LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Fakulta ptravinářské a bichemické technlgie Ústav analýzy ptravin a výživy LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ Stanvení vitaminů, kfeinu, antixidantů a knzervačních látek (metda: kapalinvá chrmatgrafie s UV detekcí) Garant úlhy: dc. Dr. Ing. Věra Schulzvá

OBSAH Základní pžadvané znalsti pr vstupní test... 3 Další dpručené tázky... 3 Náplň úlhy... 4 Časvý snímek cvičení... 5 A. Pracvní pstup pr stanvení vitaminu C v nápjích, vci a zelenině... 6 1. Pužitelnst metdy... 6 2. Princip metdy... 6 3. Pužívané přístrje a zařízení... 6 4. Chemikálie, rztky a standardy... 6 5. Pracvní pstup... 7 B. Pracvní pstup pr stanvení kfeinu, chlrgenvé kyseliny a knzervačních látek v nápjích... 9 1. Pužitelnst metdy... 9 2. Princip metdy... 9 3. Pužívané přístrje a zařízení... 9 4. Chemikálie, rztky a standardy... 9 5. Pracvní pstup... 9 C. Pracvní pstup pr stanvení antixidantů a jejich stability v vci, zelenině a v nápjích... 11 1. Pužitelnst metdy... 11 2. Princip metdy... 11 3. Pužívané přístrje a zařízení... 11 4. Chemikálie, rztky a standardy... 11 5. Pracvní pstup... 11 Vybavení pracvníh stlu... 12 Pžadavky na prtkl... 13 Klasifikace... 14 Přílhy... 15

Základní pžadvané znalsti pr vstupní test 1. Principy kapalinvé chrmatgrafie (stacinární fáze typy kln, mbilní fáze, detektry, princip spektrftmetrie, Lambert-Beerův zákn) 2. Přepčet hmtnsti na látkvé mnžství, hmtnstníh zlmku na hmtnstní kncentraci, hmtnstní kncentrace na mlární (látkvu) a napak, příprava rztků 3. Vyhdncení metdu kalibrační křivky, metdu příméh srvnání se standardem 4. Základní struktura a vlastnsti vitaminu C, jeh stabilita, dpručená denní dávka a běžný výskyt v ptravinách 5. Flavnidy, jejich vlastnsti, stabilita a výskyt v ptravinách 6. Kfein, jeh vlastnsti a výskyt v ptravinách 7. Knzervační látky, jejich pužití v ptravinách 8. Pravidla bezpečnsti práce a prtipžární chrany (Pžadvané znalsti jsu v rzsahu přednášek z Chemie ptravin a Analytické chemie a navazují na cvičení a přednášky z Analýzy ptravin) Další dpručené tázky Jaká je stabilita vitaminu C při půsbení tepla, světla, vzdušnéh kyslíku? Jaký je běžný bsah vitaminu C v ptravinách? C t jsu flavnidy a které látky se nejčastěji vyskytují v ptravinách? Jaký je běžný bsah některých flavnidů v ptravinách? Jaké jsu běžné hladiny kfeinu v kávě a energetických nápjích? Jaké je NPM (nejvyšší přípustná mnžství) kfeinu v ptravinách? Jaké knzervační látky znáte a pr jaké ptraviny je pvlen jejich pužití? Jaká jsu NPM knzervačních látek v ptravinách? Klik g standardu kyseliny askrbvé je ptřeba pr přípravu 100 ml zásbníh rztku kncentraci 1 mg/ ml? Jaký bjem (ml) deberete z tht zásbníh rztku pr přípravu 10ml standardních rztků kncentraci 30, 60, 90 a 120 mg/l? Deklarvaný bsah vitaminu C ve vzrku jablečnéh džusu je 10 mg/100 ml. Pžadvaná kncentrace (s hledem na rzsah kalibrační křivky) vitaminu C v naředěném vzrku je 50 mg/l. Jak připravíte 10 ml tht rztku? Deklarvaný bsah vitaminu C ve vzrku tablety je cca 100 mg v jedné tabletě. Jaký bude bsah (mg/l) vitaminu C v rztku získaném rzpuštěním tét tablety ve 100 ml extrakčníh činidla? Jaký bjem (ml) tht rztku ptřebuje pr naředění 10 ml rztku kncentraci 50 mg/l? 30 g hmgenizvaných brambr byl extrahván 80 ml 3% rztku kyseliny metafsfrečné. Získaný extrakt byl přefiltrván přes filtrační papír, filtrát byl kvantitativně převeden d 100 ml dměrné baňky a dplněn p značku extrakčním činidlem. 1 ml extraktu byl přefiltrván přes membránvý filtr a 20 µl extraktu byl nastříknut d kapalinvéh chrmatgrafu. Plcha dpvídající píku vitaminu C byla A=92. Jaká je výsledná kncentrace vitaminu C v brambrách v mg/kg, je-li rvnice kalibrační křivky y=1,7333x-4,5?

