Diabetes mellitus 1. typu a přidružená autoimunitní onemocnění vyšetření autoprotilátkového profilu Type 1 Diabetes Mellitus and Associated Autoimmune Diseases the Examination of the Autoantibody Profile MARTIN PRÁZNÝ1, JAN ŠKRHA1, ZDEŇKA LÍMANOVÁ1, ZDISLAVA VANÍČKOVÁ2, JIŘINA HILGERTOVÁ1, JANA PRÁZNÁ3, MARCELA JAREŠOVÁ3, ILJA STŘÍŽ3 1 Laboratoř endokrinologie a metabolismu, III. interní klinika 1. LF UK a VFN, Praha 2 Ústav klinické biochemie, 1. LF UK a VFN, Praha 3 Imunologické pracoviště IKEM, Praha Souhrn: Diabetes mellitus 1. typu je autoimunitní onemocnění, které bývá často doprovázeno řadou dalších autoimunitních nemocí endokrinních žláz i neendokrinních orgánů. Často je možné k jejich detekci použít stanovení orgánově specifických autoprotilátek, jež mohou být přítomny v séru takto postižených pacientů. Je popisován častější výskyt autoimunitních tyreopatií, Addisonovy choroby, celiakie a řady dalších autoimunitně podmíněných onemocnění. Zjišťování přidružených autoimunitních chorob je u rizikových pacientů s diabetes mellitus 1. typu důležité pro jejich časnou léčbu. Ta může předcházet zhoršování kompenzace diabetu a dalším komplikacím. V této studii jsme se zaměřili na vyšetření autoprotilátek proti antigenům Langerhansových ostrůvků, štítné žlázy, nadledvin a protilátek proti gliadinu a antigenům tenkého střeva používaným v detekci celiakie. Klíčová slova: diabetes mellitus, celiakie, tyreopatie, autoprotilátky Summary: Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune disease that is often connected with a presence of other endocrine autoimmune diseases or with autoimmune disorders of other organs. Autoimmune thyroid disease, coeliac disease, Addison s disease and some other are reported to be more frequent in patients with Type 1 diabetes mellitus than in healthy population. The evaluation of tissue-specific autoantibodies that may be present in the serum of patients can be used for the detection of such associated diseases. The screening for these disorders in high-risk Type 1 diabetic patients is very important for their early detection and treatment that can prevent the unsatisfactory diabetes control and other complications. In our study we evaluated the presence of autoantibodies against antigens of islets of Langerhans, thyroid and adrenal autoantibodies, and the antibodies against gliadin and intestine antigens in the screening of coeliac disease. Key words: IDDM, autoimmune thyroid disease, coeliac disease, autoantibodies Úvod: Diabetes mellitus 1. typu je považován za autoimunitní onemocnění (12). V Langerhansových ostrůvcích bývá přítomna autoimunitní zánětlivá infiltrace, tzv. inzulitida a zejména působením cytotoxických T-lymfocytů dochází k postupné destrukci b-buněk a následnému vymizení sekrece inzulinu. Ještě před klinickým nástupem onemocnění a v jeho průběhu je možno zaznamenat přítomnost cirkulujících protilátek proti některým autoantigenům ostrůvkových buněk. Jedná se zejména o protilátky proti dekarboxyláze kyseliny glutamové (anti-gad) (1), tyrozinfosfatáze IA-2 (anti-ia-2a) (9), inzulinové autoprotilátky (IAA) (14) a další, které společně tvoří komplex protilátek proti ostrůvkovým buňkám (ICA) (2). DM 1. typu může být navíc sdružen s řadou dalších autoimunitních onemocnění, jako jsou například poruchy funkce štítné žlázy, celiakie (coeliakální sprue, glutenová enteropatie), autoimunitní adrenalitida vedoucí k Addisonově chorobě, atrofická gastritida a