LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ Charakterizace rostlinných olejů pomocí FTIR spektrometrie (metoda: infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací) Garant úlohy: prof. Dr. Ing. Jan Poustka
OBSAH Základní požadované znalosti pro vstupní test... 3 Doporučené otázky... 3 Náplň úlohy... 4 Časový snímek cvičení... 5 Použitelnost metody... 6 Princip metody... 6 Přístroje, zařízení, materiály... 6 Pracovní postup... 6 1. Příprava měření a měření spekter jednotlivých tuků a olejů... 6 2. Interpretace spekter a jejich další zpracování... 7 3. Statistické zpracování naměřených dat... 7 4. Analýza neznámého vzorku... 7 Návod pro obsluhu FTIR spektrometru is50... 8 P1. Spuštění počítače a ovládacího softwaru... 8 P2. Nastavení parametrů měření... 10 P3. Měření spektrálního pozadí... 11 P4. Vlastní měření spektra vzorku... 11 P5. Zpracování naměřeného spektra... 12 P6. Statistické zpracování dat pomocí TQ Analyst... 14 P7. Analýza neznámého vzorku... 19 P8. Ukončení práce s měřicím přístrojem i řídícím počítačem... 19 Infračervená spektrometrie... 20 Princip měření... 22 Disperzní spektrometry... 22 FTIR spektrometry... 23 Technika zeslabené úplné reflektance (ATR)... 23 Diskriminační analýza... 25 Tvorba kalibračních dat... 25
Základní požadované znalosti pro vstupní test Rozsah infračerveného záření a jeho rozdělení - vlnové délky, vlnočet. Princip infračervené spektrometrie Princip infračervené spektrometrie s Fourierovou transformací (FTIR) Princip techniky ATR Princip diskriminační analýzy Složení lipidů a typické složení běžných olejů Doporučené otázky Vymezte pojem infračervené záření. Definujte typické části IČ spektra. Které molekuly absorbují infračervené záření a proč? Jaké informace získáme interpretací infračerveného spektra? Jaké jsou hlavní části infračerveného spektrometru s Fourierovou transformací? Jaké vzorky lze měřit technikou ATR? Jaký je princip profilové analýzy? Jakými způsoby můžeme porovnávat naměřené profily?
Náplň úlohy 1. Měření infračervených spekter různých druhů olejů technikou ATR. 2. Interpretace spekter jednotlivých vzorků identifikace charakteristických funkčních skupin. 3. Vytvoření kalibračního modelu pomocí statistického softwaru TQ Analyst, použití naměřených vzorků jako standardů pro dané třídy. 4. Měření neznámého vzorku oleje. Aplikace funkce Quant Setup v softwaru Omnic - určení, o jaký olej či směs olejů se jedná.
Časový snímek cvičení 30 minut 30 minut 60 minut Kontrola požadovaných znalostí, diskuse: způsob měření, zpracování dat, multivariační statistická analýza Praktická ukázka měření vzorků pomocí techniky ATR, zpracování naměřených dat pomocí softwaru Omnic a TQ Analyst Skupinové měření jednotlivých druhů olejů, statistické zpracování dat 60 minut Individuální měření neznámého vzorku a vyhodnocení 50 minut Ukázka interpretace naměřených spekter, diskuse k možnostem využití v praxi 10 minut Ukončení úlohy + úklid
Použitelnost metody Metoda je použitelná pro všechny vzorky tuků a olejů, které lze měřit v kapalném stavu (přímo nebo po mírném zahřátí). Princip metody Vzorek kapalného tuku nebo oleje se nanese na měrný krystal a provede se proměření infračerveného spektra ve zvoleném rozsahu. Uložená spektra jsou následně zpracována a interpretována pomocí statistického softwaru. Přístroje, zařízení, materiály Infračervený spektrometr s Fourierovou transformací: Nicolet is50 FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA Vodní lázeň: Ingos TVL 15, Česká Republika Hexan 98 %, Merck, Německo Běžné laboratorní nádobí Pracovní postup 1. Příprava měření a měření spekter jednotlivých tuků