Náplň úlhy 1. Stanvení vitaminu C v nápjích, vci a zelenině metdu HPLC/UV, akreditvaná zkušební metda SZPI Praha (A/11), ČSN EN 14130 (adaptván pr ptřeby výuky) Sledvání stability vitaminu C v průběhu přípravy vzrku, skladvání a tepelnéh zpracvání 2. Stanvení kfeinu (případně chlrgenvé kyseliny), vitaminu C a knzervačních látek v nápjích ČSN EN 12856 (adaptván pr ptřeby výuky) 3. Stanvení dalších antixidantů (např. flavnidů) a sledvání jejich stability upřesnění ke stanvení bsahu vitaminu C v nápjích a vzrcích vce, zeleniny sledvání vlivu tepelných úprav na bsah vitaminu C a dalších látek Část studentů bude prvádět analýzy v čerstvém vzrku splečně s přípravu standardů, část studentů bude sledvat vliv zpracvání - tepelné úpravy (vaření, mražení), skladvání, různý způsb hmgenizace vzrků na hladiny vitaminu C Prvnání s nutričními tabulkami, vyhdncení vlivu tepelných úprav, degradace v závislsti na čase neb tepltě Pužité matrice Ovcné džusy, čaje a bnbóny bhacených vitamínem C, šípky, citrnvá šťáva (čerstvý vzrek, vzrek p zalití hrku vdu ), čerstvá a tepelně upravená zelenina (brambry, brklice, kapusta, pór, petržel, paprika, rajčata ) a vce. upřesnění ke stanvení kfeinu, vitaminu C a knzervačních látek v nápjích každý student (případně dvjice) studentů pracuje samstatně (nezávisle na statních studentech dané pracvní skupiny) a analyzuje jeden (přidělený) vzrek Pužité matrice Káva, čaj, energetické nápje upřesnění ke stanvení dalších antixidantů (např. flavnidů, kyseliny chlrgenvé) a sledvání jejich stability V rámci tét úlhy bude prveden sledvání dalších bilgicky aktivních látek např. některých flavnidů (katechin, rutin, kvercetin), případně sledvání bsahu rganických kyselin, chlrgenvé kyseliny atd. Pr stanvení uvedených látek budu využity vzrky analyzvané v předchzích úlhách (vce, zelenina, káva), jedntlivé analyty / skupiny analytů budu ze vzrku extrahvány metdu dpručenu asistentem. V některých případech bude sledván vliv pdmínek (viz předchzí úlhy) na stabilitu látek. Tyt analýzy budu realizvány jak dplňkvé k předchzím úlhám.

Časvý snímek cvičení Operace Přibližná časvá nárčnst (min) HPLC/UV Úvdní výklad a zkušení, test 20 min Navážení standardů a příprava vzrku 30 min Extrakce a filtrace vzrku 30 min Výklad k HPLC 20 min Měření vzrků 120 min Úklid 20 min Celkem 240 min (4 h) Studenti prvádějí alternativně stanvení pdle pracvníh pstupu A či B, úlha může být dplněna stanvení dalších bilgicky aktivních látek v přiděleném vzrku viz pstup C. Každý student zpracvává vlastní vzrek, v případě sledvání stability zpracvávají dva studenti stejný vzrek: 1. student - v čerstvém stavu, 2. student - p tepelných a jiných úpravách. Vlastní nálezy kyseliny askrbvé a dalších sledvaných látek student prvná s deklarvaným bsahem na balu vzrku (pkud je uveden), případně s běžnými bsahy uvedenými v dstupné literatuře.

