ANALÝZA OBRAZU A AKTIVITA INTRACELULÁRNÍCH ESTERAS JAKO NOVÝ ANALYTICKÝ NÁSTROJ PRO. EMBRYONÁLNÍCH KULTUR SMRKU (Picea sp.) OVLIVNĚNÝCH KADMIEM

ANALÝZA OBRAZU A AKTIVITA INTRACELULÁRNÍCH ESTERAS JAKO NOVÝ ANALYTICKÝ NÁSTROJ PRO SLEDOVÁNÍ RŮSTU A ŽIVOTNOSTI EMBRYONÁLNÍCH KULTUR SMRKU (Pice sp.) OVLIVNĚNÝCH KADMIEM JIŘÍ PETŘEK, JIŘÍ BALOUN,b, HELENA VLAŠÍNOVÁ, LADISLAV HAVEL, VOJTĚCH ADAM b,c, JAN VÍTEČEK, PETR BABULA d RENÉ KIZEK b Ústv biologie rostlin b Ústv chemie biochemie, Mendelov zemědělská lesnická univerzit Brno, Zemědělská 1, 613 00 Brno, c Ktedr nlytické chemie, Přírodovědecká fkult, Msrykov univerzit, Kotlářská 2, 611 37 Brno, d Ústv přírodních léčiv, Veterinární frmceutická univerzit Brno,Plckého 1/3, 612 42 Brno kizek@sci.muni.cz Došlo 3.5.06, přeprcováno 11.9.06, přijto 6.10.06. Klíčová slov: Pice bies, Pice pungens, rné somtické embryo, estersy, Brdičkov rekce, elektrochemie, spektrofluorimetrie, kdmium Úvod Tkové pletivo (explntát) je umístěno do sterilního prostředí, kde se dále kultivuje 16 18. Z přesně definovných podmínek lze z tkto odvozené kultury získt prkticky neomezené množství klonů původní rostliny, ze které explntát pocházel. Tento postup je schemticky ukázán n obr. 1. Význmná je tké kultivce dřevin metodou somtické embryogeneze, která vede k získání geneticky kvlitních průmyslově využitelných rostlin 17,19 24. Při této metodě získáváme embryonální kultury, které lze odvodit z jkékoliv somtické (tělní) buňky. Je tk třeb hledt nové nlytické metody sledování produkce růstu tkových kultur. Proto IA nchází upltnění tké v přípdě utomtického sledování produkce somtických embryí 10, tvru, velikosti nebo brvy kultury 1,25. Cílem této práce byl plikce metody nlýzy obrzu pro sledování růstu různých embryonálních kultur smrku. Metod byl porovnán s grvimetrickou metodou ktivitou intrcelulárních esters. Nvíc byl studován obsh glutthionu pomocí Brdičkovy rekce v těchto kulturách. Experimentální část Chemikálie Pokud není uvedeno jink, byly použity chemikálie dodné firmou Sigm Aldrich (USA) v čistotě ACS. Fosfátové pufry byly připrveny z hydrogen- dihydrogenfosforečnnu drselného. Jejich ph bylo uprveno pomocí KOH. Fluoresceindicetát (FDA) byl zkoupen u firmy Sigm Aldrich Chemicl Corp. (USA). Jeho roztok byl připrven rozpuštěním nvážky v bezvodém cetonu. N kultivční medi byly použity chemikálie dodné firmou Duchef Biochemie BV (Nizozemí). Medi roztoky byly Anlýz obrzu (Imge nlysis, IA) je nástrojem sloužícím k popisu tvru, struktury le tké vzhledu zkoumného objektu. Digitální nlýz obrzu umožňuje rychlejší elektronické zprcování dt, je sndno opkovtelná obvykle nevyžduje velké zkušenosti s nlytickým postupem 1. Nově se ukzuje, že nlýz digitlizce obrzu u rozdílných biologických objektů struktur může přinést mnoho potřebných informcí o jejich fyziologii 2 6. Nvíc umožňuje kvntifikci růstových morfologických změn 1,7 9. Význmnou výhodou předností počítčové nlýzy obrzu v in vitro kultivovných kulturách je n rozdíl od jiných experimentálních postupů možnost sledovt výše uvedené prmetry během kultivčního procesu bez externích záshů (nrušení sterility prostředí, mechnické poškození, stresová rekce pod.) 1. Kultivční postupy v podmínkách in vitro jsou v součsnosti stále více využívány pro uchování genofondu vzácných genotypů dřevin, sndné rychlé množení rostlin, pro dlší biotechnologické plikce 10 15. Pro odvození explntátové kultury rostlin je vhodné jkékoliv pletivo (část rostliny) obshující buňky s funkčním jádrem. e 600 d Obr. 1. Schém množení smrku pomocí somtické embryogeneze v podmínkách in vitro; () zygotické embryo, (b) kultur rných somtických embryí, (c) kultur zrlých somtických embryí, (d) růst kořene děloh, (e) běžný růst v podmínkách in vivo c b 569