a olejů a) Podle pokynů uvedených v oddílu o obsluze přístroje spusťte počítač a software OMNIC. Při měření budete používat reflexní techniku ATR, zvolte proto experiment nazývaný is50 ATR a zkontrolujte, zda je ATR krystal čistý. Změřte spektrum pozadí, poté naneste na krystal vzorek a změřte jeho spektrum. Každý vzorek by se měl změřit opakovaně (5x) pro ověření opakovatelnosti a následné statistické zpracování. Každé spektrum uložte. b) Vzorky olejů se nanesou Pasteurovou pipetou na krystal. Tuhé vzorky tuku se rozpustí na vodní lázni (max. 50 C) a nakapou se na krystal v rozpuštěném stavu. Poté vatovým tamponem odsajte kapalinu (nedotýkejte se samotného krystalu). Na krystal pak nakápněte maximálně dvě kapky hexanu a odsajte jej vatičkou. Nakápnutí směsi, lehké otření vatičkou a odpaření zbytku minimálně třikrát zopakujte, tak aby při spuštění preview po kliknutí na ikonu Col Smp nebyly patrné žádné spektrální rysy ani předchozího vzorku ani směsi rozpouštědel (je třeba vyčkat úplného odpaření). Teprve poté lze přistoupit ke změření spektra dalšího vzorku.
2. Interpretace spekter a jejich další zpracování Vaším úkolem je určit u jednotlivých změřených vzorků jaké obsahují funkční skupiny. Na základě infračerveného spektra asi nezjistíte vždy přesnou strukturu, ale měli byste ze spektra poznat základní skelet a příslušné substituenty. Při interpretaci použijte charakteristických vlnočtů vibrací funkčních skupin (Tab. I v příloze). Začněte s nejvýraznějšími absorpčními pásy. Častou chybou bývá nedostatečné očištění ATR krystalu. Výsledkem je pak spektrum směsi, které budete těžko interpretovat. V tomto případě je jediným možným řešením zopakovat příslušná měření. Je třeba upozornit, že se nesnažíme za každou cenu přiřadit všechny pásy ve spektru. Především v oblasti fingerprintu (cca pod 1300 cm-1) nalezneme pásy, které nelze přiřadit dílčím funkčním skupinám, ale jsou charakteristické pro molekulu jako celek. 3. Statistické zpracování naměřených dat Pro statistické zpracování použijeme software TQ Analyst, abyste na základě matematických výpočtů diskriminační analýzy zjistili, zda je možné od sebe jednotlivé druhy olejů odlišit. Postup je popsán v kapitole P6. Statistické zpracování dat pomocí TQ Analyst Návodu pro obsluhu FTIR spektrometru is50. 4. Analýza neznámého vzorku Každý student dostane neznámý vzorek oleje, který může být jak jednodruhový tak směs dvou olejů v různém poměru. Od asistenta je dopředu připraven kalibrační model. Po naměření neznámého vzorku si student vyzkouší funkci softwaru Omnic Quant Setup, pomocí které si nastaví způsob analýzy naměřeného neznámého spektra a následně pomocí funkce Quantify dojde k provedení analýzy spektra a určení softwarem, o jaký olej se jedná.
Návod pro obsluhu FTIR spektrometru is50 P1. Spuštění počítače a ovládacího softwaru Zapněte tlačítkem počítač, vyčkejte spuštění Windows a dle pokynů vyučujícího se přihlaste do sítě Microsoft. Poté dvojklikněte na ikonu zástupce Omnic na ploše počítače. Při startu softwaru Omnic se objeví základní obrazovka softwaru.
V softwaru jsou rozmístěny standardní rozbalovací menu, obsahující veškeré operace pro měření spekter, jejich zpracování, uložení a tisk. Na jednotlivých ikonách jsou graficky znázorněny a krátce popsány operace, které se spustí po jednoduchém kliknutí. Ikona Open slouží k otevření spektrálního souboru uloženého na disku. Ikona Save se naopak používá pro uložení aktuálního spektra, které je vždy zobrazeno červenou barvou. Kliknutím na ikonu Print se otevře nabídka pro tisk daného spektrálního okna (vytisknuta jsou všechna spektra zobrazená v daném okně).