A. Pracvní pstup pr stanvení vitaminu C v nápjích, vci a zelenině (pdle akreditvané zkušební metdy SZPI Praha (A/11) a ČSN EN 14130; adaptván pr ptřeby výuky) 1. Pužitelnst metdy Metda služí ke stanvení kyseliny askrbvé v nápjích, v vci a zelenině, v rstlinných výrbcích a ve vitaminvých přípravcích. 2. Princip metdy Kyselina askrbvá se z hmgenizvanéh materiálu extrahuje rztkem kyseliny metafsfrečné. P filtraci extraktu se její bsah stanví metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se prvádí metdu vnějšíh standardu. 3. Pužívané přístrje a zařízení Kapalinvý chrmatgraf Hewlett Packard Series HP1050 či Hewlett Packard Series HP1100 ( UV detektr, λ= 254 nm) Analytická klna s RP C18 neb RP C8 (250 4,6 mm, 5 μm; 125 4 mm, 5 μm) HP Chemstatin, Hewlett Packard, USA Analytické váhy Ultrazvukvá lázeň Labratrní mixer neb hmgenizátr, skleněné neb plastvé struhadl Vařič, nerezvý hrnec, rychlvarná knvice Pdtlakvé filtrační zařízení 4. Chemikálie, rztky a standardy - methanl (pr HPLC) - demineralizvaná a destilvaná vda - kyselina metafsfrečná - pkud není uveden jinak pužívají se chemikálie čistty p.a. - membránvý filtr przitě 5 µm - běžné labratrní skl kyselina L-askrbvá p.a. (PENTA) Příprava standardních rztků: Připravte zásbní rztk kyseliny L-askrbvé kncentraci cca 1 mg/ml v extrakčním činidle (příprava extrakčníh činidla viz bd 5.1).

Pr zhtvení kalibrační křivky připravte standardní rztky kncentraci 30, 60, 90 a 120 mg/l v extrakčním činidle (příprava extrakčníh činidla viz bd 5.1). Pznámka: Maximální dba pužitelnsti standardů je 1 den. 5. Pracvní pstup - mdifikace nrmy SZPI Praha (viz přílha návdů) 5.1. Příprava labratrníh vzrku Příprava extrakčníh činidla: 3 % rztk kyseliny metafsfrečné (tj. rztk 9 ml kapalné kyseliny metafsfrečné v 491 ml vdy, ppř. rzpustit 15 g pevné kyseliny metafsfrečné v 500 ml vdy). 5.1.1. Pevné vzrky 20-25 g pevnéh vzrku se hmgenizuje s 60-80 ml extrakčníh činidla p dbu 1 minuty. Získaný extrakt se přefiltruje přes filtrační papír, který se něklikrát prpláchne; případně je mžné využít fitrace za pmci vakua. Filtrát se kvantitativně převede d 100 ml dměrné baňky a dplní p značku extrakčním činidlem. Všechny rztky vzrků se před nástřikem d kapalinvéh chrmatgrafu filtrují přes skládaný filtr, ppř. membránvý filtr. 5.1.2. Kapalné vzrky Tekuté materiály se p dknalém prmíchání (mnžství se vlí pdle předpkládanéh bsahu, tak aby kncentrace v analyzvaném rztku dpvídala rzsahu kalibrace 30 120 mg/l) převedu d 100 ml dměrné baňky a dplní vdu p značku. Před nástřikem d kapalinvéh chrmatgrafu je nutné extrakt přefiltrvat přes membránvý filtr. 5.1.2. Tableta Tabletu je nutn zvážit a rzdrtit, na základě výpčtu student naváží příslušné mnžství tablety dle deklarvanéh bsahu vitaminu C d pžadvanéh bjemu (25, 50 neb 100 ml bude specifikván asistentem), tak aby výsledná kncentrace vitaminu C byla v rzsahu kalibrační křivky. Pznámka: V případě nutnsti (dezva je mim rzsah kalibrace) je mžné vzrek dále ředit extrakčním činidlem (kyselinu metafsfrečnu). Sledvání stability vitaminu C v průběhu přípravy vzrku, skladvání a tepelnéh zpracvání Pevné vzrky Vzrky vce a zeleniny jsu zahřívány v páře v nerezvém hrnci pdmínky dle určení asistenta Kapalné vzrky, čaje s bsahem vitaminu zrek je zalit hrku vdu, případně skladván za definvaných pdmínek - pdmínky dle určení asistenta 5.2. Stanvení kapalinvu chrmatgrafií

