WWW.DYNEX.CZ. diagnostiky LF a FN Hradec Králové



Podobné dokumenty
Plíšková L. Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF a FN Hradec Králové


VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Obecné vlastnosti. Borrelia, Treponema, Leptospira. Spirálovité bakterie Aktivně pohyblivé Pro člověka patogenní tři rody

Přínos metody ELISPOT v diagnostice lymeské boreliózy

DY D NE N X Hana Vlastníková

Lymeská borelióza. Bolehovská R. 1, Plíšek S. 2, Plíšková L. 1, Čermáková Z. 3, Palička V. 1. Úvod. Vzhled, genom a antigenní struktura borélií

DEN LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY

Co víme nového o borelióze a klíšťové meningoencefalitidě?

Srovnání citlivosti kvantitativní PCR repetitivních oblastí AF a B1 pro detekci Toxoplasma gondii

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse

Komplexní pohled na laboratorní diagnostiku Chlamydia pneumoniae

Příloha č.5 Seznam PCR vyšetření

Jana Bednářová. Oddělení klinické mikrobiologické FN Brno

PAROTITIDA VRACEJÍCÍ SE ONEMOCNĚNÍ. Vlasta Štěpánová 1, Miroslav Fajfr 1,2, Lenka Plíšková 3

Novinky VIDIA v di agnost ce Lymeské borreliózy

Metody testování humorální imunity

Molekulární diagnostika

Metody testování humorální imunity

Výskyt a význam infekce Borna disease virem u pacientů léčených

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

www-bml.ucdavis.edu BORELIÓZA Mgr. Marie Vilánková Joalis s.r.o. Všechna práva vyhrazena


Lymeská borrelióza. Štrosová L Šafránkův pavilon, Plzeň

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

prezentace OKMP 1

Nabídka služeb. Mikrobiologie a serologie. RNDr.Zdeněk Čecháček s.r.o. Člen klinických laboratoří IFCOR Spektrum nabízených služeb

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Diagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení

Seznam vyšetření INFEKČNÍ SÉROLOGIE KL ON Kladno, a.s.

Mikrobiologické vyšetření jako podklad pro racionální cílenou antibiotickou terapii. Význam správné indikace vyšetření a dodržování

Lymeská borrelióza epidemiologická data za rok 2014

Provádění, možnosti a interpretace mikrobiologických vyšetření

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

Syfilis přehledně. MUDr.Hana Zákoucká Odd. STI, NRL pro syfilis, Státní zdravotní ústav ROCHE

Zkušenosti s laboratorní diagnostikou infekcí virem Zika. Hana Zelená NRL pro arboviry Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě

Genetický screening predispozice k celiakii

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Chemotaktické cytokiny (chemokiny)

Odběr a transport biologického materiálu do mikrobiologické laboratoře. Jana Juránková OKM FN Brno

Progrese HIV infekce z pohledu laboratorní imunologie

Kortizol, ACTH. Olga Bálková Roche s.r.o., Diagnostics Division

Diagnostika a epidemiologie HIV. Vratislav Němeček, Marek Malý NRL pro HIV/AIDS, Státní zdravotní ústav, Praha

Využití molekulárně-biologických postupů a multimarkerových strategií v intenzívní péči. Marek Protuš

Využití molekulárně-biologických postupů a multimarkerových strategií v intenzívní péči. Marek Protuš

Akreditované zkoušky prováděné v Laboratořích CEM

Real time PCR detekce Borrelia burgdorferi Sensu Lato

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

Interpretace sérologických nálezů v diagnostice herpetických virů. K.Roubalová

QUO VADIS VAKCINOLOGIE? PRYMULA R. FAKULTNÍ NEMOCNICE HRADEC KRÁLOVÉ FVZ HRADEC KRÁLOVÉ

Laboratorní di agnostik HBV HCV a Vratislav Němeček Státní zdravotní stav ústav

Příloha je nedílnou součástí osvědčení o akreditaci č.: 744/2017 ze dne:

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche

Aktuální možnosti diagnostiky Lymeskéborreliózy a interpretace výsledků na Ústavu mikrobiologie FNOL a LF UP

laboratorní technologie

BlueDiver IMUNOBLOT SOUPRAVY K DIAGNOSTICE LYMESKÉ BORRELIÓZY INFEKČNÍ SÉROLOGIE NOVĚ V AUTOMATICKÉM SYSTÉMU PRO ZPRACOVÁNÍ A VYHODNOCENÍ IMUNOBLOTŮ

2) Vztah mezi člověkem a bakteriemi

Kortizol, ACTH. Roche s.r.o., Diagnostics Division

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

Vývoj biomarkerů. Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK

Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie

Laboratorní diagnostika příušnic v Nemocnici České Budějovice a.s.

Biochemická laboratoř

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

Přínos molekulární genetiky pro diagnostiku a terapii malignit GIT v posledních 10 letech

ÚVOD DO TRANSPLANTAČNÍ IMUNOLOGIE

Molekulárně biologické a cytogenetické metody

Borrelia burgdorferi sensu lato

Mimodřeňová expanze plazmocytů do CNS u mnohočetného myelomu

MASTABLOT BORRELIA. Western Blot pro detekci IgG / IgM protilátek proti Boreliím ze séra a plazmy. Návod na použití

Elektronová mikroskopie v p ím í é di diagnos tti ce a b kt kkter kt iá i l iál í n h c a virových infekcí

Lidský herpesvirus 6 biologie, diagnostika, patogeneze. K.Roubalová Vidia spol.s r.o.

Společnost pro transfuzní lékařství

Obsah LABORATOŘ MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKY

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Diagnostika lymeské borreliózy v NRL LB

Preanalytická fáze na rozhraní mezi klinickým

Lékařská mikrobiologie II

Virové hepatitidy. MUDr. Jana Bednářová, PhD. OKM FN Brno

Atypický průběh klíšťové encefalitidy. Bartková D., Petroušová L. Klinika infekčního lékařství FN Ostrava

Laboratorní diagnostika spalniček. A. Vinciková, E. Jílková Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem

synlab czech s.r.o. U Vojenské nemocnice 1200, Praha 6

RNDr K.Roubalová CSc.

KATALOG PRODUKTŮ 2015

Interpretace serologických výsledků. MUDr. Pavel Adamec Sang Lab klinická laboratoř, s.r.o.

α herpesviry Diagnostika, epidemiologie a klinický význam. kroubalova@vidia.cz

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

KORONAVIROVÉ INFEKCE PRASAT

Diabetes mellitus (DM)

Klinické projevy lymeské borreliózy, jejich diagnostika a léčba

Bonusové přednášky dle časových možností

IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAVY K DIAGNOSTICE INFEKCE HELICOBACTER PYLORI

Prokalcitonin ití v dg. septických stavů

HIV / AIDS MUDr. Miroslava Zavřelová Ústav preventivního lékařství LF MU

Antinukleární protilátky (ANA) Protilátky proti extrahovatelným nukleárním antigenům (ENA)

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200

α herpesviry Diagnostika, epidemiologie a klinický význam. RNDr K.Roubalová NRL pro herpetické viry

Transkript:

Možnosti a úskalí detekce DNA Borrelia burgdorferi sensu lato Bolehovská R., Plíšková L., Ústav klinické i ké biochemie i a diagnostiky LF a FN Hradec Králové

obtížná Diagnostika lymeské boreliózy klinický obraz velmi rozmanitý anamnestické údaje (přisátí klíštěte ~ 60 %) laboratorní l b í - nejednoznačnost laboratorních nálezů ů elektronová mikroskopie, průkaz Ab (ELISA), western blot, imunofluorescenční analýza, PCR, CSF - vyšetření leukocytů (pleocytóza, zejm. mononukleáry), celkové bílkoviny (, někdy gamaglobuliny) někdy norm. nález

Molekulárně biologické metody (PCR) výhody rychlost, citlivost, specifita, možnost vyšetření v jakémkoliv materiálu úskalí preanalytická fáze výběr pacientů, materiálů a jejich načasování, podmínky transportu apod. příprava vzorků, izolace (optimalizace), uchování DNA výběr primerů, optimalizace a validace metody kontrola kvality (VKK, EHK)