Ikona Expt Set (Experiment Setup) slouží k otevření okna s řadou záložek umožňujících nastavení parametrů měření, tyto parametry vysvětlí asistent během úlohy. Pomocí ikony Col Smp (Collect Sample) se spustí měření spektra vzorku, zatímco ikona Col Bkg (Collect background) slouží pro změření pozadí. Popis funkce dalších ikon je dostupný v kontextové nápovědě (help). P2. Nastavení parametrů měření Nastavení parametrů měření se provádí v záložkách okna, které se otevře po kliknutí na ikonu označenou textem Expt Set. Připravená nastavení jsou uložena v souborech zvaných experiment. Název aktuálního experimentu je zobrazen v řádku mezi řádkem rozbalovacích menu a řádkem ikon. Pro vaše měření budete používat předem připravený experiment pro měření ATR technikou nazývaný is50 ATR. S obsahem jednotlivých parametrů budete podrobněji seznámeni při instruktáži před zahájením vlastní práce.
P3. Měření spektrálního pozadí Před měřením spektra pozadí zkontrolujeme, zda povrch ATR krystalu je suchý a čistý. Poté klikneme na Col Bkg a potvrdíme, že je vše připraveno pro měření spektra pozadí. Během tohoto měření lze na monitoru sledovat příslušné průběžné jednopaprskové spektrum a ve spodní části okna je možné vidět, kolik skenů z celkového požadovaného počtu bylo změřeno. Po ukončeném měření obvykle odmítneme přidání spektra pozadí do okna (spektrum už není možné vícekrát zobrazit, ale je uloženo v paměti pro srovnání s jednopaprskovými spektry následně měřených vzorků). P4. Vlastní měření spektra vzorku Na ATR krystal naneseme rovnoměrné množství vzorku (kapalné vzorky kapeme Pasteurovou pipetou, cca 3 kapky). Při správném nastavení softwarových parametrů (bylo zaškrtnuto použití preview data collection) docílíme jednoskenového náhledu, kliknutím na ikonu Col Smp. Objeví se měřící okno, ve kterém se vždy zobrazuje právě změřené spektrum během jednoho skenu a skenování probíhá opakovaně, ale bez akumulace. Pokud chceme spustit vlastní měření, klikneme na tlačítko Start Collection, čímž se zahájí akumulace příslušného počtu skenů. Po dokončeném měření přidáme spektrum do základního typu okna pro jeho další zpracování.
P5. Zpracování naměřeného spektra Bezprostředně po přidání naměřeného spektra do okna toto spektrum uložíme jako soubor na disk. Klikneme na ikonu Save, abychom zobrazili nabídku pro uložení spekter. Běžně budeme spektra ukládat s příponou.spa do adresáře a na disk specifikovaný vyučujícím. Kontrolu uložení spektra lze provést po kliknutí na ikonu i (info) zobrazenou vlevo od názvu změřeného spektra v řádku těsně nad plochou pro zobrazení spekter. Po kliknutí na uvedenou ikonu se zobrazí okno s textovými informacemi o změřeném spektru (parametry měření, historie prováděných operací, způsob uložení atp.). V takto získaném spektru vzorku lze identifikovat a vlnočtem označit významné absorpční pásy pomocí funkce Find Peaks, jež je k nalezení pod položkou Analyze ze základního lištového menu.
Pro tisk spekter je třeba kliknout na ikonu Print a dále se řídit dle zobrazené nabídky předvoleb a dle pokynů vyučujícího asistenta. Pro manipulaci se spektry zobrazenými v okně slouží řádka zobrazená pod spektrálním oknem. V základním režimu je stisknuta ikona se šipkou kurzorová šipka se volně pohybuje po okně, pokud se nalézá v části okna se zobrazenými spektry, pak s jejím pohybem je spojeno zobrazení hodnoty X (vlnočet) a Y (transmitance, absorbance) v řádku pod spektrem. Pokud chceme odečítat hodnoty X a Y na aktivním spektru (zobrazeno červeně), pak je třeba kliknout na spektrum, aby se místo šipky zobrazil kurzorový kříž. Hodnoty odpovídající poloze kurzorového kříže jsou zobrazeny pod spektrem. Kurzorovým křížem lze pohybovat pomocí myši, případně pomocí směrových šipek klávesnice. Pokud chceme přiřazovat ke spektru textové popisy poloh maxim (minim) pásů, je třeba kliknout na ikonu. K roztahování, resp. zužování spektrální oblasti stejně jako k posuvu spektra v okně slouží šipky zobrazené vpravo od ikony T. Pokud budete potřebovat využít další funkce softwaru OMNIC, obraťte se na vyučujícího asistenta.