Softwre Grb - It CCD - kmer P PC b Softwre imge - Pro c d VÝSLEDKY vypočtená ploch SRSE Obr. 2. Schém nlýzy obrzu; () digitlizce obrzu Petriho misky se shluky rných somtických embryí (SRSE) pomocí CCD kmery, (b) nčtení obrzu do progrmu Grb-IT, (c) počítčový obrz, (d) výpočet plochy progrmem Imge-Pro připrveny rozpuštěním příslušných látek v deionizovné vodě (18,2 MΩ, Iw 20, Wtek, Česká republik). Rostlinný mteriál Byly využity kultury rných somtických embryí smrku ztepilého (Pice bies /L./ Krst.), klon 2/32, smrku pichlvého (Pice pungens Engelm.), klon PE 14. Klon 2/32 pochází ze smrku ztepilého horského klimxového typu z pokusné plochy v Beskydách. Klon PE 14 byl odvozen ze smrku pichlvého, přičemž pro jeho odvození byl použit zrlá semen ze vzrostlého stromu Pice pungens Engelm. Argente v reálu Mendelovy zemědělské lesnické univerzity v Brně. Kultury jsou udržovány z striktně sterilních podmínek (flow box Gelire HF 36) vždy po 14 dnech kultivce se provádí psáž. Při psáži jsou z horních prtií shluků rných somtických embryí (SRSE) odebírány části s vyvinutými skupinmi embryonálních buněk o hmotnosti přibližně 2,5 5,0 mg přenášeny n novou Petriho misku (průměr 90 mm) s kultivčním médiem (30 ml). SRSE jsou kultivovány ve tmě při teplotě 23±2 C. N jednu misku připdlo vždy 10 SRSE. Kultivč ní médium Všechny výše uvedené kultury jsou dlouhodobě kultivovány n kultivčním médiu LP/2 (cit. 26 ), které je modifikováno 9 µm 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny 4,4 µm benzylminopurinu 27. Při příprvě kultivčního médi byly norgnické i orgnické složky rozpuštěny v deionizovné destilovné vodě, ph bylo uprveno n hodnotu 5,7 5,8 pomocí KOH/HCl (ph metr Schott CG 842). Následně byl norgnická část médi sterilizován při teplotě 121 C tlku 100 kp po dobu 30 min (Tuttnuer 3870 EA); orgnická část byl sterilizován membránovou filtrcí (Whtmn Purdisc 25 AS 0,2 µm). Při nšich pokusech bylo nezbytné modifikovt kultivční médi. Přídvek kdemntých iontů vedl okmžitě ke vzniku srženin. Z tohoto důvodu jsme přistoupili k jeho vyvázání pomocí EDTA. Nvíc je známo, že cheláty těžkých kovů mnohem lépe prostupují přes různé buněčné briéry 28 30. Do zákldního médi byl přidán chelát kdmi (Cd-EDTA) ve výsledných koncentrcích 50 µm, 250 µm 500 µm. Roztok Cd-EDTA byl připrven podle postupu uvedeného v práci Vssil spol. 31. Zásobní roztok Cd(NO 3 ) 2 byl smíchán s kyselinou ethylendimintetroctovou (EDTA) v poměru 1:1 při teplotě 50 C po dobu 1 h. Komplex Cd-EDTA byl přidán k norgnické části kultivčního médi. Anlýz obrzu SRSE Pro zjištění plochy jednotlivých SRSE byl nutná digitlizce obrzu kždé Petriho misky. Digitlizce byl proveden metodou nlýzy obrzu pomocí kmery CCD Sony (UPV-GDS 8 000) progrmu GRAB-IT (obr. 2). Pro vyhodnocení jednotlivých ploch byl využit progrm IMAGE PRO. Plochy byly zjišťovány n zčátku poté v průběhu experimentu. Údje byly dále zprcovány v progrmu Microsoft Excel; výsledkem byl průměrný přírůstek SRSE. Stnovení životnosti pomocí fluorescenč ních brviv Sledování životnosti buněk bylo provedeno pomocí brvení fluorescenčními brvivy propidium jodidem (PI) fluoresceindicetátem (FDA) podle metody uvedené v práci Jones spol. 32. PI není propouštěn přes cytoplsmtickou membránu dovnitř živé buňky. V přípdě mrtvé buňky, která má nefunkční cytoplsmtickou membránu, se dostává dovnitř způsobuje červené fluorescenční zbrvení. FDA je schopen projít přes funkční cytoplsmtickou membránu je v živých buňkách štěpen n octn fluorescein, který vydává zelené fluorescenční zbrvení. Při vlstním brvení byl odebrán horní část SRSE, která byl umístěn n podložní sklíčko následně byl z- 570

