Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů

Obsah METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ... 5 Selektivní precipitace... 5 Chromatografické metody... 6 Afinitní purifikace... 8 Iontově výměnná chromatografie... 9 Gelová filtrace... 10 Hydrofobní chromatografie... 11 Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant... 13 Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu... 15 Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou... 15 Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu... 15 Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování... 16 Metody sušení produktů... 20 Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů... 20 Krystaly makromolekul... 20 Speciální část frakcionace biopolymerů HA... 21 Redukce molekulové hmotnosti biopolymerů kyselou hydrolýzou... 21 Příprava oligosacharidů enzymatickým štěpením... 22 OVĚŘENÍ ČISTOTY A CHARAKTERIZACE BIOMOLEKUL... 23 Ověření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace HPLC... 23 2

Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů HPLC... 24 Afinitní kapalinová chromatografie (bioafinitní chromatografie)... 24 Gelová permeační chromatografie (SEC)... 25 Iontově výměnná chromatografie... 25 Hydrofobní interakční chromatografie HIC... 26 Charakterizace proteinů a polypeptidů pomocí elektroforézy... 26 Jednorozměrná denaturační elektroforéza... 26 Jednorozměrná elektroforéza za nativních podmínek... 28 Dvourozměrná gelová elektroforéza... 28 Izoelektrická fokusace (IEF)... 28 Kapilární elektroforéza... 29 Volná kapilární elektroforéza... 29 Stanovení molekulových hmotností proteinů a peptidů pomocí SDS-PAGE... 29 Flow field flow frakcionace (FFFF)... 30 Stanovení hydrodynamického poloměru pomocí DLS (Dynamic light scattering)... 33 Rozptyl světla... 34 Brownův pohyb... 35 Hydrodynamický poloměr proteinu (Rh)... 36 3

Princip metody DLS... 36 Vyjádření výsledků distribuce velikosti... 40 Vliv prostředí na difuzní koeficient a tvar nanočástic... 41 Přístroje pro měření pomocí DLS... 42 Výhody a omezení DLS... 43 Ukázka praktické aplikace... 46 Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC)... 47 Doporučená literatura... 50 Internetové zdroje... 51 4

METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ Selektivní precipitace Rozpustnost biomakromolekul ve vodném roztoku je ovlivněna jejich solvatací molekulami vody, která může být ovlivněna změnou hodnoty ph, teploty, iontové síly, přídavkem solí či organických látek rozpustných ve vodě. Kombinací různých srážecích činidel tak byly vytvořeny postupy pro srážení, precipitaci různých skupin makromolekul. Pro úspěšnost precipitace je důležité zvolit nejen vhodné činidlo, ale i vhodnou výslednou koncentraci činidla v precipitovaném vzorku. Změnou koncentrace precipitačního činidla v roztoku se totiž změní specifičnost procesu precipitace. Globulární proteiny, které jsou rozpustné ve vodných roztocích, jsou ve své nativní formě uspořádány tak, že rezidua polárních aminokyselin jsou orientována vně molekuly proteinu, zatímco nepolární vedlejší řetězce směřují do nitra molekuly, a tak nejsou ve styku s vysoce polárním vodným prostředím. Stabilita nativní konformace je dána jednak hydrofobními interakcemi uvnitř molekuly, jednak inter- i intramolekulárními vodíkovými vazbami vně molekuly. Dojde-li k narušení rovnováhy mezi jednotlivými interakcemi, je molekula proteinu denaturována a dochází k precipitaci tohoto proteinu. Tato precipitace může být jak vratná reverzibilní, tak nevratná ireverzibilní. Jedna z reverzibilních metod precipitace proteinů je založena na skutečnosti, že nejnižší rozpustnost vykazuje protein ve svém izoelektrickém bodu. Voda je vysoce polární rozpouštědlo, a tudíž se v ní velmi dobře rozpouští látky s elektrickým nábojem. V izoelektrickém bodu jsou kladné i záporné náboje vyrovnány, takže molekula jako celek je bez náboje, což snižuje její rozpustnost ve vodě. Opětovnou změnou ph lze protein opět denaturovat a převést tak zpět do roztoku. Patrně nejpoužívanější metoda srážení proteinů využívá síranu amonného. Velkou výhodou (NH 4) 2SO 4 je možnost jej připravit v dostatečně velkých koncentracích pro srážení takřka všech proteinů, takřka nepatrná produkce tepla při přídavku jeho roztoku, nižší hustota jeho roztoku umožňující odstranění precipitátu centrifugací a v neposlední řadě i skutečnost, že jeho koncentrovaný roztok je bakteriostatický. Vzhledem ke skutečnosti, že je nutné jej použít pro srážení proteinů, které nejsou příliš zředěné, zařazuje se precipitace pomocí (NH 4) 2SO 4 obvykle mezi počáteční kroky při izolaci proteinů. Precipitát lze od roztoku oddělit centrifugací, následně rozpustit ve vhodném pufru a poté oddělit (nh 4) 2so 4 gelovou filtrací či ultrafiltrací. Specifičtější precipitace lze dosáhnou postupným zvyšováním koncentrace (NH 4) 2SO 4, rozdílné proteiny jsou totiž precipitovány při rozdílných koncentracích (NH 4) 2SO 4. Tepelná denaturace naproti tomu představuje ireverzibilní metodu precipitace. Tímto způsobem lze vysrážet poměrně širokou skupinu nežádoucích proteinů, které se 5