P6. Statistické zpracování dat pomocí TQ Analyst Software TQ Analyst je rozdělen do několika panelových nástrojů a vývojových listů. Použití tlačítka Calibrate bývá posledním úkonem první etapy vývoje kalibrační metody. Po kalibraci se červená kontrolka Uncalibrated na konci lišty panelu nástrojů změní na zelenou Calibrated. Po jakékoliv změně vyvinuté kalibrační metody je metodu nutné opět kalibrovat.
Nejprve si potřebujete vybrat typ kvalitativní analýzy, pro naše účely zvolte diskriminační analýzu ve vývojovém listu Description. Dále tento list umožňuje charakterizaci základních parametrů modelu, které bude obsahovat závěrečná zpráva. Metoda může být popsána pomocí názvu metody, autora, data vzniku, data úpravy, popisu metody a typem analýzy. V dalším vývojovém listu Pathlenght zaškrtněte možnost Constant, čímž si vyberete vhodný typ optické vrstvy. Tato volba předpokládá, že kalibrační vzorky jsou měřeny při stejné tloušťce optické vrstvy, přičemž není nezbytné hodnotu optické dráhy znát. Je vhodná při použití ATR metodiky pro kapaliny. Dalším vývojovým listem je Components, který slouží hlavně ke specifikaci složek, které bude daná metoda kvantifikovat, jako jsou limity koncentrací nebo rozsah analýzy. Pro vás není tato část podstatná, protože se zabýváte analýzou kvalitativní. Ve vývojovém listu Classes si nadefinujte ve sloupci Class Name jednotlivé třídy (např. sezamový olej, řepkový olej apod.), ke každé třídě si nadefinujte zkratky ve sloupci Abbrev. (např. sez, rep apod.).
Dalším a tím nejdůležitějším listem je Standards, kde je umožněno vložení, výběr a popis standardů, které budou určeny ke kalibraci aktivní metody. Standardy se vloží do tabulky standardů (Standards table) pomocí tlačítka Open Standard. Tabulka dále umožňuje výběr (Usage) typu použití daného standardu v kalibraci (kalibrace, validace), v případě, že se jedná o odlehlé spektrum, lze dané spektrum ignorovat volbou Ignore. Dále zvolíme pro dané spektrum třídu, do které patří (Class), například třídy dýňový, sezamový atd. Tlačítko View Standards slouží k práci se spektry standardů. Spektra, označená po kliknutí na symbol brýlí modrým křížkem, jsou po kliknutí na tlačítko View Standards zobrazena v prohlížecím okně, kde je s nimi možné dále pracovat. Označení, případně odznačení všech standardů je možno provést opakovaným kliknutím na záhlaví sloupce Select. Tlačítko Sort Standards umožňuje seřazení standardů podle jména nebo názvu souboru. Aktivaci příslušného sloupce tabulky standardů provedeme kliknutím na jeho záhlaví.