Preanalytická fáze výběr pacientů dif. dg. akutní LB - genom. DNA ve vyšších konc. chronická LB stopová množství genom. DNA (doplnit o detekci plazmidové DNA) záchytnost y??? výběr materiálů, načasování odběru materiály krev, likvor, moč, č synoviální tekutina, tkáň, vzorky kůže z EM apod. X klíště volba materiálu dle příznaků, stádia a doby onem. transport v chladu (nemrazit!!!) vysoká teplota snižuje procento pozitivity, hemolytické materiály inhibicí

Materiály krev k nízká senzitivita boreliémie pouze krátkodobá, přechodná, pouze v období diseminovaného onem. (EM, neuroborelióza, karditidy) plazma (10) X sérum (20) X plná krev (100 spirochet/ml) - Mouritsen et al., Am.J.Clin.Pathol., 1996 CSF neuroborelióza nepřímá závislost na délce trvání onem. do 2 týdnů PCR pozit. u 50 % X více než 2 týdny pouze u 13 % - Lebech et al., Mol. Diagn., 2000 možnost adheze ke tkáním nízká senzitivita v pozdních stádiích, význam PCR pouze v časných ý h stádiích

močč WWW.DYNEX.CZ Materiály nižší senzitivita, nereprodukovatelnost neodebírat 1. proud ranní moče centrifugace při 36 000 g (při 14 000 g všechny moče negat.) Bergmann et al., J. Clin. Microbiol., 2002 synoviální tekutina artritida vyšší procento pozitivit závislost na antibiotické terapii po léčbě negat. PCR v synoviální tekutině, ale možnost detekce BB v synoviální membráně Priem et al., Ann. Rheum. Dis., 1998

Materiály kůže kožní manifestace vysoká senzitivita léze EM - 36 až 88 % pac. s chron. atrofickou akrodermatitidou 54 až 100 % uchování v transportním, kultivačním médiu po 24 hod. migrace spirochét do média izolace DNA z kůže, ale i z média klíště výpovědní hodnota??? pozitivní nález nemusí znamenat nákazu (doba přisátí klíštěte odstranění do 24 hod. riziko rozvoje LB velmi nízké) význam pro epidemiologické a jiné vědecké studie

Izolace co nejdříve (zamrazit max. 3 měsíce) porovnání 3 izolací Exner et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2003 fenol-chloroformová extrakce, QIAamp DNA kity (OIAGEN), automatická izolace na přístroji MagNA Pure (mg. partikule) stejná citlivost u vzorků krve, CSF, synov. tekutiny X moč horší citlivost u QIAamp DNA kitu ÚKBD porovnání 2 izolací QIAamp DNA Mini Kit (TQ), MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III srovnatelná citlivost CSF, plazma, moč, synoviální tekutina atd. centrifugace max. otáčky sediment uchování DNA 2 až 8 C ( teplota - citlivost)

Výběr primerů neobvyklý genom BB lineární chromozom + různý počet lineárních a cirkulárních plazmidů (BB je mohou ztrácet ) škála Ag specifit výběr primerů (schopnost detekce DNA BB) funkce proteinů (NC_001318) G - transport a metabolizmus sacharidů J - translace, ribosomální struktura a biogeneze L - DNA replikace, rekombinace a oprava M biogeneze buněčného obalu, vnější membrány O - posttranslační modifikace, proteinové přeměny, chaperony R hlavní funkce je pouze předpokládána U neznámá funkce

- Borrelia burgdorferi B31 NC_001318, lineární dsdna, délka 910 724 bp, 874 genů, 21 plazmidů (9 lineárních a 12 cirkulárních) 93 % kódujících sekvencí, GC obsah 28 %, 23 strukturálních RNA - Borrelia afzelii PKo NC_008277, lineární dsdna, délka 905 394 bp, 894 genů, 8 plazmidů (6 lineárních a 2 cirkulárních) - Borrelia garinii Pbi NC_006156, lineární dsdna, délka 904 246 bp, 904 genů, 2 plazmidy (1 lineární a 1 cirkulární)