následně oddělí centrifugací. Obvykle spočívá zmíněná metoda v zahřívání míchaného roztoku proteinu na vodní lázni na teplotu 90 C. Nukleové kyseliny jsou vůči ireverzibilní precipitaci odolnější než proteiny. Stejně jako proteiny jsou i nukleové kyseliny polární makromolekuly, které tak lze vysrážet změnou ph či přídavkem méně polárních organických rozpouštědel. Nejpoužívanější precipitační metodou používanou pro srážení nukleových kyselin je precipitace alkoholem. Používá se zejména etanol či isopropanol v přítomnosti 0,1 až 0,5 m octanu sodného či draselného o hodnotě ph 5,0. Následkem konformačních změn nukleových kyselin dochází k jejich precipitaci. Při vyšších koncentracích probíhá precipitace kvantitativně i při 25 c, zatímco při nižších koncentracích nukleových kyselin je pro jejich kvantitativní precipitaci nutná inkubace v mrazu. Pro velmi zředěné roztoky nukleových kyselin lze použít precipitaci pomocí 10% polyethylenglykolu 6000. Jedná se o časově náročnější metodu, která však podobně jako srážení proteinů síranem amonným umožňuje frakční precipitaci. Nukleové kyseliny vyšších molekulových hmotností se totiž sráží již při nižších koncentracích polyethylenglykolu, zatímco nukleové kyseliny s nižší molekulovou hmotností se stále nachází v roztoku. Chromatografické metody Velmi účinnou separační metodou, která našla široké uplatnění jak při izolaci látek ze směsí, tak při stanovení rozličných látek v široké škále vzorků, je chromatografie. Ta je založena na rozdělení látky mezi dvě nemísitelná prostředí, stacionární fázi ukotvenou na pevném nosiči-matrici a mobilní fázi protékající kolem stacionární fáze. Bylo vyvinuto mnoho chromatografických metod, které se od sebe mnohdy výrazně liší. Mohou být vhodné pro separaci látek nízkomolekulárních i makromolekul. Separaci lze provádět podle rozdílné molekulové hmotnosti, polarity, izoelektrického bodu či dle přítomnosti funkční skupiny či značky, která specificky interaguje se stacionární fází. Podle prostorového uspořádání stacionární fáze dělíme chromatografii na plošnou a sloupcovou. Plošná chromatografie má stacionární fázi uspořádanou v ploše, jedná se buď o tenkovrstvou chromatografii (TLC), u níž je stacionární fáze umístěna na tenké vrstvě, např. Na hliníkové folii, nebo o papírovou chromatografii (PC), kde je stacionární fáze voda adsorbovaná v pórech papíru. Plošná chromatografie je nenáročná na laboratorní provedení, papírovou chromatografii lze provést i s obyčejným savým papírem, ovšem v současné době ztrácí na svém významu. Slouží zejména pro relativně rychlou detekci kontaminantů či drog, např. V moči, a některých reakčních produktů v organické chemii. U sloupcové chromatografie tvoří stacionární fáze náplň kolony nebo tenké kapiláry. Mobilní fáze protéká kolonou nebo kapilárou a unáší s sebou vzorek až na 6

konec kolony. Za kolonou či kapilárou se stacionární fází se nachází detektor, který zaznamená průchod vzorku. Svým významem sloupcová chromatografie výrazně převyšuje chromatografii plošnou. Mobilní fází může být u sloupcové chromatografie plyn, pak hovoříme o plynové chromatografii (GC), nebo kapalina v případě kapalinové chromatografie (LC). V případě plošné chromatografie je mobilní fází kapalina. GC má velký význam zejména v analytické chemii pro separaci plynných a těkavých nízkomolekulárních látek. Příkladem jejího využití je stanovení obsahu alkoholu v krvi. Pro GC se jako nosiče stacionární fáze využívají tenké kapiláry, jejichž délka dosahuje i několika desítek metrů. Naproti tomu LC lze použít pro separaci vysokomolekulárních i nízkomolekulárních látek. Stacionární fáze může být rovněž v tenké kapiláře, ale i v koloně, jejíž vnitřní průměr může dosáhnout i několika cm. Kapalina tvořící mobilní fázi se může pohybovat kolonou buď vlivem gravitace, nebo pomocí pumpy. Použitím pumpy se zvyšuje zpětný tlak stacionární fáze a rychlost průtoku mobilní fáze. Složení mobilní fáze může být při celé separaci konstantní, nebo se může v průběhu separace měnit. V závislosti na tom hovoříme o isokratické, krokové (jednorázová změna) či gradientové (postupná změna mobilní fáze) eluci. Po ukončení eluce je třeba promýt kolonu původní mobilní fází, aby byla připravena pro další použití. Kapalinovou chromatografii je možné rozdělit na mnoho rozmanitých metod. Tabulka 5.1. Nejběžnější typy kapalinové chromatografie Typ LC Princip Adsorpční chromatografie Afinitní chromatografie Gelová chromatografie Adsorpce na povrchu pevné stacionární fáze Selektivní interakce analytu se stacionární fází (např. antigen protilátka) Zadržování malých molekul jejich vstupem do pórů gelu Hydrofobní chromatografie Iontově chromatografie Reverzní chromatografie výměnná Hydrofobní interakce makromolekul se stacionární fází ve vodném prostředí Interakce iontů s opačně nabitými skupinami stacionární fáze (zvlášť pro anionty a kationty) Záchyt nepolárních látek nepolárními řetězci stacionární fáze v polárním organickém prostředí Důležitou součástí sloupcové chromatografie je detektor. Ten se umisťuje za kolonu a umožňuje detekovat a stanovit látky opouštějící kolonu a určit čas potřebný k jejich průchodu kolonou eluční čas. V chromatografii se používá mnoho typů detektorů. Nejčastěji se používá spektrofotometr, hmotnostní spektrometr, voltmetr, ampérmetr, vodivostní detektor, fluorescenční detektor a další. Volba správného 7

