ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Kultivační stanovení: Stanovení Pseudomonas aeruginosa Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D. 217 17 5642 Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování: 2015 1
Kultivační stanovení: Stanovení Pseudomonas aeruginosa Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení počtu a izolaci Pseudomonas aeruginosa ve vzorcích balené vody metodou membránových filtrů. Rovněž je možné metodu použít pro jiné druhy vod s nízkým počtem doprovodné mikroflóry, pro vody z bazénů a vody určené pro lidskou spotřebu. Mez detekce a mez stanovitelnosti: Teoretická mez detekce je 1 KTJ/100 ml, tj. nález jedné kolonie na ploše membránového filtru při filtraci 100 ml vzorku. Mez stanovitelnosti jsou 3 KTJ/100 ml pro 95% pravděpodobnost kladného výsledku za podmínek filtrace 100 ml. Pracovní rozsah: Pracovní rozsah je od 0 KTJ/250 ml (dáno požadavkem Směrnice 80/777/EHS a Směrnice 96/70/EC.) Shora pracovní rozsah není omezen, lze filtrovat menší objem vzorku nebo použít desetinné ředění vzorku. Např. dle Směrnice 98/83/EC je možné pro ostatní vody i vody určené k lidské spotřebě z důvodů veřejného zdraví zkoušet i objemy 100 ml. Stanovený ukazatel: Pseudomonády jsou gramnegativní aerobní tyčinky, které rostou na selektivním médiu obsahujícím cetrimid a produkují pyocyanin, nebo jsou to mikroorganismy, které rostou na selektivním médiu obsahující cetrimid, jsou oxidázapozitivní, vykazují fluorescenci v UV záření (360 365 nm) a jsou schopny produkovat amoniak z acetamidu. Pseudomonas aeruginosa je pro člověka příležitostný patogen, který je schopný růst ve vodě i s velmi nízkou koncentrací živin. Je to typový druh rodu Pseudomonas. Jak ukazují některé testy, pseudomonády mají oxidační metabolismus a obvykle redukují dusičnany na nižší oxidační stupeň, než jsou dusitany. Většina kmenů, až 98 %, produkuje fluoreskující pigment rozpustný ve vodě. Většina kmenů je schopna růstu při teplotě 42 C, ale nikoliv při 4 C, což odlišuje Pseudomonas aeruginosa od Pseudomonas fluorescens, rostoucí právě při 4 C, ale již ne při 42 C. Podstata zkoušky: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku se přefiltruje přes membránový filtr, který se pak přenese na selektivní kultivační agarové médium s cetrimidem. Naočkované misky s membránovými filtry se kultivují po dobu 24 h a 48 h při teplotě 36 C ± 2 C. Po inkubaci se spočítají jako presumptivní počty Pseudomonas aeruginosa charakteristické kolonie. Kolonie produkující pyocyanin, tj. modrozelené se považují za potvrzené Pseudomonas aeruginosa, u ostatních kolonií je nutné provést konfirmaci. Bílé anebo červenohnědé kolonie vykazující fluorescenci pod UV lampou při 360 nm je nutné potvrdit dalšími konfirmačními testy (oxidázový test, acetamidový test a růst na Kingově médiu B). 2
Přístroje a pomůcky: Analytické váhy citlivost 0,01 g. Autokláv (121 ± 3) C. Bakteriologické kličky. Bunsenův kahan. Erlenmayerovy láhve, lahve DURAN 45 se šroubovým uzávěrem. Filtrační papíry o průměru 50 mm. Filtrační zařízení s vývěvou SARTORIUS. Membránové filtry o průměru 50 mm a velikosti pórů 0,45 m. Pinzety. Pipety s možností aplikace objemu 1 a 10 ml (popř. 0,1 ml dle povahy vzorku a potřeby), jednorázové špičky. Sterilní plastové Petriho misky o průměru 60 mm. Termostat 36 C ± 2 C. UV lampa pracující při 360 365 nm (350 ± 20 nm). Zkumavky s uzávěrem (objem např. 10 ml). Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Tato voda se používá i pro potřeby ředění vzorku. Pseudomonas agar base/cn (HiMedia M085). Cetrinix Supplement (HiMedia FD029). Kingovo médium B (HiMedia M120I). Acetamidové tekuté kultivační médium (HiMedia M148I). Nesslerovo činidlo (R010). Oxidázové činidlo, popř. roztok pro cytochromoxidázový test. Ředící roztok (fyziologický roztok). Postup zkoušky: Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 C až 25 C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku. Promíchání vzorku: Vzorek se musí dokonale promíchat intenzivním protřepáním, aby se bakterie rovnoměrně rozptýlily v celém objemu vzorku. Volba vhodného objemu vzorku: Zkoušený objem vzorku nebo zředěného vzorku má být volen tak, aby na membránovém filtru o průměru 5 cm vyrostlo nejvýše 100 kolonií. Pro balené vody je stanoven objem filtrovaného vzorku 250 ml. U bazénových vod je stanoven objem filtrovaného vzorku 250 ml. Možné je i zkoušet vzorek o objemu 100 ml, pokud to stanovení a prostředí vyžaduje. 3
U surových vod povrchových, kde je předpoklad vyššího mikrobiálního znečištění se použije přiměřeně menší objem filtrovaného vzorku, případně vzorek zředěný. Stupeň zředění se určuje podle zkušenosti z předchozích rozborů, u vzorků neznámého složení se připravuje stupňů ředění více. Pro každý stupeň zředění se užívá zřeďování v poměru 1:10. Zřeďování se provádí v lahvičkách se zábrusovým uzávěrem obsahujících 9 ml nebo 90 ml sterilního ředícího roztoku přidáním 1 ml nebo 10 ml vzorku neředěného nebo již zředěného v nižším stupni. Lahvička se uzavře a promíchá intenzivním protřepáním. Filtrace: Zapojí se filtrační přístroj a vývěva. Plamenem kahanu se vysterilizuje pevný, porézní disk spodní části filtrační nálevky. Sterilní pinzetou se na něj umístí sterilní membránový filtr a upevní se sterilní nálevka. Při zavřeném kohoutu vývěvy se nalije nebo odpipetuje do nálevky požadovaný objem vzorku. Následuje otevření výpustného kohoutu spodní části nálevky a pomocí vakua vývěvy se vzorek přefiltruje. Kultivace: Po odsátí celého objemu vody se odstraní nálevka a membránový filtr se přenese sterilní pinzetou na pevné kultivační Pseudomonas agarové médium s cetrimidem v Petriho misce. Filtr se klade pozvolna tak, aby nevznikly mezi kultivačním médiem a filtrem vzduchové bubliny. Takto připravené misky se obrácené dnem vzhůru uloží do termostatu a kultivují se při teplotě 36 C ± 2 C po dobu 44 h ± 4 h. Po době 22 h ± 2 h a 44 h ± 4 h kultivace se počítají presumptivní kolonie (viz obr. 1). Obr. 1. Stanovení Pseudomonas aeruginosa, vzhled kolonií na agarovém CN médiu po 24 h (vlevo) a 48 h kultivace (vpravo). V horní řadě fotografií jsou kolonie na membránovém filtru po filtraci 50 ml vzorku, v dolní řadě po filtraci 100 ml vzorku. 4
Konfirmace: Všechny kolonie produkující modrozelený pigment pyocyanin (viz obr. 1), se považují za již potvrzené Pseudomonas aeruginosa, tyto kolonie se spočítají. Dále se membránový filtr s koloniemi přenese pod UV lampu (360 365 nm) a rychle se vyhodnotí kolonie vykazující modrou fluorescenci (delší ozařování usmrcuje bakterie). Kolonie s fluorescencí (viz obr. 2) se považují za presumptivní Pseudomonas aeruginosa a jejich příslušnost (identita) se potvrdí testem v acetamidovém tekutém médiu (viz obr. 2). Pokud se na membránovém filtru vyskytují červenohnědé kolonie, které nevykazují fluorescenci, je nutné je spočítat a jejich identitu potvrdit pomocí oxidázového testu, acetamidového média a Kingovo média B. Pro přehlednost postupu potvrzení kolonií rostoucích na CN agaru je uvedena tabulka 1. Obr. 2. Konfirmace kolonií rostoucích na agarovém CN médiu pod UV lampou, modře svítící fluoreskující jsou presumptivní Pseudomonas aeruginosa (vlevo). Vybrané fluoreskující kolonie jsou podrobeny testu s acetamidovým médiem (vpravo). Test v acetamidovém médiu: Do sterilní zkumavky se sterilně převede objem 5 ml acetamidového sterilního média (anebo jsou k dispozici již jednorázově naplněné a vysterilizované zkumavky s médiem). Médium se naočkuje presumptivní kolonií, která vykazovala fluorescenci a nebyla modrozeleně zabarvená. Zkumavka se inkubuje při teplotě 36 C ± 2 C po dobu 22 h ± 2 h. Po ukončení inkubace se přidají 1 až 2 kapky Nesslerova činidla a vyšetří se tvorba amoniaku, která se projeví cihlově červeným zbarvením média (v závislosti na koncentraci). Oxidázový test: Na filtrační papír umístěný v Petriho misce se kápnou 2 až 3 kapky oxidázového činidla (lze použít i cytochromoxidázový test). Pomocí bakteriologické kličky se přenese suspektní presumptivní kolonie na navlhčený filtr a vyčká se pozitivní reakce. Pozitivní reakce, sytě modré zabarvení, se projeví po 10 s. Kingovo médium B: Červenohnědě zbarvené kolonie, které jsou oxidázapozitivní se subkultivují na Kingovo médiu B při teplotě 36 C ± 2 C po dobu až 5 dnů, nicméně obvykle stačí 24 h. Potvrzení probíhá pod UV lampou, za pozitivní se považuje jakákoliv fluorescence (viz obr. 3). 5
Obr. 3. Konfirmace červenohnědých kolonií rostoucích na agarovém CN médiu (vlevo), které jsou oxidázapozitivní a po subkultivaci na Kingovo B médiu (vpravo) vykazují fluorescenci po UV lampou. Tabulka 1. Postup potvrzení kolonií rostoucích na Pseudomonas agar médiu/cn agaru Vzhled kolonie na CN agaru Modrozelené Vykazující fluorescenci, ale NE modrozelené Test v acetamidovém tekutém médiu (produkce amoniaku z acetamidu) Oxidázový test (produkce oxidázy) + Kingovo médium B (fluorescence) Výsledek: Potvrzeno jako Pseudomonas aeruginosa ANO ANO Červenohnědé + + + ANO Ostatní NE Vyhodnocení zkoušky: Všechny kolonie, které produkují pyocyanin, nebo které jsou oxidázapozitivní, vykazují fluorescenci pod UV zářením a jsou schopny produkovat amoniak z acetamidu, se spočítají jako potvrzené Pseudomonas aeruginosa. Počet kolonií se vyjadřuje u nezředěných vzorků na zpracovaný objem vzorku, tj. na 250 ml anebo 100 ml. U vzorků filtrovaných z menšího objemu a u zředěných vzorků se přepočítává na 250 ml anebo 100 ml. V nezředěném vzorku se udává celkový počet kolonií i v tom případě, že vyrostlo méně než 10 kolonií na misce. Výpočet počtu PSA potvrzených Pseudomonas aeruginosa identifikovaných z každé plotny se vypočte podle rovnice (1) a zaokrouhlí na celé číslo: 6
cf cr PSA P F R (1) nf nr kde P je počet modrozelených kolonií, které se považují již za potvrzené a hledané F je počet kolonií vykazujících fluorescenci R je počet červenohnědých kolonií n F je počet kolonií vykazujících fluorescenci, testovaných na produkci amoniaku c F je počet kolonií vykazujících fluorescenci, pozitivních na produkci amoniaku n R je počet červenohnědých kolonií, testovaných na produkci amoniaku a oxidázy a na fluorescenci na Kingově médiu B c R je počet červenohnědých kolonií, pozitivních na produkci amoniaku a oxidázy a na fluorescenci na Kingově médiu B Misky, na kterých vyrostlo v důsledku nesprávné volby ředění více než 100 kolonií, se označují jako nepočitatelné a nevyhodnocují se. Uvádění výsledků: Výsledky se uvádí jako počet KTJ na zpracovaný objem vzorek, např. 100 ml anebo 250 ml vzorku. V případě ředěného vzorku je nutné použité ředění ve výsledku zohlednit. Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN EN ISO 16266 Jakost vod Stanovení Pseudomonas aeruginosa Metoda membránových filtrů 7