další, která mohou být též doprovázena přítomností specifických autoprotilátek (13). Onemocnění štítné žlázy jsou jedny z nejčastějších autoimunitních onemocnění endokrinních orgánů, která se přidružují k diabetes mellitus 1. typu (3, 10, 17). Protože v séru pacientů s tyreopatií lze někdy nalézt zvýšené koncentrace autoprotilátek proti tyroidální mikrosomální peroxidáze (TPO) a tyreoglobulinu (TG) (19), je možné k detekci postižení štítné žlázy použít i vyšetření uvedených protilátek. K vyšetření funkce štítné žlázy je vhodné stanovit hodnotu tyroidálního stimulačního hormonu (TSH). Včasným zjištěním diagnózy tyreopatie a okamžitou léčbou je možno předejít klinicky vyjádřené hypo- nebo hyperfunkci štítné žlázy a následným možným komplikacím, jako je zhoršená kompenzace diabetu, dyslipidémie, či fibrilace síní. Další z chorob, u které je popisován častější výskyt v souvislosti s diabetes mellitus 1. typu, je autoimunitní postižení nadledvin, jež může vést až k hypofunkci kůry nadledvin a k Addisonově chorobě (16). Adrenalitida bývá doprovázena přítomností protilátek proti kůře nadledvin, které je možno různými metodami v séru diabetiků zjišťovat a detekovat tak toto postižení i v preklinických stadiích. Mezi onemocnění neendokrinních orgánů, která jsou spjata s výskytem diabetes mellitus 1. typu a která mají významný vliv na kvalitu života pacienta s tímto onemocněním, lze zařadit celiakii (7, 15, 18). Detekce celiakie nabývá na významu též s rozšiřujícími se možnostmi vyšetření autoprotilátek doprovázejících v řadě případů toto onemocnění. Při zjištění přítomnosti
specifických autoprotilátek proti gliadinu ve třídě IgA a IgG, protilátek proti endomysiu (EMA) a tkáňové transglutamináze (ATTG), pokud možno vyšetřených v kombinaci, je možné provést mikroskopickou verifikaci celiakie z materiálu odebraného enterobiopsií (4). V řadě případů je tak možno nejen potvrdit diagnózu onemocnění u pacienta s rozvinutými symptomy vyplývajícími z chronické malabsorpce a malnutrice, ale i odhalit subklinická stadia celiakie u dosud bezpříznakového pacienta. Včasnou úpravou diety lze pak zmíněným nutričním problémům předcházet a neprohlubovat tak přítomné metabolické změny. Cíl práce: Cílem práce bylo vyšetření protilátek proti ostrůvkovým autoantigenům anti-gad65 a anti-ia-2a, proti autoantigenům štítné žlázy anti-tpo a anti-tg, zhodnocení funkce štítné žlázy pomocí screeningového stanovení koncentrace TSH, vyšetření autoimunitních markerů glutenové enteropatie protilátek proti gliadinu ve třídě IgA, IgG, protilátek EMA a ATTG ve skupině pacientů s diabetes mellitus 1. typu s různě dlouhou dobou trvání onemocnění. Dále byly vyšetřeny protilátky proti kůře nadledvin (AAb). Vyšetření bylo provedeno se záměrem zjišťovat subklinická stadia autoimunitních chorob přidružených k diabetes mellitus 1. typu. Byl zhodnocen společný výskyt jednotlivých autoprotilátek a analyzována souvislost mezi přítomností protilátek a kompenzací diabetu. Soubor vyšetřených pacientů a použité metody: Do studie bylo zahrnuto celkem 51 pacientů s diabetes mellitus 1. typu, jejichž charakteristika je uvedena v tabulce 1. Glykovaný hemoglobin A1C byl vyšetřen na kitech Imx GHg Assay System (Abbot). Normální koncentrace HbA1C je v naší laboratoři stanovena v rozmezí 4,6 6,4 %. C-peptid, celkový thyroxin a TSH byly stanoveny rutinní metodou RIA v centrálních biochemických laboratořích VFN. Referenční hodnoty koncentrace C-peptidu se nachází v rozmezí 0,21 