detektoru je takřka stejně důležitá jako volba správné chromatografické metody. K detektoru bývá připojeno záznamové zařízení, obvykle počítač nebo posuvný zapisovač, které ukládá naměřená data. Jejich grafickým vyjádřením je chromatogram zobrazující závislost signálu detektoru na čase. Afinitní purifikace Afinitní chromatografie je nejefektivnější chromatografická metoda, přestože není možné ji aplikovat na všechny problémy. V praxi se při purifikacích obvykle jedná o poslední (ne-li jediný) purifikační krok. Využívá biochemicky specifickou interakci mezi dvěma druhy látek. Jedná se např. O dvojici antigen protilátka, enzym substrát, enzym koenzym či protein specifický ligand. Lze využít i tak vysoce specifickou interakci, jako je interakce komplementárních řetězců nukleových kyselin. Základním předpokladem afinitní chromatografie je schopnost matrice kovalentně navázat ligandy, které se specificky váží na purifikovanou látku. Při purifikaci polymerních produktů z geneticky modifikovaných organismů se často využívá specifická značka určená pouze pro usnadnění purifikace. Příkladem jsou proteiny obsahující na c-konci řetězce šestkrát his, které jsou specificky zachyceny kyselinou nitrilotrioctovou koordinačně spojenou s Ni 2+ nebo Co 2+. Mnoho postupů je natolik specifických, že lze z buněčného extraktu získat v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie požadovanou látku. Některé ligandy a jimi zachycované molekuly jsou uvedeny v Tab. 5.2. Při afinitní chromatografii se využívají dvě mobilní fáze. Jedná se o ekvilibrační a eluční pufr. Ekvilibračním pufrem je kolona promývána před nanesením vzorku, který by měl být rozpuštěn ve stejném či podobném pufru. Po nanesení vzorku je dále na kolonu čerpán ekvilibrační pufr do doby, než dojde k eluci nezachycených látek. Po eluci nezachycených látek dojde k zapojení elučního pufru, slouží k vymytí látek specificky zachycených na koloně. Jeho eluční síla je oproti ekvilibračnímu pufru výrazně vyšší díky obsahu stejného ligandu, který zachycuje purifikovanu látku či jeho analogu. Tento volný ligand kompetuje (soutěží) s ligandem vázaným k matrici o vazbu do vazebného místa zachycené molekuly, a tak ji uvolňuje z vazby s ukotveným ligandem. Jinou možností zvýšení eluční síly bývá změna ph, použití chaotropních solí či organických látek narušujících vazbu ligandu s purifikovanou molekulou. Např. Proteiny s histidinovou značkou lze z kolony s obsahem Ni 2+ či Co 2+ vymýt pomocí pufru s imidazolem. Změna ph či použití chaotropních solí může vézt k poškození purifikovaných komponent. Existují i protokoly, v nichž se nepoužívá kroková, ale gradientová eluce. 8

Je-li purifikovaná látka vázána na kotvený ligand příliš pevně, bývá prospěšné po aplikaci elučního činidla na kolonu zastavit jeho tok a nechat je chvíli působit. Obvykle se tok zastavuje na 10 minut až 2 hodiny. Afinitní chromatografii lze rovněž použít pro selektivní odstranění vybraných kontaminantů. V tomto případě se vybírá stacionární fáze tak, aby zachytila tuto nečistotu, která je po získání frakce se vzorkem vymyta elučním pufrem dle výše zmíněného principu. Tabulka 5.2. Některé ligandy používané při afinitní chromatografii Ligand Zachycované molekuly Arginin Prothrombin, plasminogen Kyselina nitriloctová v komplexu Co 2+ či Ni 2+ Proteiny s histidinovou značkou Polymyxin Endotoxin Heparin Protein A, protein G 5 -AMP Nukleové kyseliny Lektin 2,5 -ADP Proteiny vázající nukleové kyseliny Imunoglobin G ATP dependentní kinasy, NADP + dependentní enzymy Komplementární řetězce nukleových kyselin, histony Polysacharidy, glykoproteiny NADP + dependentní enzymy Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie, nazývaná často též iontoměničovou chromatografií, je založena na interakci iontů vzorku a mobilní fáze s opačně nabitými skupinami ve stacionární fázi. Podle náboje zadržovaných iontů dělíme iontoměniče na anexy a katexy. Anexy zachycují anionty a jejich stacionární fáze tudíž obsahuje kladně nabité skupiny, zatímco katexy zachycují kationty. Díky skutečnosti, že mnoho biomakromolekul nese v nativním stavu náboj, jehož hodnota i znaménko se při změně ph postupně mění, je iontoměničová chromatografie významnou purifikační metodou pro separaci proteinů, polysacharidů a dalších biopolymerů. Tyto polymery totiž obsahují mnoho protonizovatelných skupin, přičemž jejich míra protonizace je závislá na hodnotě ph. Jako nosiče stacionární fáze se využívá mnoho rozličných polymerů. Z přírodních polymerů se jedná o celulosu, dextran či agarosu, mezi syntetické nosiče patří polystyren, polyakrylamid a mnoho dalších. Tyto nosiče jsou derivatizovány nabitými skupinami. Slabé anexy obsahují obvykle primární či sekundární aminoskupinu, silné anexy kvartérní aminoskupinu. Záporný náboj slabých katexů je tvořen karboxylovými 9

