Cysteinové adukty globinu jako potenciální biomarkery expozice styrenu

Cysteinové adukty globinu jako potenciální biomarkery expozice styrenu J. Mráz, I. Hanzlíková, Š. Dušková, E. Frantík, V. Stránský Státní zdravotní ústav Praha 1

Biomarkery expozice cizorodým látkám výchozí látka v moči polární metabolity v moči (biomarkery expozice styrenu: kys. mandlová a kys. fenylglyoxylová) výchozí látka v krvi těkavá výchozí látka ve vydechovaném vzduchu kovalentní adukty s biologickými makromolekulami (DNA, proteiny) (reaktivní metabolit styrenu: styrenoxid SO) adukty s globinem 2

Globinové adukty cizorodých látek dlouhá doba života v organismu odpovídající době života erythrocytů (u člověka 120 dnů) snadná dostupnost globinu v dostatečném množství (~140 mg/ml krve) vhodné analytické postupy pro stanovení 3

Reaktivní skupiny aminokyselin CH(CH 3 ) 2 CH 2 SH (CH 2 ) 4 NH 2 H 2 N C H CO HN C H CO HN C H CO Val Cys Lys N NH CH 2 CH 2 HN C H CO HN C H CO His Tyr 4

O * * S S NH (1) 2 (2) NH 2 O SO-Cys NH 2 H * * N N H O (3) (4) O NH 2 SO-Lys N O NH 2 * * N N NH 2 O N (5) (6) O N NH 2 * * N N N NH 2 O (7) (8) SO-His 5

Adukty cizorodých látek s globinem: Struktura Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln Arg cizorodá látka reaktivní aminokyselina Gly Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys 6

Adukty cizorodých látek s globinem: Metody analýzy (1) Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln kyselá nebo alkalická hydrolýza Arg Gly Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys 7

Adukty cizorodých látek s globinem: Metody analýzy (2) Val Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln Edmanova degradace nebo modifikovaná Edmanova degradace Arg Gly Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys 8

Adukty cizorodých látek s globinem: Metody analýzy (3) Val Leu His Phe Pro Lys Gly Cys Ile Gln totální hydrolýza (kyselá nebo enzymatická) Arg Gly Cys Trp Leu Phe Gly Gly Asp Tyr Lys His Gly Glu Ile Pro Met Gln Cys Val Leu His His Phe Pro Lys Gly Cys Cys Ile 9

Materiál Lidský globin inkubovaný in vitro s SO (vysoká hladina aduktů) Analytický postup (základní) Enzymatická hydrolýza pronasou Odpaření dosucha Derivatizace MTBSTFA Extrakce do heptanu GC/MS Výsledky Všechny očekávané adukty SO s Cys, Lys a His nalezeny (Jágr et al. Chem. Res. Toxicol. 20, 1442-1452 (2007) 10

4,0x10 6 2,0x10 6 0,0 1 2 3 4 21 22 23 24 25 8 6 5 7 TIC Abundance 6x10 4 1 (21.13) 3x10 4 2 (21.28) 0 6x10 4 21 22 23 24 25 3 (22.86) m/z 526 m/z 463+387 3x10 4 4 (23.02) 0 21 22 23 24 25 SO-Cys (TBDMS) 3 SO-Lys (TBDMS) 3 6x10 4 3x10 4 m/z 560 8 (24.44) 5 (24.60) 6 (24.27) 7 (24.74) 0 21 22 23 24 25 Time (min.) SO-His (TBDMS) 3 (Jágr et al. Chem. Res. Toxicol. 20, 1442-1452 (2007) 11

2009-2010 Zvýšení citlivosti stanovení SO-Cys Stanovení SO-Cys v globinech in vitro krev + SO (0,01, 0,1 a 1 mm) myši exp. styrenu (600 nebo 1200 mg/m 3, 6 h/den 10 dní) dělníci exp. styrenu na pracovišti 12

Analytický postup (základní) Enzymatická hydrolýza globinu Odpaření dosucha Derivatizace MTBSTFA Extrakce do heptanu GC/MS Analytický postup (modifikovaný) Enzymatická hydrolýza globinu Prekoncentrace SPE Odpaření dosucha Derivatizace PFBB + MTBSTFA Extrakce do heptanu GC/MS 13

Cíl: Extrakce na pevné fázi (solid phase extraction, SPE) zakoncentrovat SO-Cys z globinového hydrolyzátu, odstranit nadbytek volných aminokyselin a solí Nalezené řešení: SPE kolonky Strata X, 500 mg (Phenomenex) Výsledek: SO-Cys oddělen od všech složek kromě Trp (hmotnostní bilance SPE kroku: 46 mg 1 mg) 14

Derivatizace SO-Cys pro GC-MS HO CH 2 CH S CH 2 CH CO NH 2 SO-Cys(1) HO CH CH 2 S CH 2 CH CO SO-Cys(2) NH 2 15

Derivatizace SO-Cys pro GC-MS A) TBDMS- HO CH 2 CH S CH 2 CH CO-TBDMS NH 2 -TBDMS stanovení GC-MS/EI B) PFB TBDMS- HO F F CH 2 + F F F CH 2 CH S CH 2 TBDMS CH CO-PFB NH 2 -TBDMS stanovení GC-MS/NCI CH 3 CH 3 H 3 C C Si + CH 3 CH 3 16

Derivatizace: výsledky A) MTBSTFA: - očekávané produkty: SO-Cys(TBDMS) 3, Trp(TBDMS) 3 B) PFBB + MTBSTFA: - neočekávané produkty, špatná reprodukovatelnost - GC-MS/NCI pouze srovnatelně citlivá s GC-MS/EI nadále používán jen MTBSTFA 17

SO-Cys: lidský globin, inkubace in vitro s 0,1mM SO 10000 b) control 8000 6000 4000 2000 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 10000 a) 0,1 mm SO 1 8000 6000 2 4000 2000 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 18

SO-Cys: myší globin, exp. styrenu 600 mg/m 3 6 h/d, 10 d 4000 b) control 3000 2000 1000 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 4000 a) exposed 3000 2000 1 2 1000 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 19

SO-Cys: lidský globin, profesionální expozice styrenu 10000 a) control 8000 6000 4000 2000 10000 b) control 8000 6000 4000 2000 2 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 10000 c) exposed 8000 10000 d) exposed 8000 2 6000 4000 2000 2 6000 4000 2000 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 0 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 20

SO-Cys(2) v lidském globinu Skupina n n (> LOD) Range SO-Cys(2) (nmol/g glob) Mean ± S.D. a kontroly 9 2 < LOD - 0.5 0.3 ± 0.1 exponovaní, závod A 10 2 < LOD - 0.7 0.3 ± 0.2 exponovaní, závod B 12 12 0.9-7.3 3.3 ± 2.1 mez detekce LOD = 0,4 nmol/g globinu a u vzorků s hladinou SO-Cys(2) < LOD přiřazena hodnota 1/2 LOD 21

SHRNUTÍ u osob exponovaných styrenu prokázán SO-Cys proč jen SO-Cys(2)? validace SO-Cys(2) jako biomarkeru expozice korelace hladiny SO-Cys(2) a expozice styrenu 22