuální oblast nových aplikací derivatizačních technik analyty s vhodnou funkční skupinou jsou selektivně derivatizovány izotopicky značeným činidlem smíchání vzorků (kontrola + různé stavy organismu apod.) po derivatizaci činidlem o rozdílném izotopickém složení (SIL) umožnuje pomocí MS přímo sledovat rozdíly a komplexněji vyhodnocovat změny v expresi proteinů (proteomika) nebo v metabolismu (metabolomika) organismu technika SIL v kombinaci s hmotnostní spektrometrií nový nástroj v omickém výzkumu nová derivatizačníčinidla, nové protokoly přípravy vzorků, nové programy pro cílené zpracování zpracování dat současná mnohonásobná analýza vzorků - multiplexing

Derivatizace (itraq TM ) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát + H 2 N-A A 62

Derivatizace (itraq TM ) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát vyvinut Darrylem Pappinem a spol. u Applied Biosystems v r. 2004 itraq - soubor isobarických derivatizačníchčinidel o stejné mol. hmotnosti, avšak jiném izotopickém složení reagují s primární aminoskupinou včetněω-nh 2 lysinu ESI spektrum generuje MH + signál analytu A s identickou m/z pro každé itraq derivatizační činidlo! MS 2 spektrum poskytuje diagnostické produktové ionty s izotopickým posuvem pro konkrétní derivát (tj. m/z 114, 115, 116, 117) MS 2 A Reporter ion region NH-A 63

Derivatizace (itraq TM ) 2-(N-methylpiperazinyl)-N-hydroxysukcinimidyl acetát Duplexní analýza vzorku a kontroly (ABI protokol) 64

DERIVATIZACE itraq Selektivní izotopické značení (SIL) analytů současná mnohonásobná (multiplexová) analýza Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL MS 2 65

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL DERIVATIZACE itraq Selektivní izotopické značení (SIL) analytů současná mnohonásobná (multiplexová) analýza 4-plex, zdokonalená verze 8-plex (současná analýza až 8 vzorků derivatizovaných činidly itraq) 66

Škola MS. 3.11. Techniky SIL - itraq Přednosti techniky itraq cílená derivatizace primárních aminoskupin analytů ve vzorku derivatizací nedotčeny posttranslační modifikace proteinu itraq = soubor isobaricky značených činidel (stejná hmotnost, jiné izotopické složení diagnostické m/z v MS 2 spektrech 113 až 121, informace o zastoupení jednotlivých analytů současně zachována strukturní informace (sekvence) analytu (peptidu) až 8-násobná, současná analýza vzorků multiplexing derivatizační technika nabízí nepřeberné množství aplikací v proteomice a metabolomických aplikacích při porovnávání rozdílů mezi složením vzorků, kvantitativní analýze proteinů a peptidů 67

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL (selective isotope labeling) Derivatizace (MTEG-OPFP) Pentafluorfenyl 13 C-2-methyltetraethylenglykoloxyacetátem Bischoff R., Overkleeft H.V., Anal. Chem. 2008, submitted reaguje s NH 2 -, SH- a fenolickými skupinami ve vodných médiích PEG řetězec může obsahovat 13 C a 18 O atomy Relativně málo nákladná příprava isobarických činidel PEG řetězec může obsahovat 13 C a 18 O atomy Isobarické deriváty se při aplikaci LC-MS nedělí Lze připravit velký počet izobarických derivátů postupným prodlužováním PEG

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL Derivatizace 13 C-MTEG-OPFP + NH 2 -A PEG-oxyacetamid

Škola MS. 3.11. TECHNIKY SIL Derivatizace 13 C-MTEG-OPFP NH-A Přednosti relativně dostupná derivatizační technika a činidla velká flexibilita v inkorporaci izotopů do PEG řetězce výborná citlivost detekce [M+H]+ iontů výborná separace analytů Omezení, nejasnosti detekce analytů probíhá v plném skenu vliv matricových efektů na signál analytů aplikace v metabolomice i proteomice

Škola MS. 3.12. ZÁVĚR SOUHRN malé reaktivní částice preferovány jako derivatizační činidla reakce proveditelné většinou ve vodných médiích, v sekundách, s dobře definovanými deriváty, vysoké výtěžky EI/CI tvrdé ionizace u polárních látek derivatizace naprosto nezbytná technika API/MALDI měkké ionizace - výhodné v mnoha aplikacích, zvláště v kombinaci s extrakčními postupy a u obtížně ionizovatelných látek často zlepšení separace a citlivosti analytických MS metod hlavní aplikace na reaktivní amino- a SH- skupině SIL - izotopicky značenáčinidla nové aplikace v -omických oborech tzv. multiplexing stimulují R&D nových derivatizačních činidel DERIVATIZACE v oboru MS zůstává významnou analytickou strategií Finanční podpora: Fond na podporu výzkumu, projekt No. A/CZ0046/1/0018