kápnut suspenzí (37 µl destilovné, 10 µl PI 3 µl FDA, koncentrce FDA 1 mg ml 1 PI 20 mg ml 1 ) 1,33. Po pěti minutách inkubce se připrvený preprát pozorovl pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu Olympus AX 70 při zvětšení 4 10 10 10. Pro pozorování bylo využito filtru WU, excitce při vlnové délce 330 385 nm. Při sledování preprátů byl pořízen jejich fotodokumentce digitálním fotoprátem Olympus Cmedi C-4040 ZOOM. Životnost byl vypočítán pomocí nlýzy obrzu; progrm IMAGE PRO vypočítl zstoupení červeně zeleně zbrvených buněk, tedy buněk mrtvých živých 34. Stnovení životnosti pomocí ktivity intrcelulárních esters SRSE byly odebrány z pevného médi, následně byly promyty 50 mm fosfátového pufru (ph 8,7) byly uchovávány při teplotě 20 C. Po rozmrzení byly vzorky doplněny n celkový objem 1 ml extrkčním pufrem (250 mm fosfátový pufr, ph 8,7) dithiothreitolem (DTT, cílová koncentrce 1 mm) desintegrovány ve skleněném pístovém homogenizátoru (Kvlier, Česká republik), uloženém v ledové lázni po dobu 10 min. Získné rostlinné homogenáty byly umístěny v ledu do ultrzvukové lázně po dobu 1 min poté byly centrifugovány (10 000 g, 15 min, 4 C). Alikvot superntntu byl přidán do rekční směsi obshující fosfátový pufr (1 M, ph 8,7) 5 mm FDA, jehož zásobní roztok připrvený v bezvodém cetonu byl uchováván v uzvřených nádobkách při 20 C. Množství cetonu v rekční směsi nepřekročilo 1 % (v/v). Po 15 minutové inkubci v termosttu při 45 C byl změřen fluorescence (RF-551, Shimdzu Scientific Instruments Inc., USA) excitce 490 nm/emise 514 nm. Aktivit esters byl stnoven v IU (jedn mezinárodní jednotk uvolní při výše uvedených podmínkách 1 µmol fluoresceinu z minutu) 34 36. Elektrochemická nlýz Elektrochemická nlýz byl prováděn pomocí elektrochemického nlyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, Holndsko) v zpojení s tříelektrodovou celou VA-Stnd 663 (Metrohm, Švýcrsko). Byl použit visící rtuťová kpková elektrod jko prcovní (HMDE, ploch rtuťové kpky: 0,4 mm 2 ), referentní elektrod (Ag/AgCl, 3 M KCl) uhlíková tyčink jko pomocná elektrod. Získná dt byl uprven mtemtickou korekcí podle lgoritmů nvržených Svitzkym Golyem implementovných do GPES softwru (EcoChemie). Stnovení thiolových sloučenin bylo provedeno technikou dsorptivní přenosové rozpouštěcí diferenční pulzní voltmetrie (AdTS DPV) Brdičkov rekce 37,38. Experimenty byly prováděny při teplotě 4 C, v potenciálovém rozshu od 0,7 V do 1,8 V, potenciálový krok 1,05 mv, pulzní mplitud 25,05 mv, čsový intervl 0,2 s, dob kumulce 120 s, potenciál kumulce 1,1 V. Jko zákldní elektrolyt byl použit 1 mm roztok Co(NH 3 ) 6 Cl 3 v monném pufru (1 M NH 4 Cl + 1 M NH 4 OH). Výsledky diskuse Studium různých biotických biotických fktorů n rostliny je v přirozených podmínkách velmi náročné, proto se hledjí možnosti, jk získt rychle dosžitelné opkovtelné výsledky 39. Jednou z možností, které se stále čstěji využívá, je studium explntátových kultur rostlin. Mezi tkové kultury ptří i kultur rných somtických embryí (RSE) smrku 27. Chrkteristické rysy vzniku RSE u jehličnnů byly popsány mnoh utory 27,40 43. Kždé RSE smrku se skládá z embryonální skupiny, embryonálních tubulárních buněk embryonálního suspenzoru (obr. 3A). Zkráceně je pk možné popst složitý proces růstu embryonální kultury: i) nejprve dochází k dělení buněk embryonální skupiny, ii) jejich prodlužováním n distálním konci vznikjí tubulární buňky, z nichž vzniká embryonální suspenzor, iii) buňky suspenzoru jsou uvolňovány do kultivčního médi 26. Jk stále dochází k oddělování nových tubulárních suspenzorových buněk směrem od embryonální skupiny, tvoří se shluky rných somtických embryí (SRSE) (obr. 3B). V nšich experimentálních podmínkách jsou SRSE kultivovány v Petriho misce n kultivčním médiu kždé dv týdny jsou přeneseny n nové kultivční médium (obr. 3C). Ke sledování kultury, popř. vlivu různých elicitorů n ni, je třeb sledovt zákldní chrkteristiky, jko jsou růst životnost kultury 36,44. Mezi nejčstěji využívné