skupinami, zatímco u silných katexů se využívá síranová skupina. Slabé katexy potřebují mobilní fázi s ph kolem 4, zatímco slabé anexy s ph kolem 11. Přiblíží-li se ph k neutrální hodnotě, ztrácí tyto katexy i anexy svůj náboj. Naproti tomu silné katexy i anexy je možné použít při širším rozsahu ph. Dostupné jsou ionexy s pracovním rozsahem jedné jednotky i deseti jednotek ph. Před nanesením vzorku je nutno promýt kolonu mobilní fází, která bude použita pro nanášení vzorku a promývání kolony. Hodnota ph mobilní fáze vytékající z kolony musí odpovídat hodnotě mobilní fáze vstupující do kolony. V opačném případě nelze nanést vzorek na kolonu. Eluční síla mobilní fáze závisí na jejím ph a na její iontové síle. V případě změny ph je změna iontové síly způsobena změnou v ionizaci separovaných látek. Slabé kyseliny se v bazickém prostředí vyskytují ve formě aniontu a v kyselém ve formě neutrálních molekul. Podobně je tomu u slabých bází. Při zvýšení iontové síly mobilní fáze se k nabitým skupinám stacionární fáze dostává větší množství iontů, které vzájemně soutěží (kompetují) o možnost iontové vazby s touto skupinou. Mobilní fáze je u iontově výměnné chromatografie buď gradientová, či se skokovým zvýšením eluční síly, jak je tomu u afinitní chromatografie. Gradientová mobilní fáze s postupně rostoucí či klesající hodnotou ph je využívána při dělení látek dle izoelektrického bodu. Sbíráním frakcí mobilní fáze tak můžeme získat separované látky vzorku tak, jak postupně s měnícím se ph ztrácí svůj náboj díky vyrovnání počtu kladně a záporně nabitých skupin. Při volbě podmínek iontově výměnné chromatografie je nutné uvážit mnoho faktorů, které úží možný výběr experimentu. Jedná se o náboj separovaných molekul a jeho velikost. Molekula s jedním záporným nábojem je eluována při nižší koncentraci chloridů v mobilní fázi než molekula se dvěma či třemi náboji. Dále je nutno vzít v úvahu izoelektrický bod hodnotu ph, při které je celkový náboj molekuly, obsahující kladně i záporně nabité skupiny, nulový. Kladně nabitá molekula s vyšší hodnotou isoelektrického bodu je tudíž eluována při vyšší hodnotě ph. Gelová filtrace Gelová filtrace umožňuje separovat od sebe látky na základě jejich rozdílné molekulové hmotnosti a je založena na existenci přesně definovaných či různě velkých pórů v částicích gelu. Malé molekuly při průchodu kolem částic gelu vstupují difuzí do zmíněných pórů a jsou tak zadržovány, zatímco velké molekuly se do těchto pórů nedostanou a jsou vylučovány z kolony. Proto se pro gelovou filtraci používá i označení gelová permeační (zadržovací) či exlusní (vylučovací) chromatografie. 10

Gelová filtrace je použitelná zejména pro oddělení nízkomolekulárních látek od látek vysokomolekulárních, např. Pro odsolení roztoků proteinů, separaci makromolekul podle jejich molekulové hmotnosti a určení molekulové hmotnosti makromolekul. V poslední zmiňované funkci ji však stále častěji nahrazuje hmotnostní spektrometrie. Stacionární fází u gelové filtrace je kapalina uvnitř pórů gelu. Ideální nosič stacionární fáze, který vytváří gelové částice, by měl být hydrofilní polymer bez náboje, maximálně inertní a pevný. V praxi se používají především přírodní polymery na bázi agarosy či dextranu. Komerčně dostupné jsou gely s různým stupněm zesíťování polymeru, které zvyšuje jeho pevnost a rovněž určuje velikost pórů gelu. Velikost těchto pórů určuje rozsah velikosti částic, které lze daným gelem od sebe oddělit. Gely se prodávají pod různými komerčními názvy. Jedním z nejpopulárnějších materiálů je Sephadex, dextran zesíťovaný pomocí epichlorhydrinu. Sepharosa je vyráběna z agarosy, polymeru D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Oproti Sephadexu je Sepharosa vhodná i pro dělení větších makromolekul až do molekulové hmotnosti 40,000 kda, u Sephadexu je to maximálně 750 kda. Krom materiálu a velikosti pórů se dodávané nosiče liší i velikostí částic, která se pohybuje od 10 do 300 µm. Superdex a Superosa odpovídají svým materiálovým složením Sephadexu, resp. Sepharose. Oproti nim poskytují lepší výsledky, avšak jsou výrazně dražší. Používají se tedy jen v případech, kdy je kladen velký důraz na kvalitu separace. Vzhledem k tomu, že zde nedochází ke specifickým interakcím, ani není potřeba měnit náboj separovaných molekul, používá se isokratická mobilní fáze. Důležité však je, aby mobilní viskozita mobilní fáze nebyla výrazně nižší než viskozita vzorku; doporučuje se, aby byla minimálně poloviční. To vytváří problémy zejména při obsahu glycerolu ve vzorku, a nikoliv v mobilní fázi či při vysoké koncentraci biopolymerů. Gelová filtrace je často používaná analyticky, zejména pro stanovení molekulové hmotnosti nativních proteinů. V tomto případě se experiment provádí nejméně dvakrát. Jednou pro kalibraci, kdy se jako vzorek použije směs standardních proteinů známé molekulové hmotnosti, a minimálně jednou při samotném měření molekulové hmotnosti vzorku. Do grafu se pak zanáší dekadický logaritmus molekulové hmotnosti polymeru na osu x a poměr elučního objemu k mrtvému objemu na osu y. Z regresní přímky se pomocí rovnice V e/v 0 = - a.log M r + b, ve které jsou a a b jsou empirické konstanty, vypočítá molekulová hmotnost polymeru. Hydrofobní chromatografie Mnohé molekuly obsahují na svém povrchu nepolární hydrofobní oblasti. Rozdílů mezi nepolárním charakterem molekul se využívá i pro jejich separaci. Nízkomolekulární 11