Analytická klna: analytická klna s RP C 18 neb RP C 8 (250 4,6 mm, 5 m; 125 4,6 m, 5 m;) s předklnku Mbilní fáze: methanl : vda (5:95, v/v) ph3 (H 3 PO 4 ) (připravená mbilní fáze se dplyní v ultrazvukvé lázni p dbu 10 minut) Průtk mbilní fáze: 1 ml/min Detekce: UV 254 nm Objem nástřiku: 20 µl Teplta klny: labratrní teplta 6.3. Identifikace a kvantitativní vyhdncení Identifikace se prvádí prvnáním retenčníh času analytu ve vzrku s retenčním časem kalibračníh standardu. Další mžnstí identifikace látky je přídavek standardu ke vzrku. Kvantitativní vyhdncení se prvádí metdu vnějšíh standardu buď dečtením kncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislsti plchy, příp. výšky píku na kncentraci standardu v g/l v rzsahu jednh řádu; kncentrace analytu ve vzrku musí ležet v intervalu mezi nejnižším a nejvyšším bdem kalibrační přímky) a přepčtem na půvdní vzrek neb prvnáním plchy, případně výšky píku sledvanéh analytu a standardu pdbné kncentrace a přepčtem na půvdní vzrek.

B. Pracvní pstup pr stanvení kfeinu, chlrgenvé kyseliny a knzervačních látek v nápjích (pdle ČSN EN 12856; adaptván pr ptřeby výuky) 1. Pužitelnst metdy Metda má univerzální pužití pr nápje (čaj, káva, energetické nápje, aj.). 2. Princip metdy Kfein a další sledvané látky se z hmgenizvanéh materiálu extrahuje vdu (pr rzpustné nápje, čaj, kávu). V extraktu se stanví p filtraci metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se prvádí metdu vnějšíh standardu. 3. Pužívané přístrje a zařízení - analytické váhy - ultrazvukvá lázeň - HPLC systém (Hewlett Packard 1050 či HP 1100 s UV detektrem) - analytická klna s RP C18 (125 4,6 mm, 5 μm) - běžné chemické skl a labratrní materiál 4. Chemikálie, rztky a standardy - destilvaná vda - methanl - standardy (kyseliny srbvé, kyseliny benzvé, kyseliny chlrgenvé a kfeinu) budu pskytnuty asistentem jak pevné látky či rztky - mbilní fáze: MeOH/acetátvý pufr (3/7, v/v); 5. Pracvní pstup 5.1 Příprava vzrků káva, čaj 1 g vzrku se naváží d 150 ml kádinky s přesnstí na 0,01 g. Přelije se 30 60 ml vrucí destilvané vdy a pnechá se 5 minut luhvat. P důkladném prmíchání se směs přefiltruje přes skládaný filtr d 100 ml dměrné baňky a dplní destilvanu vdu. Čirý filtrát se zředí 5 10 mbilní fází a nastřikuje se d dávkvací smyčky kapalinvéh chrmatgrafu. 5.2 Příprava tekutých vzrků Vzrek se dknale prmíchá a krátce dplyní v ultrazvukvé lázni. Pté se přefiltruje přes mikrfiltr d vialky Čirý filtrát se nastřikuje d dávkvací smyčky kapalinvéh chrmatgrafu.