metody pro stnovení růstu rostlinných kultur ptří vážení kultury nebo počítání buněk. V přípdě kultur SRSE smrku je velmi vhodné využít metody IA, neboť při experimentu probíhjícím v čse nemusíme zshovt (odběr vzorků) do kultivovného biologického mteriálu. Optimlizce obrzové poč ítč ové nlýzy Nejdříve byly obrzy Petriho misek se shluky RSE digitlizovány pomocí CCD-kmery ( chrge-coupled device, oznčení polovodičového zřízení, které je schopno jk fotodetekce, tk pměťových funkcí, které převádí světlo n elektronické impulsy). Smotná digitlizce byl řízen PC prostřednictvím progrmu GRAB-IT. Pro získání kvlitního obrzu bylo nezbytné nstvit vhodnou expozici rozlišení kritického detilu (místo nejostřejšího vidění předmětu) 1. Bylo zjištěno, že se stoupjícím rozlišením CCD-kmery klesá velikost plochy jednotlivých SRSE. Při rozlišení obrzu 2,8 ž 3,6 pixelů n mm je digitlizovná ploch ndhodnocen si o 16 % (proti rozlišení 5 pixelů n mm) hodnoty plochy jsou velice vribilní (kolem 20 %), protože není správně rozeznán okrj SRSE. Při vyšším rozlišení kritického detilu se vribilit výrzně snižuje roste přesnost určení plochy SRSE. Při hodnotách snímání obrzu nd 5 pixelů n mm je proces snímání obtížnější méně reprodukovtelný (v zorném poli kmery není celá ploch Petriho misky). Pro dlší experimenty bylo vybráno rozlišení kritického detilu 8 pixelů n mm, které zjišťuje dobré určení hodnoty plochy SRSE zároveň je vhodné pro konstntní nstvení metody při jejím 571

Obr. 3. Kultur rných somtických embryí smrku ztepilého, klon 2/32. (A) Rné somtické embryo; () embryonální suspensor, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální skupin. (B) Shluky rných somtických embryí (SRSE); SRSE po dvoutýdenní kultivci, fotogrfie z různého úhlu (Fotoprát Olympus Digitl Cmer C-4040 ZOOM); 0 (), 45 (b), 90 (c). (C) Petriho misk se SRSE n kultivčním médiu. (D) Typická růstová křivk zjištěná metodou nlýzy obrzu (y = 12,392x - 4,2157; R 2 = 0,998) rutinním využití, tedy by byl v zorném poli kmery snímán vždy celá ploch (Petriho misk). Při správně nstvené expozici při stejném nstvení kmery byl zjištěn chyb nlýzy 0,31 % (n=10). Získné digitální údje je možno, po zprcování integrálními lgoritmy, využít ke kvntifikci růstu, vitlity horizontálního uspořádání kultury. U embryonální kultury smrku lze pomocí počítčových progrmů sledovt obvod, plochu, délku, šířku, denzitu dlší. Je potřebné zdůrznit, že dosud neexistovl v bionlýze metod umožňující sledovt tyto efekty u tkto komplikovných znčně heterogenních kultur (obr. 2). R ů stové chrkteristiky kultury RSE Jednou z nejdůležitějších chrkteristik kždé kultury je růstová křivk. N zákldě dříve zjištěných experimentálních dt jsme určili jko nejvhodnější počáteční velikost SRSE kolem 10 mm 2 (cit. 1 ). Z těchto podmínek byl sestrojen růstová křivk pomocí metody nlýzy obrzu (obr. 3D). Při výpočtu přírůstku SRSE vycházíme z původní velikosti. Výsledný přírůstek předstvuje procento, o kolik se dný SRSE po dobu kultivce zvětšil. Pro výpočet byl využit následující rovnice: P p = ((I n / I o ) 1). 100 [%] kde P p je přírůstek SRSE vyjádřený v procentech, I n je ploch SRSE po n dnech kultivce [mm 2 ] I o ploch SR- SE n zčátku kultivce [mm 2 ]. Pro ověření nlýzy obrzu (IA) bylo provedeno srovnání z využití grvimetrické metody ktivity intrcelulárních esters. Nevýhodou grvimetrické metody bylo vysýchání SRSE, což může při nedosttečně rychlém vážení ovlivnit získné hodnoty celkového přírůstku SRSE o 20 (po dobu 10 min), resp. o 46 % (po dobu 30 min). Metodu tk nelze využít pro kontinuální studium kultury v průběhu experimentu, neboť dochází ke vzniku silné stresové rekce. Zjistili jsme, že průměrné reltivní přírůstky hmotnosti plochy SRSE v průběhu čtrnáctidenní kultivce vykzovly striktně lineární trend (y = 