Vývojový list Spectra nabízí několik možností úpravy spekter: odečítání spekter, vyhlazování spekter, změnu formátu spektra a korekci základní linie. Korekce lze provádět jak na spektrech kalibrační řady, tak na spektrech neznámého vzorku. Tlačítko View Standards pak umožňuje sledovat změny spekter po zadané úpravě. Ve většině běžných kalibrací není použití tohoto vývojového listu nutné a k úpravě spekter postačuje následující list Regions. Závěrečným krokem ve vývoji metody je identifikace podstatné spektrální informace v naměřených spektrech standardů, tedy výběr té části spektra, která bude použita k výpočtu. Informace důležitá pro danou metodu je závislá na korelaci naměřených spekter kalibračních standardů se změnami koncentrace stanovované složky. Funkce Suggest automaticky vybírá oblasti spektra, kde je tato korelace největší a danou oblast, popř. oblasti označí a následně použije k vývoji dané kalibrační metody. Funkce Edit Regions pak umožňuje úpravu těchto automaticky vybraných oblastí spekter. Aktivací této funkce se otevře nové okno k manipulaci s naměřenými spektry a specifikaci jejich použití pro danou metodu Region Selection Task Window. Často se může stát, že automaticky vybrané oblasti spektra nejsou charakteristické pro měřenou látku, pak je nutné oblasti změnit posouváním jejich hranic v okně výběru regionu.
Parametry vývojového listu Others slouží k upřesnění parametrů kalibrační metody. Vzhled tohoto vývojového listu je závislý na vybrané kalibrační metodě. Všechny hodnoty této záložky jsou přednastaveny a ve většině případů toto výchozí nastavení poskytuje ideální výsledky analýzy. Parametry vývojového listu Report slouží k výběru a specifikaci informací, které mají být obsaženy ve výsledkovém protokolu, a k vypínání a zapínání kontrol naměřeného spektra vzorku programem TQ Analyst. Po vyplnění všech vývojových listů kalibrujte metodu kliknutím na ikonu Calibrate. Pokud je vše vyplněno v pořádku, vpravo nahoře se vám objeví zelená ikona Calibrated. Takto kalibrovanou metodu uložte pomocí File a následně Save as, metodu při ukládání na asistentem zvolený disk pojmenujte dle aktuálního data.
P7. Analýza neznámého vzorku Po naměření neznámého vzorku (3x) otevřete spektra v softwaru Omnic. Pomocí funkce Select All označte všechna spektra jako aktivní a vytvořte průměrné spektrum ze tří opakování pomocí funkce Analyze v rozbalovacím menu, kde zvolte funkci Peak Resolve, čímž získáte průměrné spektrum. Toto vytvořené průměrné spektrum si přidejte do okna pomocí funkce Add. Dále si nastavte způsob analýzy spektra pomocí Analyze v rozbalovacím menu, kde si zvolte funkci Quant Setup, čímž nastavíte způsob analýzy spektra, tzn., vyberete metodu vyvinutou v programu TQ Analyst (metodu určí asistent), která má být pro vyhodnocení spektra použita. Následně provedete analýzu neznámého spektra pomocí funkce Quantify v rozbalovacím menu Analyze. Po zvolení této funkce se vám zobrazí tabulka, kde bude určena třída oleje, do které neznámý vzorek, na základě předem vytvořeného kalibračního modelu, spadá. P8. Ukončení práce s měřicím přístrojem i řídícím počítačem Po ukončení zpracování spekter v programu OMNIC uzavřeme tento program. Po ukončení práce počítač nevypínejte do pokynu asistenta.