5.3. Stanvení kapalinvu chrmatgrafií Analytická klna: Mbilní fáze: Průtk mbilní fáze: Detekce: Objem nástřiku: 10 neb 20 µl Teplta klny: labratrní teplta analytická klna s RP C18e (125 3 mm, 5 m;) spředklnku mbilní fáze: MeOH/acetátvý pufr (3/7, v/v); 1 ml/min UV 273 nm pr kfein, 254 nm pr kyselinu srbvu, 228 nm pr kyselinu benzvu 5.4 Identifikace a kvantitativní vyhdncení Identifikace se prvádí prvnáním retenčních časů píku ve vzrku s retenčním časem standardní látky. Pr kvantifikaci se připraví rztky směsných standardů čtyřech kncentracích: 50, 100, 200 a 400 µg/ml, naředěním zásbních rztků standardů (c = 1000 µg/ml). Kvantitativní vyhdncení se prvádí metdu vnějšíh standardu buď dečtením kncentrace analytu z kalibrační křivky (tj. závislsti plchy, příp. výšky píku na kncentraci standardu v µg/ml v rzsahu jednh řádu, kncentrace analytu ve vzrku musí ležet uvnitř - mezi nejnižším a nejvyšším bdem kalibrační přímky) a přepčtem na půvdní vzrek neb prvnáním plchy, případně výšky píku sledvanéh analytu a standardu pdbné kncentrace a přepčtem na půvdní vzrek Obsah kfeinu (případně knzervačních látek neb kyseliny chlrgenvé) v nealkhlických nápjích uvádějte v mg/l nápje, kncentrace v kávě a čaji v mg/kg. Rzsah kalibrační křivky pr další sledvané analyty bude specifikván asistentem.

C. Pracvní pstup pr stanvení antixidantů a jejich stability v vci, zelenině a v nápjích 1. Pužitelnst metdy Metda je pužitelná pr sledvání vybraných analytů v nápjích a rstlinných materiálech 2. Princip metdy Bilgicky aktivní látky se z hmgenizvanéh materiálu extrahují vdu či metanlem (případně jejich směsí). V extraktu se stanví p filtraci metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se prvádí metdu vnějšíh standardu. 3. Pužívané přístrje a zařízení - analytické váhy - ultrazvukvá lázeň - HPLC systém (Hewlett Packard 1050 či HP 1100 s UV detektrem) - analytická klna s RP C18 (250 4,6 mm, 5 μm; 125 4 mm, 5 μm) - běžné chemické skl a labratrní materiál 4. Chemikálie, rztky a standardy - destilvaná vda - kyselina fsfrečná knc. (p.a.) - methanl - zásbní standardní rztky sledvaných látek budu ddány asistentem - mbilní fáze: methanl/vda/kyselina fsfrečná (25/74/1, v/v/v) - standardy budu pskytnuty asistentem jak pevné látky či rztky 5. Pracvní pstup Příprava vzrků Vzrek je hmgenizván a extrahván vdu či metanlem (případně jejich směsí). Navážka a mnžství extrakčníh činidla bude upřesněn asistentem. V extraktu se stanví p dalším případném naředění a filtraci bsah sledvaných látek metdu vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí. Identifikace a kvantifikace se prvádí metdu vnějšíh standardu (viz. Pstup A a B).

Vybavení pracvníh stlu kmpletní dkumentace k úlze 4 kpie Labratrní skl: - filtrační nálevka (4 ) - váženka (2 ) - dměrná baňka 10 ml (5 ), 25 ml (1 ), 50 ml (3 ), 100 ml (3 ), 250 ml (2 ), 500 ml (2 ), - skleněné zátky - pipeta 1 ml (2 ), 10 ml (2 ), 5 ml (2 ), 2 ml (1 ) - Pasteurvy pipety, dudlík (1 ) - dměrný válec 50 ml (1 ), 250 ml (1 ) - kádinka 150 ml (2 ), 100 ml (2 ), 50 ml (2 ) - dsávací baňka (1 ) - Erlenmeyerva baňka 250 ml (1 ), 1000 ml (2 ) - Bűchnerův nástavec (2 ) - tmavá zásbní láhev - vývěva Labratrní ptřeby: - stříkačka 500 l (Hamiltn) (1 ) - lžička (2 ) - pipetvací balónek - filtrační papíry - membránvé filtry 5 m - střička (2 ) - struhadl - mixér - prkénk na krájení - nůž Chemikálie: - kyselina L-askrbvá - kyselina metafsfrečná - methanl - kyselina fsfrečná (v labratři ve skříni s anrganickými kyselinami)