12,392x 4,2157; R 2 = 0,998). Při kultivci SRSE po dobu 35 dnů byl linerit zchován při prmetrech rovnice přímky: y = 9,0561x 6,0197, R 2 = 0,9833. Bylo zjištěno, že hmotnost SRSE v porovnání s jejich plochou roste rychleji, to po celou dobu kultivce (směrnice jejich přímek se od sebe liší). Pozorovné rozdíly jsou prvděpodobně způsobeny růstem SRSE do výšky, což nlýzou obrzu nelze zchytit. Dále byl metod nlýzy obrzu porovnán s ktivitou intrcelulárních esters, kterou lze rovněž využít pro stnovení růstu 34. Pro detekci estersové ktivity byl jko substrát vybrán fluoresceindicetát (FDA) 34, který se půso- 572

3D spektrum fluoresceinu HO O O O O - fluorescence (FRU) b mximum λ excittion (nm) λ excitcion = 490 nm λ emmision (nm) λ emmision = 514 nm Obr. 4. Spektrofluorimetrická detekce fluoresceinu; fluoresceindicetát je estersmi hydrolyzován n fluorescein, který při ph>7,0 intenzivně fluoreskuje. Fluorescein poté lze spektrofluorimetricky detegovt ve viditelné oblsti světl (excitce 490 nm/emise 514 nm) bením esters hydrolyzuje n fluorescein. Fluorescein poté lze detegovt spektrofluorimetricky ve viditelné oblsti světl (excitce 490 nm/emise 514 nm), viz 3D spektrum fluoresceinu, které je ukázáno n obr. 4. Podobně jko u vážení byl růstová křivk získná pomocí estersové ktivity ekvivlentní růstové křivce získné nlýzou obrzu. Stnovení životnosti buně k Aby bylo možné studovt působení biotických či biotických fktorů n modelové kultury, je nprosto nezbytné znát počet živých buněk. Pro stnovení životnosti bylo vyvinuto několik rozličných, většinou kvlittivních, metod. Nejčstěji se provádí tzv. dye exclusion test, při kterém se využívá flourescenčních brviv propidium jodidu (PI) fluoresceindicetátu (FDA). Interpretce výsledků této metody je ovšem v přípdě kultury RSE velmi obtížná. Nelze dost dobře rozlišit spočítt jednotlivé buňky RSE stnovit tk přesně životnost, jk je tomu možné u buněčných suspenzí, npř. tbáku. Tento problém je možné vyřešit využitím nlýzy obrzu, kdy pomocí progrmu IMAGE PRO lze vypočítt zstoupení červeně zeleně zbrvených buněk, tedy buněk mrtvých živých. Fotogrfie embryí, která byl brven PI/FDA byl následně použit pro výpočet metodou IA, je zobrzen n obr. 5. Při sledování životnosti RSE smrku ovlivněných Cd-EDTA (50, 250 500 µm koncentrce v kultivčním médiu) byl pozorován výrzný pokles životnosti kultury RSE. Již 250 µm Cd-EDTA vedlo k poklesu životnosti n polovinu, všk koncentrce 500 µm Cd-EDTA usmrtil si 70 % z celkového počtu RSE (obr. 5b). Tento výsledek potvrdilo i studium ktivity intrcelulárních esters (obr. 5c). Studium vlivu kdmi n RSE smrku Těžké kovy jsou díky svým vlstnostem nebezpečnými látkmi přítomnými v životním prostředí 44 49. Jk již bylo uvedeno výše, vhodným nástrojem pro sledování růstu kultur RSE smrku se ukázl být IA. N obr. 6,b je ukázán vliv Cd-EDTA n jednotlivé SRSE smrku ztepilého 2/32 smrku pichlvého PE 14. Ze zjištěných výsledků lze říci, že se stoupjící koncentrcí kdmi v kultivčním médiu klesl průměrný přírůstek SRSE. Jk je ze získných experimentálních výsledků zřejmé, Cd-EDTA půso- 573

b c Obr. 5. Sledování životnosti kultury rných somtických embryí smrku pichlvého pomocí fluorescence enzymtické ktivity; koncentrce kdmi (Cd-EDTA) v kultivčním médiu 0, 50, 250 500 µm, 12 dnů kultivce. () Vliv Cd-EDTA n životnost RSE; dvojité brvení fluorescenčními brvivy. (b) Výpočet životnost RSE pomocí nlýzy obrzu. (c) Stnovení životnosti pomocí ktivity intrcelulárních esters b c d Obr. 6. Vliv různých koncentrcí kdmi (0, 50, 250 500 µm) n růst obsh glutthionu ve shlucích rných somtických embryí smrku ztepilého, klon 2/32, smrku pichlvého, klon PE 14. () Vliv Cd-EDTA n růst SRSE klonu 2/32 (b) klonu PE 14. (c) Množství glutthionu u klonu 2/32 (d) klonu PE 14 ovlivněných kdmiem. Více podrobností nleznete v Obr. 5 sekci Mteriály metody 574