Infračervená spektrometrie Infračervená spektrometrie (IČ; Infrared spectrometry - IR) patří do skupiny nedestruktivních analytických metod, kdy zkoumaný makroskopický vzorek není analýzou poškozen, a přesto poskytuje informaci o svém složení. Tato experimentální technika může sloužit jako nástroj pro kvalitativní a kvantitativní analýzu a hraje důležitou roli při výzkumu molekulové dynamiky, chemických vlastností molekul, vlivu prostředí na studované molekuly a mnoho jiných oblastí. Pomocí infračervených spekter se sledují vibrační a rotační přechody v molekulách. Pokud je změna těchto vibračních či rotačních stavů spojena se změnou dipólových momentů, dochází k absorpci záření, které je charakteristické pro danou vazbu v molekule. Získané hodnoty vibračních energií souvisí s molekulovou hmotností (pevností chemických vazeb, molekulovou geometrií a hmotností jader). Tato analytická technika zaznamenává pohlcení infračerveného záření o různé vlnové délce analyzovaným materiálem. Infračerveným zářením rozumíme elektromagnetické záření v rozsahu vlnových délek 0,78 1000 µm viz Obr. 1, což odpovídá rozsahu vlnočtů 12 800 10 cm -1. Celá oblast bývá rozdělena na: Blízkou: 12 800 4000 cm -1 (0,78 2,5 µm) Střední: 4000 400 cm -1 (2,5 25 µm) Vzdálenou: 400 10 cm -1 (25 1000 µm) Obr. 1 Elektromagnetické záření
Infračervená spektrometrie vychází z platnosti Lambert-Beerova zákona, který říká, že pro homogenní kapalné vzorky platí, že koncentrace látky je přímo úměrná absorbanci vzorku: kde, je příspěvek i-té složky k celkové absorbanci při dané vlnové délce λ, je molární absorpční koeficient i-té složky při dané vlnové délce λ, je optická tloušťka absorbujícího prostředí, je koncentrace i-té složky ve směsi. Analytickým výstupem je infračervené spektrum, které je grafickým zobrazením funkční závislosti energie (většinou vyjádřené v procentech transmitance (T) nebo jednotkách absorbance (A)) na vlnové délce dopadajícího záření. Příklad IR spektra pozorujeme na Obr. 2. Obr. 2 Příklad IR spektra slunečnicového oleje (absorbance) Při kvalitativní analýze je nejpoužívanější střední oblast 400-4000 cm -1. V této oblasti se organické sloučeniny projevují největším počtem absorpčních pásů různých funkčních skupin (např. OH, C=O, N-H, -CH 3, -CH 2 aj.). Dále oblast mezi 400-1500 cm -1 je typická pro každou organickou látku (tzv. fingerprint). Neexistují tedy dvě různé organické sloučeniny se stejným spektrálním projevem v této oblasti. Výhodou IR je možnost měření vzorků jak v plynném (plynová kyveta), kapalném (kyvety, tenký film), tak pevném stavu (technika KBr tablety, tenký film, nujolová technika, reflektanční techniky). V praxi se infračervená spektrometrie využívá například ve farmacii, potravinářství, kriminalistice a v medicíně.
Princip měření Principem transmisní metody je absorpce infračerveného záření při průchodu vzorkem, při níž dochází ke změnám rotačně-vibračních energetických stavů molekuly v závislosti na změnách dipólového momentu molekuly. Pro interpretaci IR spekter jsou důležité především změny vibračních stavů. Vazba mezi atomy v molekule se chová jako pružina, která je schopna absorbovat energii, která je kvantována. Přechod ze základního do excitovaného vibračního stavu je vyvolán absorpcí záření o frekvenci rovné frekvenci vibrace dotyčné vazby. Disperzní spektrometry Původní spektrometry pracující na principu rozkladu světla (disperzní spektrometry) neumožňovaly analýzu silně absorbujících matric, takže analýza pevných vzorků byla většinou omezena na práškové materiály, které byly měřeny ve formě směsi s halogenidy alkalických kovů lisovaných do tenkých tablet, nebo smíchaných se speciálním olejem (nujol). V 80. letech 20. století došlo k velkému rozšíření infračervených spektrometrů s Fourierovou transformací (Fourier Transform Infra Red FTIR). Jedná se o přístroje pracující na principu interference spektra, které na rozdíl od přístrojů disperzních měří interferogram modulovaného svazku záření po průchodu vzorkem. U disperzních přístrojů jsou jednotlivé vlnové délky snímány postupně, což je z hlediska časového, energetického a technického nevýhodné. FTIR spektrometry pracují na jiném principu, převádí (moduluje) vlnové délky z infračervené oblasti do oblasti audiofrekvencí (khz), kde jsou detektory schopny zaznamenat zároveň vlnovou délku i její intenzitu. Tyto přístroje vyžadují matematickou metodu Fourierovy transformace, abychom získali klasický spektrální záznam.