látky jsou na základě toho separovány adsorpční chromatografií, zatímco pro makromolekuly se používá hydrofobní chromatografie (HIC). Tento typ chromatografie využívá jako nosiče stacionární fáze hydrofilní gely, na nichž jsou navázány nepolární alkylové či arylové skupiny. Jedná se často o methyl, oktyl, oktadecyl či fenyl. Tím je hydrofobní chromatografie shodná s chromatografií na reverzní fázi. Obě metody se však liší stupněm substituce hydrofilního gelu. V případě hydrofilní chromatografie je koncentrace substituovaných skupin v rozmezí od 10 do 50 µmol.ml -1 gelu, u chromatografie na reverzní fázi je substituce přibližně o řád vyšší. Rovněž eluční roztok se u obou chromatografií liší. Pro hydrofobní chromatografii je používán roztok nižší iontové síly a bez organických rozpouštědel typických pro chromatografii na reverzní fázi. Vazba proteinu k matrici závisí na mnoha faktorech. Z vlastností matrice se jedná především o její funkční skupiny a stupeň derivatizace, z vlastností polymerů pak zejména o velikost a charakter hydrofobní části povrchu. Proteiny s větší hydrofobní částí povrchu jsou vázány těsněji než proteiny s menším hydrofobním regionem. Těsnější vazbu k hydrofobním regionům vykazují alkylové substituenty, u kterých se těsnost vazby zvyšuje s délkou řetězce. Těsnější vazby se docílí i použitím matrice s vyšším stupněm derivatizace. Matrice pro hydrofobní chromatografii dosahují velké kapacity záchytu polymerů. Podle typu matrice, mobilní fáze a polymeru se může na 1 g gelu zachytit až 50 mg polymeru. Vznik a pevnost hydrofobních vazeb polymerů k matrici velmi závisí na použité mobilní fázi. Vyšší koncentrace soli zvyšuje pevnost vazby polymerů k matrici. Mimo koncentraci je důležitá i volba konkrétní soli v mobilní fázi. Pro kationty i anionty byla vypracována Hofmeisterova řada iontů: NH 4 + > K + > Na + > Li + > Mg 2+ > Ca 2+ PO 4 3 > F ~ SO 4 2 > HPO 4 2 > CH 3COO > Cl > Br > NO 3 > I > SCN. Tato řada srovnává ionty podle jejich podpory vazby polymeru k matrici. Obě uvedené řady obsahují jen několik významnějších iontů, ačkoliv byl studován vliv mnoha jiných, které byly rovněž zařazeny do Hofmeisterovy řady. Ionty v levé části řady navíc zvyšují stabilitu proteinů. Obojí je dáno zvýšením organizovanosti molekul vody v okolí iontu, kdy voda obaluje jednotlivé ionty v několika vrstvách. Na průběh hydrofobní chromatografie má vliv i hodnota ph mobilní fáze, avšak vliv změny ph je často nepředvídatelný. Mobilní fází je obvykle pufr s obsahem vhodné soli, často se jedná o fosforečnanový pufr nastavený na ph 7,0 s 1M (NH 4) 2SO 4. Eluce se zajišťuje 12

postupným snižováním koncentrace soli. Často je navíc usnadňována přídavkem organických látek, zejména glycerolu či neionogenních detergentů. Ultrafiltrace a dialýza nízkomolekulárních kontaminant Pro odstranění nízkomolekulárních komponentů, např. Síranu amonného z precipitace proteinů, se používají dvě podobné metody, dialýza a ultrafiltrace. Obě metody jsou založeny na stejném principu. Jedná se o průchod malých molekul přes membránu s póry s přesně definovanou velikostí. Ta určuje, jak velké molekuly jsou membránou zachyceny a jak velké molekuly jsou schopny projít přes membránu. Tato hranice je důležitou charakteristikou membrány, kterou je nutné vzít při volbě membrány v úvahu a je označována jako cut-off value. Její hodnota se udává v kda a je míněna pro globulární proteiny, které při vyšší molekulové hmotnosti prochází přes membránu jen velmi pomalu, nebo neprochází vůbec. Základní rozdíl mezi oběma metodami spočívá v síle, která pohání transport molekul přes membránu. V případě dialýzy se jedná o prostou difuzi přes membránu, zatímco v případě ultrafiltrace je průchod roztoku přes membránu poháněn vnějším tlakem. Ultrafiltrace je proto rychlejší než dialýza. Dialýza. Nejjednodušším provedením dialýzy je použití dialyzačního střívka naplněného dialyzovaným roztokem, které se vloží do nádoby s dialyzačním roztokem, do kterého se difuzí přesouvají nízkomolekulární komponenty. Vzhledem k vyšší koncentraci rozpuštěných látek v dialyzovaném roztoku uvnitř střívka může zároveň dojít ke vstupu rozpouštědla do střívka a následnému nárůstu jeho objemu. Proto je nutné plnit střívko jen částečně. Dialyzační roztok by měl obsahovat pufr, který stabilizuje jeho ph na požadované hodnotě. Rychlost difuze lze určit pomocí Fickova zákona. Podle něj záleží na ploše, přes kterou difuze probíhá, koncentračním gradientu a difuzní konstantě závislé na velikosti a tvaru částice. Dialýza je poměrně zdlouhavá metoda, která probíhá obvykle 12 až 24 hodin. Ukončení dialýzy lze detekovat měřením konduktivity dialyzačního roztoku. Dialýzu lze urychlit výměnou dialyzačního roztoku za čistý. Membrány a střívka pro dialýzu se obvykle vyrábí z celulosy a jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí 1 až 50 kda. Pro dialýzu malých objemů do 1 ml lze použít buď komerčně vyráběné mikrodialyzační komůrky, nebo je možné je vyrobit přímo v laboratoři z ependorfových trubiček odstraněním víčka a překrytím jejich konců dialyzační membránou, kterou je nutné dobře upevnit. 13