bil výrzně toxičtěji n klon SRSE 2/32. To je velmi dobře pozorovtelné se vzrůstjícím čsem kultivce rostoucí koncentrcí Cd-EDTA (obr. 6,b). Z výsledků jsně vyplývá, že mezi jednotlivými klony smrku je velmi výrzný rozdíl. Tento fkt prvděpodobně ukzuje n různou schopnost těchto rostlin získt odolnost n environmentální znečištění toxickými sloučeninmi, tedy selekční výhodu. Jk je známo, proti přítomnosti těžkých kovů se rostliny brání syntézou thiolových sloučenin, jko jsou glutthion fytocheltiny 44. Ke stnovení thiolových sloučenin lze využít různé nlytické metody 37,50 57. Pro studium obshu glutthionu bylo využito elektronlytické stnovení pomocí dsorptivní přenosové rozpouštěcí diferenční pulzní voltmetrie (AdTS DPV) Brdičkovy rekce. N získných voltmogrmech byly pozorovány elektrochemické odezvy v podobě signálů Co 1, RS 2 Co, Ct 1, Ct 2 Ct 3. Signál Co 1 odpovídl redukci Co 2+ n Co 0 (~ 1,0 V), signál oznčený jko RS 2 Co (~ 1,0 V) odpovídl komplexu kobltu s glutthionem (GSH) dlší tři ktlytické píky Ct 1 ( 1,2 V); Ct 2 ( 1,3 V) Ct 3 ( 1,4 V) (cit. 37,38,58 ). Redukční signál kobltu(ii), který je pozorován v zákldním elektrolytu při potenciálu 1,2 V, se posouvá v přítomnosti glutthionu směrem do pozitivních potenciálů. Pozorovné změny signálu souvisí s interkcí peptidu se složkmi zákldního elektrolytu z vzniku řdy komplexů prvděpodobně i RS 2 Co (cit. 37 ). Obsh thiolových sloučenin ve SRSE roste se zvyšující se koncentrcí těžkého kovu v kultivčním médiu s dobou kultivce. Produkce glutthionu byl u obou zkoumných klonů podobná. U kontrolních vrint bez kdmi bylo zjištěno přibližně 18 ng glutthionu n 1mg svěží hmotnosti kultury. S rostoucí koncentrcí chelátu kdmi (Cd-EDTA) dobou kultivce se zvyšovl obsh glutthionu ž n 148 ng mg 1 u klonu 2/32, resp. 158 ng mg 1 u klonu PE 14 (obr. 6c,d). Vzestup hldiny glutthionu souvisí s výrznou toxicitou kdmi, což dokzují tké růstové chrkteristiky kultur, kde je dobře ptrná inhibice jejich růstu vlivem kdmi (obr. 6,b). Jk je ze získných dt zřejmé, schopnost RSE přežívt v prostředí s vysokými obshy Cd-EDTA zcel jistě souvisí s ktivcí detoxikčních mechnismů vycházejících z glutthionu 59 61. Závěr Pro zjištění růstových chrkteristik bylo využito originální metodiky nlýzy obrzu, kterou lze úspěšně sledovt růst životnost kultury je tk dlší lterntivou pro sledování kultur v podmínkách in vitro. Nvíc pomocí elektronlytických technik byl studován obsh glutthionu u SRSE. Pozorovné hldiny glutthionu výrzně vzrůstjí mohou tk souviset s odolností rostlin n environmentální znečištění. Nvíc uvedeného postupu by bylo zcel jistě možné využít jko jednoduchého bioindikátoru znečištění prostředí především těžkými kovy, přičemž získné výsledky by mohly umožnit nvržení nových genetických modifikcí rostlin 62. Seznm zkrtek AdTS DPV CCD-kmer DTT EDTA FDA GSH HMDE IA PI RSE SRSE dsorptivní přenosová rozpouštěcí diferenční pulzní voltmetrie chrge-coupled device kmer dithiothreitol kyselin ethylendiminotetroctová fluoresceindicetát redukovný glutthion visící rtuťová kpková elektrod imge nlysis, nlýz obrzu propidium jodid rné somtické embryo shluk rných somtických embryí Práce n tomto příspěvku byl finncován grntem: GAČR 525/04/P132, IGA MZ 1A/8666-3 Výzkumným centrem 1M06030. LITERATURA 1. Petrek J., Vitecek J., Vlsinov H., Kizek R., Krmer K. J., Adm V., Klejdus B., Hvel L.: Anl. Bionl. Chem. 383, 576 (2005). 2. Schchr R. A., Kmngr F.: Eye 20, 226 (2006). 3. Rdnui S.: Tribology Interntionl 38, 871 (2005). 4. Vlero M. A., Pnov M., Ms-Com S.: J. Helminthol. 79, 217 (2005). 5. Fucitno L., Huff P., Teuscher F., Griepy C., Wegner J.: Met Sci. 69, 537 (2005). 6. Crnier P., Gllo L., Romni C., Sturro E., Bondesn V.: J. Anim. Sci. 82, 808 (2004). 