Beličková 1, J Veselá 1, E Stará 1, Z Zemanová 2, A Jonášová 2, J Čermák 1 1 Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2 Všeobecná fakultní nemocnice, Praha
MDS Myelodysplastický syndrom (MDS) je heterogenní skupina klonálních onemocnění s neefektivní hematopoézou (porucha diferenciace a nekontrolovaná proliferace) a dysplastickými změnami buněk. neefektivní hematopoéza periferní cytopenie (postihující jednu či více vývojových linií) zvýšená buněčnost KD
MDS Incidence onemocnění : 2-5 na 100 000 obyvatel u osob starších 70 let : 15-40 na 100 000 obyvatel 1/3 všech pacientů přechází neoplastickou transformací v akutní myeloidní leukemii. postupná malignizace mutované kmenové buňky vhodným in vivo modelem vzniku leukemie
MDS patogeneze MDS není doposud objasněna defekt hematopoetické buňky není dostatečně charakterizován nepravděpodobné, že by jediná odchylka způsobila poruchu postupné hromadění genetických a epigenetických změn spolu s alterovaným buněčným mikroprostředím vícestupňový proces
MDS LÉČBA 1. Transplantace kostní dřeně nebo hematopoetických kmenových buněk 2. Lenalidomid: imunomodulační lék, který může měnit či regulovat činnost imunitního systému pacienti s MDS s del (5q) 3. Demetylační léky: Vidaza, Decitabin inhibují DNA methyltransferázu a májí přímý cytotoxický účinek na abnormální hematopoietické buňky KD 4. Podpůrná léčba: růstové faktory, chelatační léčba
17p13.1 11 exonů (z nichž první se nepřekládá), 10 intronů Funkční molekula je tetramer Transkripční faktor řady genů ovlivňující proliferaci, apoptózu, reparaci DNA nebo angiogenezi FCE: TP53 monitoruje poškození DNA ANO spustí transkripci genu p21 zastaví dělení buňky, dokud není poškozené místo reparováno Pokud to nelze APOPTÓZA
TP53 Protein p53 se za normálních okolností v buňkách vyskytuje jen v nízké koncentraci, jeho hladina je kontrolována negativní autoregulační smyčkou skrz MDM2 Za stresových podmínek je aktivovaný a jeho koncentrace se zvyšuje TP53 často podléhá bodovým mutacím
TP53 MUTACE: nejčastěji v DNA-vazebné doméně (exony 5-8) nejčastější mutace jsou bodové substituce typu missense, méně časté frameshift či non-sense MDM2 není schopna degradovat mutantní TP53 zvyšování koncentrace Důsledek mutace: zkrácené a nefunkční formy proteinu nebo konformačně pozměněný protein MUTACE : Loss of function: ztráta tumor-supresorových vlastností (schopnosti vazby na promotor cílových genů a následnou regulaci) Gain of function bodové : získaná odolnost vůči chemoterapeutikům
MDS a TP53 10 % pacientů s MDS 17% MDS s del5q 72% MDS s komplexním karyotypem a -5/5q- Negativní prognostický faktor (detekce rizikových pacientů) Rezistence na léčbu, zvýšená progrese do AML BJH; 2013; Kulasekararaj
Běžně používanými laboratorními technologiemi ( Sangerovo sekvenování, Fassay analýza) nelze detekovat minoritní klony mutovaných buněk Ultra deep sekvenování pomocí 454 GS Junior od firmy Roche Amplikonové sekvenování, plata s primery pro 11 pacientů Studie v rámci ELN (The European LeukemiaNet ) Sekvenovali jsme nejčastěji mutovanou oblast (exony 4-11) K přípravě amplikovonové knihovny je nutno PCR produkt 3x přečistit: Biomek 3000 od firmy Beckman Coulter
PACIENTI + METODY: 47 low-risk MDS pacientů s del(5q) v době diagnózy nebo v počátcích choroby. Median věku pacientů: 69.5 let (48-82). 19 pacientů bylo léčeno lenalidomidem. TP53 byla analyzována z DNA izolované z CD34+ a CD34- buněk KD a CD3+ a CD14+ buněk z PK pomocí MACS separátoru. Průměrná coverage genu získané sekvence byla 900 čtení. > 20% mutantních klonů, mutace potvrzena Sangerovým sekvenováním
VÝSLEDKY : TP53 mutace byly zjištěny u 6 (z 47) pacientů (12,8%), 1 pacient měl dva mutované klony. Velikost mutovaného klonu byla v rozmezí 3.5 do 49.6%. 6 mutací typu missense, 1 typu nonsense. Zjistili jsme signifikantní rozdíly ve velikosti mutovaného klonu mezi buňkami KD a PK. Leukemické transformace byla pozorována u 4 (z 6) pacientů nesoucích mutaci TP53. Jeden pacient vykazoval značný pokles ve velikosti mutovaného klonu (23,9-2,3%) po léčbě lenalidomidem. Druhý pacient vykázal mírný nárůst mutantní klon (14,7-17,5%) v průběhu léčby. Nezjistili jsme signifikantní rozdíl v expresi mrna genů TP53, MDM2, MYC a CDKN1A mezi pacienty s mutací a pacientů bez mutace.
ZÁVĚRY: TP53 mutace byly spojeny s zvýšeným rizikem transformace MDS pacientů do AML. Identifikovaná velikost mutovaného klonu závisí na typu buněk. Analýzu provádět z buněk kostní dřeně. Uvažuje se zavést vyšetřování mutací v TP53 genu do mezinárodní prognostického skórovacího systému MDS.