Dialýzu lze použít i pro zakoncentrování roztoku makromolekul. V tomto případě se využije polyetylen glykol přidaný do dialyzačního pufru, který postupně nasává vodu a zvětšuje svůj objem. Pro odstranění nízkomolekulárních látek lze kromě dialýzy použít i obdobnou metodu, ultrafiltraci či gelovou filtraci. Ty jsou sice rychlejší, ale rovněž náročnější na laboratorní vybavení a zručnost. Ultrafiltrace. Ultrafiltrace se ve svém principu podobá dialýze do té míry, že je možné pro ni použít dialyzační střívko umístěné v nádobě připojené k vakuové pumpě. Přesto je výhodnější použít membránu určenou přímo pro ultrafiltraci. Membrána pro ultrafiltraci se skládá ze dvou vrstev. První, obrácená směrem k ultrafiltrovanému roztoku, je tenká a obsahuje póry s přesně definovanou velikostí. Druhá vrstva je širší a obsahuje větší póry, jejichž velikost již nemusí být přesně určena. Při sestavování ultrafiltrační komůrky je důležité dbát na správnou orientaci membrány; strana přivrácená směrem k roztoku bývá obvykle hladší a při pohledu proti světlu se více leskne. V současnosti se vyrábí různé druhy membrán pro ultrafiltraci. Jejich hodnota cutoff se pohybuje v rozmezí od 0,5 kda po 1000 kda (membrána Millipore PCXK). Jednotlivé membrány se od sebe liší i materiálem, ze kterého jsou vyráběny. Je možné zakoupit membránu z acetátu celulosy, regenerované celulosy, hydrofilních polymerů, syntetických polymerů či inertních polymerů. Do pórů membrány jsou samozřejmě tlačeny i molekuly, jejichž hmotnost přesahuje hodnotu cut-off. Menší z nich mohou velmi pomalu projít přes membránu, jiné se však v pórech zapříčí a ucpou je. Aby k tomu nedocházelo, je při každé ultrafiltraci použito magnetické míchadlo. Jedná se o oblý tyčový magnet, který se vlivem otáčení magnetu v míchačce, na kterou je ultrafiltrační komůrka položena, otáčí a zajišťuje tak míchání kapaliny v ultrafiltrační komůrce. Elektromagnetické míchadlo se samozřejmě spolu s míchačkou nevyužívá jen při ultrafiltraci, ale všude tam, kde je třeba zajistit míchání roztoku. Na rozdíl od dialýzy je při ultrafiltraci pro urychlení procesu rozpouštědlo hnáno přes membránu tlakem. Tento tlak může být vytvořen přetlakem inertního plynu, nejčastěji dusíku, v ultrafiltrační komůrce, vakuem v nádobě pro zfiltrovaný roztok či centrifugací. Je-li makromolekulární látka, kterou chceme zahustit či odsolit, odolná vůči oxidaci vzdušným kyslíkem, je možné použít k vytvoření tlaku v komůrce namísto dusíku vzduch. Pro ultrafiltraci prováděnou při centrifugaci se vyrábí zvláštní kyvety pro použití v rotorech s fixním úhlem. Tyto kyvety umožňují v relativně krátké době zahuštění z několika ml i na méně než 100 µl. 14

Je-li účelem ultrafiltrace snížení koncentrace nízkomolekulárních látek v roztoku, přidává se k tomuto roztoku další roztok, který tyto kontaminanty neobsahuje, a tento roztok se zahustí na požadovaný objem. Tím dojde ke snížení koncentrace kontaminantu v koncentrátu. Je-li potřeba výrazné snížení koncentrace kontaminantů, je výhodnější použít opakovanou ultrafiltraci menším objemem než jednu ultrafiltraci menším objemem. Chceme-li například snížit koncentraci kontaminantu v 5 ml roztoku na 1 % původní koncentrace, potřebujeme při jedné ultrafiltraci přidat 495 ml čistého roztoku, zatímco při 2 ultrafiltracích použijeme vždy jen 45 ml čistého roztoku a při čtyřech ultrafiltracích jen po 11 ml roztoku. Spotřeba roztoku tak při dosažení stejného výsledku činí jen 18, resp. 9 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Výhodnost opakované ultrafiltrace stoupá s rostoucím poměrem mezi původní a požadovanou koncentrací ultrafiltrovaného roztoku. Bude-li třeba snížit koncentraci nízkomolekulárních kontaminant na setinu procenta, bude spotřeba promývacího roztoku při 2, resp. 4 ultrafiltracích činit jen 2, resp. 0,4 % spotřeby při jednorázové ultrafiltraci. Uvolnění cílové podjednotky z fúzního proteinu Štěpení fúzního proteinu specifickou endoproteázou Získání rekombinantního proteinu v aktivní a vysoce čisté formě je jedním ze základních metodik biotechnologického výzkumu. Při přípravě těchto proteinů se využívá fúzních proteinů, jejichž součástí je sekvence aminokyselin, která umožňuje jejich purifikaci. Tyto sekvence však mohou omezovat biologickou aktivitu sledovaného proteinu. Odštěpení těchto sekvencí pomocí specifických endoproteáz, enzymů štěpících určitou aminokyselinovou sekvenci, je často nezbytné pro další využití cílového proteinu. Specifické endoproteasy minimalizují nechtěné nespecifické štěpení, které se vyskytuje při štěpení fúzních proteinů chemickými látkami (bromkyan, hydroxylamin, ph). Příkladem specifických endoproteas je enterokinasa rozpoznávající aminosekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys X-, dále pak prolin, specifické endoproteasu hydrolyzující peptidy, endoproteáza AspN selektivně štěpící peptidové vazby mezi N-koncem a kyselinou aspartámovou, faktor Xa štěpící sekvenci Ile-Glu(nebo Asp)-Gly-Arg nebo trombin štěpící sekvenci Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser. Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy od rekombinantního proteinu Purifikace fúzních a následně rekombinantních proteinů je proces zahrnující několik na sebe navazujících chromatografických purifikací, které musí být vždy optimalizovány. Pro zjednodušení tohoto procesu byla vyvinuta jednokroková afinitní purifikace fúzního proteinu, tedy cílového proteinu značeného afinitní koncovkou připojenou na n- nebo c- konec rekombinantního proteinu. Jako afinitní koncovka jsou 15