0,93 nmol/l, pro celkový thyroxin je udávané referenční rozmezí 60 150 nmol/l. Hodnoty koncentrace TSH byly považovány za normální v rozmezí 0,5 3,5 U/l. Koncentrace vyšší než 3,5 U/l byla považována za známku subklinické hypotyreózy. Vyšetření protilátek proti GAD65 a IA-2a byla provedena kitovou metodou RIA na komerčních kitech firmy Cis-Bio International, Francie (distribuce Immunotech, Brno). Za pozitivní byly podle materiálů výrobce kitu považovány u anti-gad a anti-ia2a protilátek hodnoty koncentrace vyšší než 1U/ml. Vyšetření anti-tpo a anti-tg bylo provedeno metodou RIA na kitech Immunotech (Brno). Za pozitivní byly považovány koncentrace protilátek vyšší než 50 U/ml u anti-tpo a více než 100 U/ml u anti-tg. Screening protilátek proti gliadinu, endomysiu a tkáňové transglutamináze byl proveden v laboratoři gastroenterologie ÚKB 1. LF UK a VFN. Antigliadinové protilátky třídy IgA a IgG byly vyšetřeny metodou ELISA. Jako antigen byl použit vlastní purifikovaný protein a-gliadin, který je separován iontoměničovou chromatografií na SP-Sephadexu (8). Purifikovaný a-gliadin je nanesen na destičky ELISA. Výsledek stanovení je vztažen na vnitrolaboratorní standard a je vyjádřen hodnotou indexu. Za normální byla pro IgA i IgG protilátky stanovena hodnota indexu < 30. Detekce EMA protilátek je prováděna immunofluorescenčním průkazem soupravou Immco (USA) na preparátu hladkého svalu. Specificita a senzitivita EMA protilátek třídy IgA u aktivní celiakie je téměř 100 %. Detekci protilátek ke tkáňové transglutamináze byla prováděna metodou ELISA pomocí soupravy Genesis (UK). Specificita uváděná výrobcem je 97,6 %, senzitivita 100 %. Normální hodnoty ATTG jsou pro IgA protilátky: 1-10 U/ml, hodnoty > 10 U/ml jsou hodnoceny jako pozitivní. Distribuci kitů Immco a Genesis zajistila firma Dialab (Praha). Protilátky proti kůře nadledvin (opičí nadledvina, The Bindihg Site, UK) byly stanoveny metodou nepřímé imunofluorescence na tkáňových řezech. Výsledky: Výsledky vyšetření ostrůvkových autoprotilátek jsou uvedeny v tabulce 2 a podobně výsledky vyšetření proti antigenům štítné žlázy a stanovení TSH jsou uvedeny v tabulce 3. Výsledky vyšetření markerů celiakie jsou uvedeny v tabulce 4, a to jak jednotlivě, tak i v kombinaci. Prevalence jednotlivých skupin autoprotilátek a překrývání jejich pozitivity je znázorněno u všech vyšetřených pacientů v grafu 1. Ve skupině mužů byla zjištěna současná pozitivita anti-tpo, anti-tg a zvýšená koncentrace TSH ve třech případech a ve dvou dalších byla zjištěna pouze elevace TSH. Protilátky EMA byly nalezeny pouze u jednoho pacienta současně s pozitivitou všech ostatních markerů glutenové enteropatie, ve čtyřech dalších případech byla nalezena pozitivita všech autoprotilátek kromě EMA. Ve skupině žen byla zjištěna současná pozitivita anti-tpo a anti-tg ve dvou případech, v jednom byla přítomná zvýšená a v jednom snížená koncentrace TSH. Elevace TSH byla nalezena u třech dalších pacientek, v jednom případě s pozitivitou anti-tg. Nebyla zde zjištěna žádná pacientka se všemi pozitivními markery glutenové enteropatie, ve třech případech byly pozitivní všechny kromě EMA a u jedné pacientky byly nalezeny pozitivní všechny kromě autoprotilátek proti gliadinu ve třídě IgA. Pouze u dvou pacientů s pozitivitou tyroidálních autoprotilátek a u dvou pacientů s pozitivitou markerů celiakie bylo podezření na příslušné onemocnění vysloveno na základě klinických příznaků již před vyšetřením