FTIR spektrometry V současné době, vzhledem k rychlému komerčnímu vývoji a rozsáhlému výzkumu je FTIR spektrometrie považována za jednu z nejužitečnějších technik pro chemické analýzy. Při měření dopadá na detektor vždy celý svazek záření. Takové uspořádání umožňuje i experimenty, při nichž dochází k velkým energetickým ztrátám, tj. měření silně absorbujících vzorků nebo měření s nástavci pro analýzu pevných či kapalných vzorků v odraženém světle reflektanční infračervená spektrometrie. Interferometr je optické zařízení umožňující řízené vytváření interferogramů na základě interference světla. Interferometr se skládá ze zdroje, děliče paprsků, pevného zrcadla a pohyblivého zrcadla Obr. 3. Obr. 3 Princip interferometru Paprsek vycházející ze zdroje se rozdělí v děliči paprsků na dvě poloviny. První polovina se odráží k pevnému zrcadlu a druhá část jde na pohyblivé zrcadlo. Odražené paprsky se setkávají v místě děliče a dochází k interferenci. Jednou z nejdůležitějších součástí je pohyblivé zrcadlo. Je důležité kontrolovat jeho přesnou pozici, aby bylo dosaženo přesného měření spektra. Pro pohyb zrcadla se používají dvě techniky a to vzduchová a mechanická ložiska. Je důležité poznamenat, že FTIR technika je velmi robustní a může bez problému pracovat několik let v jakémkoli typu konfigurace. Technika zeslabené úplné reflektance (ATR) Alternativou transmisní techniky je měření reflektančními technikami, mezi které se řadí difúzní reflektance a zeslabená úplná reflektance (ATR - Attenuated Total Reflection).
Pro měření vzorků, které silně absorbují infračervené záření (vodné roztoky, emulze) je tato technika výhodná. Jedná se o účinnou rychlou metodu, která vyžaduje minimální nebo žádnou přípravu vzorku pro analýzu. Difúzní reflektance měří odražené záření od kovového zrcátka, na kterém je umístěn vzorek smíšený s KBr. Zeslabená úplná reflektance je založena na principu násobného úplného odrazu záření na fázovém rozhraní měřeného vzorku a měřícího krystalu s dostatečně vysokým indexem lomu. Princip je zobrazen na Obr. 4, kde je znázorněn průnik záření ve formě evanescentní vlny (penetrační hloubka) do vzorku. Penetrační hloubka vlny do vzorku je v jednotkách µm. Obě tyto techniky jsou méně časově náročné a nevyžadují velké množství vzorku jako u transmisní metody. Mezi požadavky na vzorek patří dobrá přilnavost vzorku k materiálu hranolu, mechanická pevnost materiálu hranolu, inertnost vůči vzorku a možnost odstranění zbytků vzorku z hranolu rozpouštědlem. Výhody této techniky spočívají ve snadné přípravě vzorku a také v tom, že vzorek nemusí být transparentní. Obr. 4 Princip ATR techniky
Diskriminační analýza Diskriminační analýza (DA, discriminant analysis) je jednou z metod mnohorozměrné statistické analýzy (MSA, multivariate statistical analysis), která slouží k diskriminaci (rozlišení) objektů pocházejících z konečného počtu tříd (kategorií) a následné klasifikaci (zařazení), čímž se určí, do které třídy známých vzorků v kalibračním modelu neznámý vzorek patří. Předpokládáme, že objekty ze stejné třídy vykazují podobné znaky. Principem je kombinace několika proměnných a tím odlišení existující skupiny objektů, které není možné odlišit žádnou z proměnných samostatně. Spektrální klasifikační technika určuje třídu (nebo třídy), které jsou nejpodobnější neznámému materiálu. V kalibračním modelu je specifikováno více tříd, přičemž každá třída je popsána libovolným počtem standardů (nejméně však dvěma). Tvorba kalibračních dat Kalibračními standardy diskriminační analýzy jsou známé vzorky, které dobře charakterizují definované třídy. Jejich výběru je třeba věnovat velkou pozornost, neboť jejich variabilita definuje oblast, která je pro posouzení neznámého vzorku považována kalibračním modelem za vyhovující. Spektra kalibračních standardů by měla mít nejlepší kvalitu a musí být měřena stále stejným způsobem. Neboť diskriminační analýza je citlivá na odlehlé výsledky.