úspěšně používány malé peptidy, např. Poly-His, poly-arg, c.myc, Flag, nebo velké peptidy, např. Glutation s transferasa, doména vážící chitin. Abychom zajistili biologickou aktivitu rekombinantního proteinu, musíme tuto koncovku odstranit před jeho samotným využitím. Z tohoto důvodu je mezi rekombinantní protein a koncovku umístěna krátká aminokyselinová sekvence, která je rozpoznávána specifickou endoproteázou. Tento způsob přípravy rekombinantního proteinu má několik omezení: 1. Odseparování proteinu od fúzní koncovky a použité endoproteasy vyžaduje další purifikační krok. 2. Použité proteasy nejsou zcela specifické a mohou částečně štěpit cílový protein. 3. Štěpené místo může být nepřístupné pro endoproteasu. 4. Štěpení vyžaduje dlouhý reakční čas a je drahé. K překonání uvedených omezení byl vyvinut samoštěpící systém, kdy je tzv. Self processing modul umístěn mezi cílový protein a afinitní kotvou. Po navázání fúzního proteinu na kolonu a odmytí všech kontaminujících nečistot je štěpící aktivita samoštěpícího modulu aktivována malou molekulou a vyúsťuje v uvolnění rekombinantního proteinu s tím, že afinitní koncovka včetně samoštěpící modulu zůstává na koloně. Vhodný samoštěpící modul splňuje následující podmínky: 1. Štěpí pouze vazbu mezi cílovým proteinem a tímto modulem. 2. Není aktivován in vivo, pouze po cílené indukci in vitro. Izolace proteinu z inkluzních tělísek a jejich refoldování Přirozeně produkované proteiny jsou v buňce bezprostředně po translaci skládány do své nativní struktury. Ta je však v mnoha případech heterologní exprese (například eukaryontní proteiny exprimované v mikroorganismech) či po denaturační purifikaci narušena. Nesprávně složené proteiny vytváří v bakterii (pro nás nejdůležitější je E. coli) nerozpustné agregáty, tzv. Inkluzní tělíska. Ve formě inkluzních tělísek se tak vyskytují až tři čtvrtiny proteinů biotechnologicky exprimovaných v E. coli. Za stabilitu nativní konformace i za vznik inkluzních tělísek z nesprávně složených proteinů a jejich agregátů jsou odpovědny stejné typy interakcí. Jedná se o hydrofobní interakce mezi nepolárními vedlejšími řetězci aminokyselin uvnitř proteinu či inkluzního tělíska, iontové interakce a kovalentní či vodíkové vazby. Důvod vzniku inkluzních tělísek dosud není plně objasněn, ale předpokládá se, že proteiny jsou exprimovány ve větším množství, než je kapacita bakteriální buňky pro jejich správné skládání. Z toho vyplývají možnosti, jak se tvorbě inkluzních tělísek vyhnout. Často je účinné snížení teploty pro kultivaci exprimujících buněk z 37ºC na pokojovou teplotu a patřičné prodloužení doby exprese či použití lowcopy expresního plasmidu. Náročnější metodou je koexprese chaperonů potřebných pro skládání proteinu do správné konformace (u E. coli hlavně molekuly GroEl a GroEs). V některých případech se osvědčil krátký tepelný šok (42 C), po kterém dochází v exprimujících buňkách k přechodnému zvýšení exprese proteinů tepelného šoku zvyšujících stabilitu nascentních proteinů. Příznivý vliv na rozpustnost proteinů může mít 16

také typ připojené značky (Tagu). Fúze s doménovými nebo proteinovými značkami (celulose binding domains, glutathione s-transferase tag (GST), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin (TRXA), transcription termination anti-termination factor (NUSA), protein disulfide isomerase i) často zvyšuje rozpustnost a stabilitu rekombinantních proteinů. Navíc některé značky jsou s výhodou použitelné pro afinitní purifikaci. Kvůli své velikosti ale pro většinu aplikací musejí být z proteinu po purifikaci odstraněny. V současné době je také možno použít speciální kmeny E. coli geneticky upravené pro expresi eukaryotických proteinů jako je kmen Rosseta TM nesoucí geny pro trna rozeznávající kodony vzácné v E. coli, kmen Origami TM mutovaný v genech pro thioredoxin reduktasu a glutathion reduktasu umožňující tak tvorbu disulfidických můstků v cytoplasmě nebo kmen Rrosseta-Gami TM kombinující obě tyto vlastnosti. Obrázek 5.1. Inkluzní tělíska v elektronové mikroskopii Inkluzní tělíska (označená šipkami) u kultury E. coli. (převzato z www stránek Working group downstream processing at the Department of biotechnology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Vienna, Austria). Z inkluzních tělísek je možné získat funkční a správně složený protein a to často ve vyšší čistotě a koncentraci, než jakou můžeme dosáhnout při expresi proteinu za podmínek, kdy se inkluzní tělíska netvoří. Postup, který umožňuje převést protein 17

z inkluzních tělísek do nativní plně funkční podoby se nazývá refoldování. Jelikož není k dispozici univerzální refoldovací pufr a výsledek refoldování je poměrně nejistý, využívá se při produkci proteinů jen omezeně. Ačkoliv je refoldování poměrně levné a rychlé, mnoho pracovníků při expresi proteinu v nerozpustné formě volí změnu expresního systému. V současnosti je možno z inkluzních tělísek refoldovat více než polovinu proteinů. Pro ověření správné konformace získaného proteinu je třeba mít k dispozici nástroj potvrzující, že produkt je refoldování převeden do nativní formy. Je možno využít: - stanovení enzymové aktivity - ověření imunogenity experimentální vakcinací - stanovením reaktivity s protilátkami proti konformačním epitopům - ověření vazby na receptor nebo ligand - použití spektroskopických metod Obrázek 5.2. Schéma purifikace proteinu z inkluzních tělísek Inkluzní tělíska Denaturace a solubilizace (8M Urea, 6M Guanidin hydrochlorid, Mercaptoethanol, detergenty) Purifikace za denaturačních podmínek (afinitní chromatografie) Čistý denaturovaný solubilní protein Renaturace 18