Pžadavky na prtkl Jmén: Petr Nvák Jmén asistenta: Ing. Antnín Dvřák Skupina, den měření: (pndělí dpledne) Datum knání práce: 18. 9. 2011 Název práce: Stanvení vitaminů, kfeinu, antixidantů a knzervačních látek metdu kapalinvé chrmatgrafie s UV detekcí Knkrétní činnst studenta (např. Stanvení vitaminu C ve vzrcích brambr, vliv tepelnéh zpracvání na bsah vitaminu C) Označení a ppis analyzvanéh vzrku: (např. brambry, drůda Katka, raná; tableta s bsahem vitaminu C, Celaskn, č. šarže, deklarvaný bsah výrbcem) Princip metdy: stručně Pstup práce: stručně, uvést dkaz na nrmy, uvést dchylky d pstupu, veškeré navážky, pdmínky experimentu, výpčty (detailně a v chrnlgickém přadí: příprava zásbních rztků, ředění kalibrace, kalibrační křivka, výpčet bsahu sledvané látky ve vzrku) Výsledek: zakruhlit, pdtrhnut, jedntky Diskuse: diskutvat vlastní výsledky, prvnat s fakty dstupnými v literatuře a infrmacemi z předchzíh studia, psudit případný vliv pdmínek na stabilitu, nalezené hladiny prvnat s hladinami uváděnými v literatuře případně s hladinami deklarvanými výrbcem (tableta, energy drink) Závěr: slvně celu větu Pdpis Pznámka: Pkud jsu k prtklu přikládány grafické materiály (chrmatgramy, kalibrační křivky, grafy..), musí být na nich uveden jmén a skupina a musí být k prtklu pevně připjeny!

Klasifikace D klasifikace bude zahrnut: Příprava na úlhu, kntrla pžadvaných znalstí Výsledky kntrlníh testu / zkušení Správnst základních výpčtů v prtklu a ddržení frmálních pžadavků na prtkl Celkvá práce v labratři a přístup studenta Úklid v labratři a ddržvání rganizačních pravidel

Přílhy UV spektra sledvaných analytů Akreditvaná zkušební metda SZPI Praha (A/11) stanvení kyseliny askrbvé v ptravinách metdu HPLC ČSN EN 14130 Ptraviny Stanvení vitaminu C metdu HPLC titulní list Obsah vitaminu C, chlrgenvé kyseliny a kfeinu v některých ptravinách Velíšek J., Hajšlvá J.: Chemie ptravin, 3. vydání, OSSIS, Tábr, 2009. Sbírka záknů č. 52/2002 Pdmínky pužití kfeinu a chininu při výrbě ptravin Sbírka záknů č. 304/2004, část 6 Knzervanty a antixidanty, ddíl A - kyselina srbvá, benzvá a p-hydrxybenzvá ČSN EN 12856 Ptraviny Stanvení acesulfamu-k, aspartamu a sacharinu stanvení pmcí vyskúčinné kapalinvé chrmatgrafie (mžn též pužít pr stanvení kfeinu, srbvé a benzvé kyseliny v ptravinvých materiálech) - výběr

UV spektra sledvaných analytů Kyselina askrbvá 12 mg/l m A U *D AD 1, 1.834 (28.6 m AU, - ) R ef=1.594 & 2.041 f 101005000000.D 25 20 15 10 5 0 200 220 240 260 280 300 nm Kyselina chlrgenvá 250 mg/l m A U *D AD 1, 9.261 (738 m AU, - ) R ef=8.695 & 9.901 f 110907000000.D 700 600 500 400 300 200 100 0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

Kfein 250 mg/l m A U *D AD 1, 11.036 (1841 m AU, - ) R ef=2.809 & 14.996 f 110907000004.D 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 200 225 250 275 300 325 350 375 nm Kyselina srbvá 50 mg/ml mau DAD1, 11.507 (389 mau, - ) f 033-0301.D 350 300 250 200 150 100 50 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm