Využití testu aktivace bazofilů s rekombinantními alergeny u pacientů se senzibilizací na pyly bojínku a pelyňku The basophil activation test with recombinant allergens in diagnosis of sensitization to timothy and mugwort pollens I. ŠETINOVÁ, M. HAVRANOVÁ, S. HONZOVÁ, A. DECASTELOVÁ Imunologické centrum, Imumed, Praha SOUHRN Do popředí zájmu se v současné době dostává diagnostika, založená na přesnější identifikaci alergenů component-resolved diagnosis (CRD). Cílem studie bylo zjistit možnosti využití testu aktivace bazofilů (BAT) u pacientů s alergií na pyl bojínku a pelyňku.v 1. skupině bylo vyšetřeno 16 pacientů s kl. projevy polinózy, pozitivitou kožního prick testu (SPT) s pylem bojínku a pozitivitou specifického IgE (sige) na pyl bojínku. Ve 2. skupině bylo 16 pacientů s polysenzibilizací na pyly trav a pelyňku, s pozitivitou SPT a sige na pyl bojínku a pelyňku. Kontrolní skupinu tvořilo 10 zdravých jedinců bez klinických i laboratorních známek senziblizace. Test aktivace bazofilů byl proveden s extraktem bojínku, pelyňku a s rekombinantními alergeny rphl 1,rPhl p 5, rphl p 7, rart v 1, rbet v 2. Zjištěná pozitivita na alergeny rphl p 1 a rphl p 5 v obou skupinách odpovídá udávané prevalenci senzibilizace na tyto hlavní alergeny v zemích střední Evropy. Ve 2. skupině bylo zachyceno signifikantně více pacientů s pozitivitou na vedlejší alergeny rphl 7 a rbet v 2. Polysenzibilizovaní pacienti reagovali méně s hlavním pelyňkovým alergenem rart v 1 než udávaná prevalence u monosenzibilizovaných pelyňkových alergiků. BAT s využitím rekombinantních alergenů může pomoci rozpoznat pacienty s rizikem pylové polysenzibilizace, zpřesnit diagnostiku a následně i léčbu. Klíčová slova: test aktivace bazofilů, rekombinantní alergeny, senzibilizace na pyl trav, pelyňku SUMMARY The aim of our study was to find out if component- resolved diagnosis by the use of recombinant allergens in the BAT can be helpful for in vitro diagnosis in patients of allergy to timothy and mugwort pollens.16 patients with a seasonal rhinitis, positive skin prick test (SPT) and specific IgE (sige) to timothy and 16 patients with seasonal rhinitis and positive SPT, sige to timothy and mugwort were investigated. 10 healthy people with negative SPT to a battery of common allergens were selected as a control group. Standardized commercial extract of timothy and mugwort pollen allergens were used for the stimulation of the basophils. The BAT was also used for determining the number of patients sensitized to recombinant allergens rphl 1, rphl 5, rphl 7, Art v 1 and rbet v 2.The prevalence of sensitization to the major timothy allergens rphl 1, rphl 5 by the BAT in both groups corresponded to results obtained in studies for these allergens in central Europe. There are significantly more patients in the group with multiple sensitization, who had positive the BAT to the minor allergens rphl 7 and rbet v 2. Fewer patients were positive to the major allergen rart v 1 than the prevalence obtained in studies for patients with monosenzitization to mugwort pollen.the BAT by the use of recombinant allergens can be useful in the allergy diagnosis and show the senzitization pattern in individual patients. Key words: the basophil activation test, recombinant allergens, senzitization to timothy, mugwort Úvod Senzibilizace na pyly trav patří k nejčastějším sezónním respiračním alergiím v oblasti střední Evropy. Postihuje 8 25 % populace a způsobuje nasální, oční a bronchiální příznaky (13). Hlavní skupinou alergenů pylů trav, která byla identifikována nejméně u 19 travních druhů, je skupina beta expansinů s molekulovou vahou 27 32 kda. Do této skupiny patří také hlavní alergen bojínku Phl p 1 (27 kda). Byla prokázána silná zkřížená reaktivita tohoto alergenu s ostatními druhy trav (6,13). 90 95 % travních alergiků je 279
senzibilizováno na tuto skupinu alergenů (10,20). K dalším hlavním alergenům bojínku patří alergen Phl p 2 (19 20kDa) a Phl p 5 (27 33 kda). Přibližně 60 85 % travních alergiků reaguje s touto skupinou alergenů (10,20). Mezi vedlejší bojínkové alergeny řadíme tyto alergeny: Phl p 7 (8 kda, calcium binding protein), Phl p 11 (20 kda), Phl p 12 (14 kda, profilin), Phl p 13 (55 60 kda) (2,13,20). Prevalence senzibilizace na tyto vedlejší alergeny obvykle nepřesahuje 30 % (7,20). Příčinou polinotických obtíží během pozdního léta a podzimu v zemích střední Evropy je velmi často pyl pelyňku (11,15). Jako hlavní alergen pelyňku byl označen alergen Art v 1 s molekulovou vahou 25 30 kda, na který je senzibilizováno 90 % pelyňkových alergiků (11,14,21). Vedlejšími alergeny pelyňku jsou alergeny Art v 2 (35 kda), Art v 3 (13kDa) a Art v 4 (15 kda). Prevalence na tyto alergeny je udávána mezi 30 50 % (11,15). Alergeny Art v 3 (lipid transfer protein) a Art v 4 (pro- Obr. 1: Test aktivace bazofilů u pacienta s monosenzibilizací na pyl bojínku. A negativní kontrola, B pozitivní kontrola, C extrakt bojínku, D rphl p 1, E rphl p 5, F rphl p 7 G rbet v 2 Obr. 2: Test aktivace bazofilů u pacienta s polysenzibilizací na pyl bojínku a pelyňku. A negativní kontrola, B pozitivní kontrola, C extrakt bojínku, D rphl p 1, E rphl p 5, F rphl p 7, G rart v 1, H rbet v 2 280
filin) jsou zodpovědné za projevy zkřížené alergie s potravinami rostlinného původu (6,11,15,21). Současné formy alergenové diagnostiky jsou prováděny alergenovými extrakty. Diagnostika pomocí těchto extraktů nás informuje o tom, zda daný pacient je senzibilizován na tento extrakt, bez identifikace jednotlivých alergenů (8, 11). K významnému zlepšení diagnostiky in vitro mohou přispět rekombinantní alergeny (3, 10, 17, 20). Využití rekombinantních alergenních molekul tvoří základ diagnostiky, založené ke zjištění senzibilizace na jednotlivé alergeny component-resolved diagnosis (CRD). Tato diagnostika umožní lépe charakterizovat alergického pacienta a vybrat optimální léčebnou strategii (16). Dobře definované rekombinantní alergeny lze využít jako diagnostický znak. CRD založená na využití hlavních rekombinantních alergenů rphl p 1, rphl p 2, rphl p 5, rphl p 6, rart v 1, rbet v 1 je schopna detekovat pacienty se senzibilizací na hlavní alergeny jednotlivých pylů. Ty jsou označovány jako rodové alergeny (family allergens). Rekombinantní alergeny s vysokým zkříženě reagujícím potenciálem mohou být využity k odhalení rizika polyvalentní pylové senzibilizace (3,10).Využití rekombinatního alergenu profilinu r Bet v 2 (u bojínku se jedná o alergen Phl 12, u pelyňku Art v 4) umožní odhalit rizikové pacienty s polysenzibilizací na botanicky nepříbuzné rostliny a rostlinné potraviny (2,3,10,12). Jako vysoce zkříženě reagující pylový alergen je označován vápník vázající protein (calcium binding protein). Byl identifikován v pylu celé řady rostlin (stromy, trávy, byliny). U pylu bojínku se jedná o vedlejší alergen Phl p 7 (u břízy Bet v 3 a Bet v 4), byl nalezen také v pylu pelyňku Art v 5 (6,12,13,10). Je označován jako specifický pylový alergen, neboť pacienti senzibilizovaní na tento alergen jsou v riziku rozvoje vysoce zkřížené senzibilizace na široké spektrum dalších pylových alergenů (10,13,20). Dosud nebyl detekován v rostlinných potravinách a nebyla zjištěna zkřížená potravinová reaktivita v souvislosti s tímto pylovým panalergenem. U pacientů s pozitivitou na tento alergen můžeme spíše očekávat senzibilizaci na živočišné bílkoviny (7,10). Přesnější diagnostika pomocí rekombinantních alergenů může být významnou pomocí v rozhodování o zahájení léčby specifickou alergenovou imunoterapií (20). Test aktivace bazofilů (BAT) patří do skupiny tzv. funkčních testů, které jsou používány k in vitro diagnostice časné přecitlivělosti (4,5,9). V naší pilotní studii jsme využili BAT k diagnostice IgE mediované časné přecitlivělosti na pyly bojínku a pelyňku u pylových alergiků s využitím jednotlivých rekombinantních alergenů. Metodika: Pacienti byli rozděleni do 3 skupin. 1. skupinu tvořilo 16 pacientů (věk 11 44 let, 5 mužů/ 11 žen), kteří byli monosenzibilizováni pouze na pyly trav, především na pyl bojínku. Vybráni byli dle klinických příznaků, pozitivity SPT na komerční extrakt bojínku a pozitivity sige na pyl bojínku; 2. skupinu tvořilo 16 pacientů (věk 14 45 let, 6 mužů/ 10 žen), kteří byli senzibilizováni na pyly trav, obilnin i pyl pelyňku, řada z nich i na další pyly. Klinické příznaky trvaly do pozdního léta. Všichni pacienti reagovali pozitivně v kožních testech s pylem bojínku i pelyňku, měli pozitivitu sige na pyl bojínku a pelyňku; 3. skupinu kontrolní tvořilo 10 zdravých jedinců (věk 24 55 let, 1 muž/9 žen) s negativní rodinnou i osobní anamnézou ve smyslu atopie, s negativitou SPT na základní řadu inhalačních alergenů. Vyšetření: Kožní prick test (SPT) Byly provedeny testovací komerční soupravou Alyostal fy Stallergens s extraktem bojínku a pelyňku. Jako pozitivní kontrola byl použit histamin hydrochlorid (10 mg/ml), negativní kontrola byla provedena s 0,9% NaCl. Výsledek byl odečítán za 15 minut. Za pozitivní reakci byl hodnocen pupen o průměru 3 mm a více při srovnání s negativní kontrolou. Stanovení sige Specifické IgE (sige) na alergen bojínku a pelyňku bylo stanoveno na přístroji Immulite 2000 (DPC). Jako pozitivní byla považována hodnota nad 0,35 U/ml. Test aktivace bazofilů Vyšetření bylo prováděno z plné krve odebrané do heparinu. Na 1 test bylo třeba 100 μl krve. Pro každého pacienta byla stanovena negativní kontrola (bez stimulace) a pozitivní kontrola (stimulace 0,4 μg anti-ige). Stimulace buněk byla provedena buď 10 ředěným alergenem Alyostal (Stallergenes) nebo 10 ředěnými rekombinantními alergeny rphl 1, rphl 5, rphl 7, rbet v 2, rart v 1 (10 μl 0,01 mg/ml, Biomay). Detekce bazofilů byla prováděna pomocí monoklonální protilátky anti-cd203c/pe (Beckmann-Coulter). Aktivace byla detekována protilátkou anti-cd63/fitc (Exbio). Měření bylo prováděno na průtokovém cytometru FC 500 (Beckman-Coulter). Pro každý vzorek byla provedena detekce nejméně 500 bazofilů a na tomto množství i sledována exprese aktivačního znaku CD63. Jako pozitivní výsledek byla považována aktivace více než 15 % bazofilů (> 15 % CD203c+CD63+) obrázek č. 1 a č. 2. Výsledky: 1. skupina monosenzibilizovaných pacientů na pyl bojínku: Všichni pacienti zareagovali pozitivně v BAT s komerčním extraktem bojínku. Senzibilizace na hlavní alergen bojínku rphl p 1 pomocí BAT byla zjištěna u 14/16 (87,5 %) pacientů, na rphl p 5 u 11/16 (68,7 %) pacientů. Pozitivita na vedlejší alergen rphl p 7 byla zachycena u 2/16 (12,5 %) pacientů. U žádného pacienta nebyla zachycena pozitivita na vedlejší alergen profilin. Diagnostika na tento alergen byla prováděna pomocí rekombinantního alergenu rbet v 2. (graf č. 1). 2. skupina polysenzibilizovaných pylových alergiků: U všech pacientů byla zjištěna pozitivní aktivace bazofilů s extraktem bojínku a pelyňku. 281
Pozitivita BAT na hlavní alergen rphl p 1 byla zachycena u 14/16 (87,5 %) pacientů, na rphl p 5 u 13/16 (81,2 %) pacientů, na rphl p 7 u 3/16 (18,7 %) pacientů. Na vedlejší alergen rbet v 2 bylo pozitivních 5/16 (31,2 %) pacientů. Na hlavní alergen pelyňku rart v 1 zareagovali pozitivně 4/16 (25 %) pacienti (graf č. 2). V kontrolní skupině 10 pacientů nebyla zachycena pozitivita s extraktem bojínku, pelyňku ani s jednotlivými rekombinantními alergeny. Diskuse: Ve skupině monosenzibilizovaných alergiků na pyl bojínku zareagovalo 87,5 % pacientů na hlavní alergeny bojínku rphl p 1 a rphl p 5, čemuž odpovídá udávaná prevalence senzibilizace na tyto hlavní alergeny v zemích střední Evropy (80 100 %). Pouze 2 pacienti zareagovali na vedlejší alergen rphl p 7, tzn. 12,5 %. Prevalence této zkřížené reaktivity prostřednictvím vápník vázajícího proteinu je udávána u 5 10 % travních alergiků (10,20). U jednoho z těchto 2 pacientů byla zjištěna i senzibilizace na plíseň Alternaria. U žádného z nich nebyly zaznamenány projevy zkřížené potravinové alergie. Vzhledem k popisované výrazné zkřížené reaktivitě tohoto panalergenu i s dalšími pylovými alergeny bude u těchto pacientů v budoucnu pravděpodobně zvýšené riziko rozvoje polysenzibilizace i na další pyly (10). Ve 2. skupině polysenzibilizovaných pylových alergiků na pyl trav i pelyňku zareagovalo 87,5 % pacientů na hlavní alergeny bojínku rphl p 1 a rphl p 5. Na vedlejší profilinový alergen rbet v 2 reagovalo 31,2 % pacientů. Tito pacienti reagovali pozitivně v kožním testu i s pylem břízy. 18,7 % pacientů reagovalo na vedlejší alergen rphl p 7. U těchto pacientů byla zachycena pozitivita v kožním testu na roztoče, plíseň Alternaria a na epitelie kočky. Ve 2. skupině zareagovalo signifikantně více pacientů na vedlejší alergeny rphl 7 a rbet v 2 (p < 0,005). Při rozboru senzibilizace na pelyňkový alergen u pacientů ve 2.skupině pouze 25 % reagovalo pozitivně na hlavní pelyňkový alergen rart v 1. Ostatní pacienti s pozitivitou v kožních testech a pozitivitou sige na pyl pelyňku reagují prostřednictvím vedlejších pelyňkových alergenů. 5 pacientů reaguje na profilinový alergen (u pelyňku se jedná o alergen Art v 4). Bylo prokázáno, že profilinový alergen z různých zdrojů je imunologicky ekvivalentní a může být reprezentován jedním zástupcem při laboratorní diagnostice (14). 3 pacienti ve 2. skupině reagují na vedlejší alergen rphl p 7 (calcium binding protein), který byl identifikován také v pelyňku Art v 5 (10). Ostatní pacienti jsou pravděpodobně senzibilizováni na jiné vedlejší pelyňkové alergeny (Art v 2, Art v 3). Tyto alergeny zatím nejsou komerčně k dispozici v rekombinantní formě. Při monosenzibilizaci pouze na travní alergeny ( pacient nereaguje klinicky ani v kožních testech na ostatní pylové alergeny stromů a bylin) diagnostika a následně léčba standardizovanou pylovou vakcínou bude úspěšná, neboť riziko fenoménu zkřížené reakce mezi ostatními pyly (a event. i potravinami) je minimální (7). Pacienti jsou ve větší míře senzibilizováni především na hlavní travní alergeny, jak vyplývá i z našich výsledků. Složitější situace nastává v případě pylové polysenzibilizace, kdy pacient má klinické obtíže, svědčící pro možnost senzibilizace i na další pyly