7. Ibrki Y., Kenji K.: Comput. Electron. Agric. 30, 193 (2001). 8. Chi C.-M., Vits H., Stb E. J., Cooke T. J., Hu W.-S.: Biotechnol. Bioenerg. 44, 368 (1994). 9. Chi C.-M., Zhng C., Steb E. J., Cooke T. J., Hu W.- S.: Biotechnol. Bioenerg. 50, 65 (1996). 10. Ibrki Y., Kurt K.: Plnt Cell Tiss. Org. Cult 65, 179 (2001). 11. Giri C. C., Shymkumr B., Anjneyulu C.: Trees- Struct. Funct. 18, 115 (2004). 12. Smiskov A., Vlsinov H., Hvel L.: Biol. Plnt. 49, 451 (2005). 13. Uberll I., Vrn J., Brtos J., Smerd J., Dolezel J., Hvel L.: Biol. Plnt. 48, 199 (2004). 14. Vlsinov H., Mikulecky M., Hvel L.: Biol. Plnt. 47, 475 (2003). 15. Cenklov V., Binrov P., Hvel L.: Biol. Plnt. 46, 167 (2003). 16. Hncek P., Hvel L., Truks M.: Biologi 57, 517 (2002). 17. Vlsinov H., Hvel L.: J. Plnt Physiol. 154, 212 (1999). 18. Hvel L., Novk F. J.: J. Plnt Physiol. 132, 373 (1988). 19. Bhnsli R. R., Driver J., Durzn D. J.: J. Horticult. Sci. 66, 601 (1991). 575

20. Bhnsli R. R., Driver J. A., Durzn D. J.: Plnt Cell Rep. 9, 280 (1990). 21. Durzn D. J., Gupt P. K.: Plnt Sci. 52, 229 (1987). 22. Gupt P. K., Durzn D. J., Finkle B. J.: Cn. J. For. Res.-Rev. Cn. Rech. For. 17, 1130 (1987). 23. Gupt P. K., Durzn D. J.: Bio-Technology 5, 147 (1987). 24. Durzn D. J.: In Vitro Cell Develop. Biol. 21, A56 (1985). 25. Olofsdotter M.: Plnt Cell Rep. 12, 216 (1993). 26. von Arnold S. J.: Plnt Physiol. 127, 233 (1987). 27. Hvel L., Durzn D. J.: Int. J. Plnt Sci. 157, 8 (1996). 28. Lopez M. L., Perlt-Vide J. R., Benitez T., Grde- Torresdey J. L.: Chemosphere 61, 595 (2005). 29. Collins R. N., Onisko B. C., McLughlin M. J., Merrington G.: Environ. Sci. Technol. 35, 2589 (2001). 30. Lurie S. H., Tncock N. P., McGrth S. P., Snders J. R.: Plnt Sci. 109, 231 (1995). 31. Vssil A. D., Kpulnik Y., Rskin I., Slt D. E.: Plnt Physiol. 117, 447 (1998). 32. Jones K. H., Senft J. A.: J. Histochem. Cytochem. 33, 77 (1985). 33. Mlejnek P., Prochzk S.: Plnt 215, 158 (2002). 34. Vitecek J., Adm V., Petrek J., Bbul P., Novotn P., Kizek R., Hvel L.: Chem. Listy 99, 496 (2005). 35. Vitecek J., Petrlov J., Petrek J., Adm V., Hvel L., Krmer K. J., Kizek R.: Biol. Plnt. 51, 551 (2007). 36. Vitecek J., Adm V., Petrek J., Vcek J., Kizek R., Hvel L.: Plnt Cell Tissue Orgn Cult. 79, 195 (2004). 37. Kizek R., Vcek J., Trnkov L., Klejdus B., Hvel L.: Chem. Listy 98, 166 (2004). 38. Vcek J., Petrek J., Kizek R., Hvel L., Klejdus B., Trnkov L., Jelen F.: Bioelectrochemistry 63, 347 (2004). 39. Zehnlek J., Adm V., Kizek R.: Chem. Listy 100, 508 (2006). 40. Gupt P. K., Durzn D. J.: Bio-Technol. 4, 643 (1986). 41. Durzn D. J., Jokinen K., Guerr M. P., Snterre A., Chlup V., Hvel L.: Int. J. Plnt Sci. 155, 677 (1994). 42. Durzn D. J.: Int. J. Plnt Sci. 157, 17 (1996). 43. Hvel L., Durzn D. J.: Bot. Act 109, 268 (1996). 44. Zehnlek J., Adm V., Kizek R.: Lis. Cukrov. Reprske 120, 222 (2004). 45. Potesil D., Petrlov J., Adm V., Vcek J., Klejdus B., Zehnlek J., Trnkov L., Hvel L., Kizek R.: J. Chromtogr., A 1084, 134 (2005). 46. Zehnlek J., Vcek J., Kizek R.: Lis. Cukrov. Reprske 120, 220 (2004). 47. Kfk Z., Puncochrov J.: Chem. Listy 96, 611 (2002). 48. Kfk Z., Cudov P.: Chem. Listy 95, 400 (2001). 49. Prochckov T., Foltin M.: Chem. Listy 89, 770 (1995). 50. Vodickov H., Pckov V., Sestkov I., Mder P.: Chem. Listy 95, 477 (2001). 51. Fojt M., Fojtov M., Hvrn L., Pivonkov H., Dorck V., Sestkov I.: Anl. Chim. Act 558, 171 (2006). 52. Dorck V., Sestkov I.: Bioelectrochemistry 68, 14 (2006). 53. Sestkov I., Nvrtil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 54. Yosypchuk B., Sestkov I., Novotny L.: Tlnt 59, 1253 (2003). 55. Dbrio M., Rodriguez A. R., Bordin G., Bebinno M. J., De Ley M., Sestkov I., Vsk M., Nordberg M.: J. Inorg. Biochem. 88, 123 (2002). 56. Sestkov I., Vodickov H., Mder P.: Electronlysis 10, 764 (1998). 