Čím více je o daném proteinu známo, tím větší je pravděpodobnost úspěchu. Postup pro refoldování některých proteinů lze nalézt v databázích refoldování, jako je např. Refold, který je k dispozici na internetových stránkách melbournské univerzity monash (http://clims.med.monash.edu.au/). Inkluzní tělíska lze získat z buněk jejich lyzováním, centrifugací a promytím pelety roztokem tritonu x-100 nebo deoxycholátu. Rozpuštění (solubilizace) inkluzních tělísek vyžaduje narušení interakcí, které se podílejí na jejich vzniku a stabilitě. Toho je možné dosáhnout přídavkem chaotropních činidel (8M močovina, 8M hydrochlorid guanidinu apod.) Či detergentů (sarkosyl, SDS apod.) A redukčních činidel (2- merkatoethanol nebo dithiotreitol). Rychlejší a účinnější solubilizace se dosáhne použitím hydrochloridu guanidia, zatímco močovina je výhodnější při nanášení na gel pro SDS- PAGE elektroforézu. Proto se v mnoha protokolech v průběhu purifikace přechází z hydrochloridu guanidinu na močovinu, což může být provedeno např. při chromatografické purifikaci, kdy je na kolonu nanesen vzorek v roztoku hydrochloridu guanidinu, ale eluční pufr obsahuje močovinu. Samotné renaturaci často předchází purifikace denaturovaného proteinu. Nejvýhodnější je použití afinitní chromatografie v případě, že obsahuje polyhistidinovou značku, naopak problematické může být použití hydrofobní či iontoměničové chromatografie. Při renaturaci jsou solubilizační činidla odstraněna a nahrazena pufrem, jenž podporuje správné složení proteinu do aktivní formy a umožňuje následné použití proteinu, tj. Má pokud možno fyziologické ph a osmotický tlak. Je-li protein jednou správně složen, může být obvykle pro další použití rozpuštěn v různých pufrech. Jedna z prvních metod refoldování v roztoku využívala dialýzu. Protein v dialyzačním střívku je ve více krocích dialyzován za použití pufrů, které se svým složením postupně přibližují finálnímu refoldovacímu pufru. Při průtokové metodě se složení pufru nemění skokově, ale plynulým gradientem. Tato metoda vyžaduje desítky hodin a řádově litry pufrů. Nejdynamičtěji se rozvíjející metodou refoldování je rychlá diluční metoda, která je při nulových či nízkých zkušenostech s refoldováním nejvýhodnější. Protein se postupně po malých dávkách přidává do nadbytku nativního pufru za stálého míchání.. Jsou-li podmínky ideální, protein se po zředění v průběhu několika sekund správně složí do nativní konformace. Odstranění solubilizačních činidel a jejich nahrazení nativním pufrem může být také provedeno přímo na koloně při afinitní purifikaci, kdy eluován je již refoldovaný protein. 19

Do renaturačních pufrů se často přidávají aditiva, snižující agregaci proteinů a/nebo usnadňující tvorbu disulfidických vazeb. Patři mezi ně hlavně arginin (0,5 1m), glycerol, oxidovaný a redukovaný glutathion, dithiotreitol, polyethylen glykol, detergenty, edta atd. Efektivita aditiv je jen obtížně predikovatelná a jejich účinnost je nutno ověřovat empiricky. Je také možno zakoupit komerční refoldovací kity obsahující různé koncentrace a poměry aditiv, které mohou poskytnout za spotřeby minima vzorku cenné informace pro refolding ve větším měřítku. Metody sušení produktů Stabilizace biopolymerů a rekombinantních proteinů Proteiny jsou amfifilní molekuly, tedy molekuly mající jak hydrofobní, tak hydrofilní skupiny. Rozpustnost proteinu ve vodných roztocích úzce souvisí s jejich aminokyselinovým složením a jejich solvatačním obalem, tj. Vrstvou molekul vody a iontů, které obalují jejich molekuly. Příčinnou solvatačního obalu jsou elektrostatické síly mezi polárními strukturami proteinů a dipóly vody. Rozpustnost proteinů se s rostoucí koncentrací solí zpravidla nejprve zvyšuje (vsolovací efekt), prochází maximem a posléze klesá (vysolovací efekt). Vsolování je způsobeno vytvořením iontového oblaku kolem ionizovaných skupin biopolymeru dochází ke snížení interakce nabitých skupin biopolymeru mezi sebou a zvýšení interakcí s rozpouštědlem. Dalším přídavkem neutrální soli se snižuje tloušťka solvatačního obalu a efektivní koncentrace vody, a tím se snižuje i rozpustnost proteinu. Charakter závislosti rozpustnosti na koncentraci soli je určen nejen typem biopolymeru, ale i typem soli a hodnotou ph, nejnižší je rozpustnost v izoelektrickém bodě. Při frakcionaci organickými rozpouštědly mísitelnými s vodou (methanol, ethanol, aceton) se využívá rozdílná rozpustnost proteinu v těchto rozpouštědlech a ve vodě. Zvyšováním koncentrace organického rozpouštědla se zmenšuje i solvatační obal kolem molekul proteinu, což nakonec vede k jejich vysrážení. Frakcionace organickými rozpouštědly se může kombinovat se změnami koncentrace solí, ph a teploty. Proteiny i nukleové kyseliny jsou vysoce senzitivní, nepatrná změna některé z podmínek může způsobit jejich denaturaci, degradaci nebo změnu vlastností, které jsou nutné pro úspěšnou krystalizaci. Z tohoto důvodu musí být proteiny v hydratované formě udržovány při konstantním ph a teplotě. Krystaly makromolekul Obsahují průměrně 50 % rozpouštědla, většinou mají charakter gelu s mnoha intersticiálními prostory, kterými může proudit rozpouštědlo nebo difundovat malé 20