autoprotilátek. U jednoho pacienta (BMI 18,6 kg.m-2) byly pozitivní kromě EMA další tři autoprotilátky a u jedné pacientky (BMI 17.4 kg.m-2) kromě EMA další dvě autoprotilátky ve screeningu celiakie a přítomnost postižení tenkého střeva je u nich vysoce pravděpodobná. U žádného pacienta nebylo dříve vysloveno podezření na Addisonovu chorobu, pozitivita autoprotilátek proti kůře nadledvin však byla zjištěna u dvou pacientek s DM 1. typu. Byla potvrzena přítomnost statisticky významné negativní závislosti koncentrace anti-gad65 na trvání diabetu (r = -0,47, p < 0,002, graf 2). V tomto souboru pacientů však byla též zjištěna podobná závislost i u protilátek anti-ia-2a (r = -0,56, p < 0,01, graf 3). Reziduální sekrece C-peptidu s progresí onemocnění klesala (r = -0,49, p < 0,02) a zhoršovala se kompenzace diabetu
hodnocená koncentrací glykovaného hemoglobinu HbA1C v závislosti na věku pacienta (r = -0,41, p < 0,02). Koncentrace autoprotilátek proti gliadinu ve třídě IgA statisticky významně korelovala s koncentrací autoprotilátek ve třídě IgG (r = 0,3, p < 0,02, graf 4). Diskuze: Naše výsledky ukázaly výskyt protilátek anti-gad a anti-ia-2 v průměru u více než dvou třetin diabetiků s různou délkou trvání onemocnění, což je ve shodě s pracemi domácích i zahraničních autorů (5, 6, 20). Zhoršování kompenzace onemocnění patrně souvisí se sníženou schopností organismu starších pacientů zvládnout abnormální metabolické poměry. Nebyl zjištěn žádný vztah mezi zjišťovanými autoprotilátkami a kompenzací diabetu 1. typu. Negativní vztah mezi koncentrací C-peptidu a délkou onemocnění potvrzuje ubývání funkčně zdatných b-buněk a progresi inzulinodependence. V naší studii byla pozitivita výše uvedených tyroidálních autoantigenů nalezena v necelých 30 % případů, což je prevalence významně vyšší než v normální české populaci, kde je pozitivita nalézána asi v 10 % vyšetření (17, 21). U jedenácti našich pacientů (20 %) byla na podkladě vyšetření autoprotilátek a koncentrace TSH nově diagnostikována tyreopatie. Dohromady s pacienty, u nichž již tyreopatie byla zjištěna dříve, byla tedy onemocněním štítné žlázy postižena necelá třetina pacientů vyšetřených ve studii. Přestože se zdá být tento poměr vysoký, je srovnatelný s výsledky jiných studií (3, 19). Je vhodné dodat, že obecně je v české populaci incidence autoimunitních onemocnění štítné žlázy vyšší a souvisí s vyšším příjmem jódu (stejně jako v ostatních zemích, kde je jód přidáván do určitých potravin). Tyreopatie byla nalezena častěji u pacientů ženského pohlaví a pacientů staršího věku. V literatuře je u mladších pacientů v období klinického nástupu diabetes popisována prevalence thyroidálních protilátek mezi 8-20 % (10, 11). Prevalence tyroidálních autoprotilátek bývá nižší v průřezových studiích. V prospektivních studiích se většinou nalézá výskyt vyšší, až 60 %, neboť někdy se zachytí i pozitivita pouze přechodná (19). V naší studii nebyl zjištěn žádný vztah mezi jednotlivými autoprotilátkami, ačkoliv byla popsána přechodně se objevující současná pozitivita různých autoprotilátek (19), která pravděpodobně může být způsobena aktivací imunitního systému například při infekčním onemocnění. U čtyř pacientů s nově diagnostikovaným postižením štítné žlázy s vysoce pozitivními protilátkami, vysokou koncentrací TSH byla ultrasonograficky potvrzena autoimunitní tyroiditida. U zbývajících sedmi pacientů byla konstatována subklinická hypotyreóza na podkladě zvýšené koncentrace