Výběr primerů 1. PCR 1989 (chromozomální gen) publikováno o mnoho sekvencí primerů rů z různých genů - chromozomální m oblast 5S/23S rrna, reca, flagellin - plazmidová oblast OspC, OspA komerční kity nejčastěji flagelin. gen (FlaB) př. QIAGEN, GeneProof, Dynex

flagellin WWW.DYNEX.CZ flagellin bičík BB se skládá ze 2 podjednotek FlaA (37 kda) a majoritního FlaB = flagellar filament 41 kda core protein, velikost genu 1011, proteinu 336 AMK, imunogenní protein, chemotaxe a motilita (v závislosti na teplotě) OspC (reduktin) outer surface protein C, 21 až 25 kda, umístěn na cirkulárním plazmidu cp26, dominantní povrchový Ag (velikost genu 633, proteinu 210 AMK), 21 různých typů, aktivace v závislosti na teplotě, průnik BB do slin. žláz, slin OspA (adhezin) - 31 kda, lieární plazmid lp54, povrchový Ag (gen 822, protein 273 AMK), fce vazba na střevo, shlukování BB další proteiny vnější membrány (OspB 34 kda, OspD 28 kda, OspE 19 kda a OspF 26 kda) VlsE variable major like sequence E, umístěn na cirkulárním plazmidu lp28-1, povrchový Ag, BB neustále mění povrchově exprimovaný VlsE snaha uniknout rozpoznání a eliminaci imunitním systémem

Klíště hypostom průnik do kůže, vylučování slin tvorba cementové zátky, látky potlačující lokální imunitu, tišící bolest, bránící í srážení krve (ixodin) apod. navíc buňky hostitele produkují histamin, ale ve slinách klíště bílkovin. látku, která ho vyváže ranka nebolí, nesvědí střevo klíštěte - ukotvení BB v epitelu střev pomocí OspA sání krve teploty a ph exprese OspA (odpoutání BB od epitelu střeva) exprese OspC (průnik spirochét do slinných žláz přibližně po 24 hod.) krev v těle klíšťat zahuštěna a sliny, přebytečná voda spolu s BB zpět do hostitele IO klíčové postavení subsetů TH lymfocytů - aktivace TH2 T-lymfo časná a dostatečná produkce specif. Ab a eliminace BB - aktivace TH1 T-lymfo odpovědná za buňkami zprostředkovanou cytotoxickou reaktivitu, nevede k eliminaci BB, možnost perzistence (hypotéza plazmidy)

Validace metody detekce DNA BB a IC v jedné zkumavce (multiplex realtime PCR) IC HLA-DQ gen srovnatelná ná s publik. závěry 0,39 pg/ml

Porovnání různých metod DYNEX

Kontrola kvality - VKK pozitivní, í negativní a inhibiční hbč kontrola nutnost real-time PCR možnost sledování rozmezí SD a 1 řádu standardizace metody

EX YN.D W W W Z.C

kontrola 25 org./ml Kontrola kvality - VKK kontrola 10 org./ml

EHK - INSTAND e. V. Kontrola kvality mezilaboratorní porovnání (reprodukovatelnost) r. 2008 97 laboratoří ověření metody (validace) komutabilita EHK vzorků????

Soubor pacientů 2007 CSF x krev 1 : 1 2008 CSF x krev 7 : 3 za 15 měsíců vyšetřeno 1822 materiálů - 1151 likvorů (63,2 %), 609 krví (33,4 %) a 62 jiných materiálů (3,4 %) - punktát kolene, moč, vzorek kůže, cysta 17 vzorků pozitivních (0,9 %) - 14 likvorů, 1 krev a 2 kolenní punktáty u 4 vzorků přítomnost inhibitorů DNA polymerázy (0,2 %)

Závěr PCR není v dg. LB 100% negativní výsledky nevylučují onemocnění X pozitivní výsledky onemocnění potvrzují nutnost výběru pacientů, resp. načasování odběru, výběr biologického materiálu, dodržení preanalytické fáze v laboratoři udělat maximum (validní výsledky) klinická korelace PCR je neuspokojivá

Děkuji za pozornost