a především reaguje v kožních testech nejen s pyly trav, ale i s pyly bylin a event. stromů. Při rozhodování o vakcinoterapii obvykle volíme dle kožních testů cestu směsné vakcíny. Vzhledem i k našim výsledkům je zde však velké riziko senzibilizace pouze na některý vedlejší pylový alergen. Tyto alergeny většinou nejsou ve směsných vakcínách obsaženy v dostatečné míře a efekt této léčby může být nejistý. V těchto případech může pomoci diagnostika s využitím rekombinantních alergenů CRD (3,10). V naší studii u pacientů, kteří reagovali pouze na některý vedlejší pelyňkový alergen lze předpokládat, že mohou být primárně senzibilizováni na jiný pylový alergen a díky vysokému zkříženě reagujícímu potenciálu vedlejších alergenů reagují pozitivně v kožním testu a v in vitro testech i s pylem pelyňku. Přidání pelyňku (tzn. především jeho hlavního alergenu) do směsné vakcíny, nemusí mít vždy klinický efekt. V literatuře udávaná 90% prevalence na hlavní pelyňkový alergen Art v 1 se týká především monosenzibilizovaných pelyňkových alergiků (11,15). V některých studiích je již poukázáno na stoupající prevalenci senzibilizace na vedlejší pelyňkové alergeny 30 50 %, u Art v 3 až 70 % (11). K definitivní diagnostice u těchto pacientů však chybí provedení nasálního provokačního testu s jednotlivými alergeny pelyňku a srovnávací studie s pacienty, kteří jsou monosenzibilizováni jen na pyl pelyňku. Pozitivita BAT u pacientů s časnou senzibilizací na pyl bojínku Pozitivita BAT u pacientů s časnou senzibilizací na pyl bojínku a pelyňku počet pacientů 16 14 12 10 8 6 4 2 0 rphl p 1 rphl p 5 rphl p 7 rbet v 2 rekombinantní alergeny počet pacientů 16 14 12 10 8 6 4 2 0 rphl p 1 rphl p 5 rphl p 7 rbet v 2 rart v 1 rekombinantní alergeny Graf č. 1: Výsledky testu aktivace bazofilů s rekombinantními alergeny u pacientů s monosenzibilizací na pyl bojínku. Graf č. 2: Výsledky testu aktivace bazofilů s rekombinantními alergeny u pacientů s polysenzibilizací na pyl bojínku a pelyňku. 282
Závěr: V naší pilotní studii jsme chtěli poukázat na problematiku polysenzibilizovaných pylových alergiků. Diagnostické testy založené především na identifikaci hlavních rodových pylových alergenů (Phl p 1, Phl p 5, Art v 1, Bet v 1) mohou pomoci odhalit pacienty, kteří jsou skutečně primárně senzibilizováni na dané pyly. K pacientům, u kterých najdeme pozitivitu jen na některé vedlejší alergeny, bychom měli přistupovat s vědomím, že mohou být primárně senziblizováni na jiné pylové alergeny (10). Při volbě směsných vakcín pak vždy přidávat jen ty alergeny, na které je pacient primárně senzibilizován. Test aktivace bazofilů s využitím rekombinantních alergenů může pomoci k odhalení jedinců s rizikem pylové polysenzibilizace (a možným rizikem zkřížené senzibilizace i na potraviny rostlinného původu). Zároveň může také pomoci při rozhodování o vhodném složení alergenové vakcíny. Alergenová imunoterapie s využitím této diagnostiky může být pak efektivnější a bezpečnější. MUDr. Ivana Šetinová Imumed s. r. o. Mlynářská 4 110 00 Praha 1 LITERATURA: 1. Asero R. Plant Food Allergies. A Suggested Approach to Alergen-Resolved Diagnosis in the Clinical Practice by Identifying Easily Available Sensitization Markers. Int Arch Allergy Immunol 2005;138:1-11. 2. Asero R, Mistrello G, Roncarolo D, Amato S, Zanoni D, Barocci F, Caldironi G. Detection of clinical markers of sensitization to profilin in patiens allergic to plant-derived foods. J Allergy Clin Immunol 2003;112:427-32. 3. Chapman M, Smith A, Aires L, Artura K, Dhanaraj V, Pomés A. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic disease. J Allergy Clin Immunol 2000;106:409-18. 4. Ebo DG, Hagendorens MM, Bridže CH, Schuerwegh AJ, De Clerck L.S, Stevens W.J. In vitro allergy diagnosis: should we follow the flow? Clin Exp Allergy 2004;34:332-339. 5. Erdmann M, Heussen N, Moll-Slodowy, Merk HF, Sachs B. CD63 expression on basophils as a tool for diagnosis of pollen-associated food allergy: Sensitivity and specificity. Clin Exp Allergy 2003;33:607-614. 6. Ferreira F, Hawranek T, Gruber P, Wopfner N, Mari A. Allergic cross-reactivity: from gene to clinic. Allergy 2004;59:243-67. 7. Fuchs M. Alergeny bojínku lučního a zkřížená alergie. Alergie 2005;2:133-38. 8. Harwanegg C, Laffer S, Hiller R, Mueller MW, Kraft D, Spitzauer S,Valenta R. Microarrayed recombinant allergens for diagnosis of allergy. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13. 9. Honzová S, Havranová M. Test aktivace bazofilů, jeho přínos pro klinickou praxi. Alergie 2003;4:292-7. 10. Kazemi-Shirazi l, Niederberger V, Linhart B, Lidholm J, Kraft D,Valenta R. Recombinant Marker Allergens: Diagnostic Gatekeepers for the Treatment of Allergy. Int Arch Allergy Immunol 2002;127:259-268. 11. Lombardero M, Garcia Sellést F, Polo F, Mámeno L, Chamorro M, Garcia-Casado G, Sanchez-Monge R, Diaz-Peralest A, Salcedo G, Barber D. Prevalence of senzitization to Artemisia allergens Art v 1, Art v 3 and Art v 60 kda. Cross-reactivity among Art v 3 and other relevant lipid-transfer protein allergens. Clin Exp Allergy 2004;34:1415-1421. 12. Mari A. Multiple Pollen Sensitization: A molecular Approach to the Diagnosis. Int Arch Allergy Immunol 2001;125:57-65. 13. Mari A. Skin test with timothy grass(phleum pretense)pollen extrakt vs.ige to timothy extrakt vs.ige to rphl p 1, rphl p 2, rphl p 4, rphl p 5, rphl p 6, rphl p 7, rphl p 11 and rphl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy 2003;33:43-51. 14. Radauer C, Fuchs H, Willerroider M, Ferreire-Briza F, Thalhamer J, Hoffmann-Sommergruber K, Scheiner O, Breitender H. The degree of cross-reactivity of profilin-specific immunoglobulin E differs between patients and may determine the extent of profilin-mediated plant food allergy. Abstrakt book XXV. Congress of EAACI, Vienna 2006;296. 15. Schmidt-Grendelmeier P, Holzmann D, Himly M, Reichel M,Tresch S, Rückert B, Menz G, Ferreira F, Laser K, Wüthrich B, Crameri R. Native Art v 1 and recombinant Art v 1 are able to induce hukotal and T cell-mediated in vitro and in vivo response in mugwort allergy. L Allergy Clin Immunol 2003;111:1328-36. 16. Valent P, Hauswirth A.W, Natter S, Sperr W.R, Bühring H-J, Valenta R. Assays for measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods 32 (2004):265-270. 17. Valenta R, Kraft D. From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy. Curr Pin Immunol 2002;14:718-727. 18. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergen molecules tools to study effector cell activation. Immunol Reviews 2001;179:119-127. 19. Valenta R, Lidholm J, Niedeberger V, Hayek B, Kraft D, Grönlund H. The recombinant allergen-based concept of component-resolved diagnostics and immunotherapy (CRD and CRIT). Clin Exp Allergy 1999;29: 896-904. 20. Weber RW. Patterns of pollen cross-allergenicity. J Allergy Clin Immunol 2003;112:229-239. 21. Wopfner N, Gadermaier G, Ether M, Asero R, Exner Ch, Jahn- Schmid B, Ferreira F. The spectrum of Allergens in Ragweed and Mugwort Pollen. Int Arch Allergy Immunol 2005;138:337-346. 284