TSH. Bylo zjištěno, že u 75 % vyšetřených pacientů byl přítomný alespoň jeden marker glutenové enteropatie. Tři pozitivní markery se vyskytly u šesti pacientů, všechny čtyři pouze u jednoho pacienta. Ve dvou případech byla zjištěna pozitivita protilátek proti EMA. Specificita a senzitivita EMA protilátek třídy IgA u aktivní celiakie je téměř 100 %, po nasazení bezlepkové diety titr EmA protilátek klesá až k úplné negativitě testu. Podle revidovaných kritérií je k průkazu celiakie nutná pozitivita alespoň dvou ze tří sérologických markerů při současném histologickém průkazu atrofické sliznice. Dva pacienti, u kterých byla pozitivita anti-ema protilátek nalezena, nabízenou enterobiopsii nepodstoupili, proto nemohla být tato diagnóza histologicky ověřena, je však vysoce pravděpodobná na základě klinického stavu nemocných (nízký BMI, dyspeptické obtíže). Zbývající pacienti s pozitivitou více vyšetřovaných protilátek neměli dosud žádné klinicky vyjádřené obtíže, je však u nich vysoká pravděpodobnost subklinicky probíhajícího onemocnění. Naše výsledky tímto potvrzují pozorování jiných autorů. Vyšetření protilátek proti kůře nadledvin vedlo v naší skupině ke zjištění dvou pozitivních nálezů, které nebyly spojeny s klinickými příznaky hypokortikalismu. U obou pacientů bude provedeno vyšetření funkce kůry nadledvin. Závěr: Vyšetření autoprotilátek proti štítné žláze u pacientů s diabetes mellitus 1. typu považujeme za velmi klinicky významné a domníváme se, že je vhodné pro časnou diagnózu a léčbu tyreopatií. Poskytuje cennou informaci o subklinicky probíhající tyreopatii, která se může vyskytnout kdykoli v průběhu diabetu, a umožňuje včasnou terapii onemocnění, jež by mohlo být v rozvinuté fázi příčinou řady komplikací, jako je zhoršená kompenzace diabetu, dyslipidémie či fibrilace síní. Vyšetření markerů celiakie je nyní relativně dostupné a spolehlivé. Domníváme se, že by vyšetření výše uvedených autoprotilátek mělo být provedeno zejména u diabetiků s nižší hodnotou BMI, chronickými dyspeptickými potížemi a u pacientů s jinými současně se vyskytujícími autoimunitními chorobami. Celoživotním dodržováním bezlepkové diety lze pacienta zbavit intestinálních obtíží a zlepšit jeho nutriční stav, což je u pacientů s DM 1. typu zvláště důležité. Pozitivní nález protilátek proti kůře nadledvin je u pacientů s diabetes mellitus 1. typu ve srovnání s prevalencí ostatních vyšetřovaných protilátek relativně vzácný. U pacientů s pozitivitou vyšetřovaných autoprotilátek je namístě podrobnější endokrinologické nebo v případě celiakie gastroenterologické vyšetření. Na základě získaných výsledků se domníváme, že u pacientů s diabetes mellitus I. typu je pravidelné vyšetření různých autoprotilátek k detekci jiného subklinicky souběžně probíhajícího autoimunitního onemocnění vhodné a umožňuje jeho včasnou diagnózu a léčbu. MUDr. Martin Prázný, CSc. III. interní klinika 1. LF UK a VFN U Nemocnice 1 128 08 Praha 2 e-mail: mpra@lf1.cuni.czliteratura 1. Baekkeskov S, Aanstoot H-J, Christgau S et al. Identification of the 64K autoantigen in insulin-dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature 1990; 347: 151-156.