57. Petrlov J., Mikelov R., Stejskl K., Kleckerov A., Zitk O., Petrek J., Hvel L., Zehnlek J., Adm V., Trnkov L., Kizek R.: J. Sep. Sci. 29, 1166 (2006). 58. Brzdov M., Kizek R., Hvrn L., Plecek E.: Bioelectrochemistry 55, 115 (2002). 59. Adm V., Zehnlek J., Petrlov J., Potesil D., Sures B., Trnkov L., Jelen F., Vitecek J., Kizek R.: Sensors 5, 70 (2005). 60. Klejdus B., Zehnlek J., Adm V., Petrek J., Kizek R., Vcek J., Trnkov L., Rozik R., Hvel L., Kubn V.: Anl. Chim. Act 520, 117 (2004). 61. Kizek R., Vcek J., Trnkov L., Klejdus B., Kubn V.: Chem. Listy 97, 1003 (2003). 62. Mcek T., Mckov M., Truks M., Cundy A. S., Kotrb P., Yncey N., Schouten W. H.: Chem. Listy 90, 690 (1996). J. Petřek, J. Bloun,b, H. Vlšínová, L. Hvel, V. Adm b,c, J. Víteček, P. Bbul d, nd R. Kizek b ( Deprtment of Plnt Biology nd b Deprtment of Chemistry nd Biochemistry, Mendel University of Agriculture nd Forestry, Brno, c Deprtment of Anlyticl Chemistry, Fculty of Science, Msryk University, Brno, d Deprtment of Nturl Drugs, Veterinry nd Phrmceuticl University, Brno): Imge Anlysis nd Activity of Intrcellulr Esterses s New Anlyticl Tools for Determintion of Growth nd Vibility of Embryonic Cultures of Spruce (Pice sp.) Treted with Cdmium Introduction Imge nlysis (IA) of plnt structures is technique, which enbles us to quntify growth nd morphologicl chnges. IA is non-destructive, sterile nd simple method. Mteril nd methods We utilized CCD-cmer, nd GRAB-IT nd Imge- Pro softwre to digitlize of the imges. CCD-cmer determined the re of the clusters with devition of 0.31 % (n=10). IA ws utilized for determintion of growth of erly somtic embryos (ESEs) of spruce. Moreover, IA in connection with double stining cn be used for the deter- 576

mintion of vibility of the culture. These techniques hve been utilized for investigtion of the influence of Cd- EDTA (50, 250 nd 500 µmol l 1 ) on spruce cultures for twelve dys. Conclusion We found out tht increse in cluster re decresed nd number of ded cells incresed with elevting concentrtion of cdmium nd time of tretment. Glutthione content hs been studied by mens of dsorptive trnsfer stripping differentil pulse voltmmetry Brdick rection. We observed tht the content of glutthione ws nine times higher in ESEs treted by Cd-EDTA (500 µmol l 1 ) fter twelve dys in comprison with control ones. Česká společnost chemická Ústv chemie technologie schridů VŠCHT Prh pořádjí konferenci Polyschridy III Dtum místo konání: 16.11.2007, 8,30 ž 16,00 h n Novotného lávce 5, Prh 1 Konference bude změřen n průmyslovou výrobu využití polyschridů, výskyt, vlstnosti strukturu biologicky ktivních polyschridů deriváty polyschridů. Uzávěrk přihlášek je 15. září 2007. Předpokládá se zájem účstníků společností bez odborného příspěvku. Úvodní přednášk: RNDr. Desn Lišková PhD., Chemický ústv SAV Brtislv Vplyv glktoglukomnnových oligoschridov (GGMOs) n vývoj rstlín účsť v obrnných rekciách Vložné: Člen ČSCH nebo SCHS 700 Kč, osttní 800 Kč. Po 15. září 2007 činí vložné 1000 Kč. Vložné zhrnuje: CD s plnými texty přednášek (bude obshovt ISBN), výtisk Chemických listů č. 9 s bstrkty přednášek posterů, občerstvení orgnizční nákldy. Je možné zjistit ubytování n kolejích n Jižním městě. Vědecký výbor Doc. Ing. Jn Čopíková, CSc. Ústv chemie technologie schridů VŠCHT Prh Ing. Evžen Šárk, CSc. Ústv chemie technologie schridů VŠCHT Prh RNDr. Vldimír Erbn, CSc. Výzkumný ústv potrvinářský Prh Prof. Miln Mrounek, DrSc. Ústv živočišné fyziologie genetiky AV ČR Ing. Miroslv Novák, CSc. Vysoká škol chemicko-technologická v Prze Bližší informce n drese http://www.csch.cz Kontktní dres: Česká společnost chemická, Novotného lávk 5, 116 68 Prh 1, tel.: 221 082 370, tel/fx: 222 220 184, e-mil: chem.listy@csvts.cz, chem.spol@csvts.cz 577