2. Bottazzo GF, Florian-Christensen A, Doniach D. Islet-cell antibodies in diabetes mellitus with autoimmune polyendocrine deficiences. Lancet 1974; 2: 1279-1283. 3. Cerai LMP, Weber G, Meschi F, Mora S, Bognetti E, Siragusa V, Natale B. Prevalence of thyroid autoantibodies and thyroid autoimmune disease in diabetic children and adolescents. Letter. Diabetes Care 1994; 17: 782-783. 4. De Block CE, De Leeuw IH, Vertommen JJ, Rooman RP, Du Caju MV, Van Campenhout CM, Weyler JJ, Winnock F, Van Autreve J, Gorus FK. Beta-cell, thyroid, gastric, adrenal and coeliac autoimmunity and HLA-DQ types in type 1 diabetes. Clin Exp Immunol 2001; 126: 236-41. 5. Feeney SJ, Howard N, Myers MA, Verge CF, Mackay IR et al. Evaluation of ICA512As in combination with other islet cell autoantibodies at the onset of IDDM. Diabetes Care 1997; 20: 1403-1407. 6. Gorus FK, Goubert P, Semakula C et al. IA-2-autoantibodies complement GAD65-autoantibodies in new-onset IDDM patients and help predict impending diabetes in their siblings. Diabetologia 1997; 40: 95-99. 7. Jaeger C, Hatziagelaki E, Petzoldt R, Bretzel RG. Comparative analysis of organ-specific autoantibodies and celiac disease associated antibodies in type 1 diabetic patients, their first-degree relatives, and healthy control subjects. Diabetes Care 2001; 24: 27-32. 8. Kocna P, Holáková-Kočová M, Šašek A. Simple starch-gel electrophoresis of gliadin proteins using the LKB-Multiphor system. Z Lebens Unters Forsch 1983; 177: 454-456. 9. Lan MS, Lu L, Goto Y, Notkins AL. Molecular cloning and identification of a receptor-type protein tyrosine phosphatase, IA-2, from human insulinoma. DNA Cell Biol 1994; 14: 505-515. 10. Landin-Olsson M, Karlsson A, Dahlquist G, Blom L, Lernmark Ĺ, Sundkvist G et al. Islet cell and other organ-specific autoantibodies in all children developing Type 1 (insulin dependent) diabetes mellitus in Sweden during one year and in matched control children. Diabetologia 1989; 32: 387-395. 11. Landin-Olsson M, Karlsson FA, Lernmark Ĺ, Sundkvist G et al. Islet cell and thyrogastric antibodies in 633 consecutive 15- to 34-yr-old patients in the diabetes incidence study in Sweden. Diabetes 1992; 41: 1022-1027. 12. Lernmark Ĺ. Type I diabetes. Clinical Chemistry 1999; 45: 1331-1338. 13. McAulay V, Frier BM. Addison s disease in type 1 diabetes presenting with recurrent hypoglycaemia. Postgrad Med J 2000; 76: 230-2. 14. Páv J, Ježková Z, Škrha F. Insulin antibodies. Lancet 1963; ii: 221-222. 15. Schuppan D. Current concepts of celiac disease pathogenesis. Gastroenterology 2000; 119: 234-242. 16. Sjoberg K, Wassmuth R, Reichstetter S, Eriksson KF, Ericsson UB, Eriksson S. Gliadin antibodies in adult insulin-dependent diabetes autoimmune and immunogenetic correlates. Autoimmunity 2000; 32: 217-28. 17. Trunecká E, Bednář J, Havelka J et al. Srovnání dvou metod na stanovení protilátek proti tyreoglobulinu v klinické praxi. Vnitřní lékařství 1990; 36: 560-565. 18. Velluzzim F, Caradonna A, Boy MF, Pinna MA, Cabula R et al. Thyroid and celiac disease: clinical, serological, and echographic study. Am J Gastroenterol 1998; 93: 976-979. 19. Vondra K, Vrbíková J, Ivašková E, Pobišová Z, Poršová-Dutoit I, Skibová J, Štolba P, Voborská M, Šterzl I. Výskyt protilátek proti tyreoglobulinu a proti mikrosomům u dospělých diabetiků I. typu a jejich možný klinický význam. Vnitřní lékařství 1996; 42: 767-771. 20. Yamada K, Yuan X, Inada Ch, Hayashi H, Koyama K et al. Combined measurements of GAD62 and ICA512 antibodies in acute onset and slowly progressive IDDM. Diab Res Clin Pract 1997; 35: 91-98. 21. Zamrazil V, Pohůnková D, Vavřejnová V, Němec J, Váňa S. Prevalence of thyroid diseases in two samples of Czech population. A preliminary study. Endocrinol Exp 1989; 23: 97-104.