Praktická cvičení z biologie Letní semestr

Univerzita Palackého v Olomouci Ústav biologie, Lékařská fakulta Praktická cvičení z biologie Letní semestr Olomouc 2014

Podpořeno projektem EU: Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0088 kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc 2 v20150212

Obsah 1. Vrozené chromozomové aberace... 7 1.1 Doplňte schéma normální meiozy... 9 1.2 Doplňte schéma meiotické nondisjunkce... 10 1.3 Rýhovací dělení zygoty a blastomer... 13 1.4 Mitotická nondisjunkce... 13 1.5 Doplňte schémata ukazující mitotickou nondisjunkci chromozomů... 14 1.6 Doplňte schéma normální meiozy a následné fertilizace... 15 1.7 Robertsonova translokace... 16 1.8 Vyvážená translokace chromozomů 14 a 21... 17 2. Mutace u lidských chorob... 18 2.1 Genové mutace... 18 2.2 Numerické a strukturní aberace chromozomů... 19 2.3 Patologické karyotypy u vrozených vývojových vad... 21 2.4 Patologický karyotyp u nádorových onemocnění... 24 2.5 Lidské metafázní chromozomy: trvalé preparáty... 24 2.6 Příprava cytogenetického preparátu pro zjištění ploidie buněk... 24 3. Mendelovská dědičnost... 26 3.1 Dědičnost barvy očí... 28 3.2 Dědičnost monogenně založeného onemocnění... 28 3.3 Cherubinismus... 29 3.4 Anodoncie (chybění zubů)... 29 3.5 Torus palatinus... 29 3.6 Fenylketonurie... 29 3.7 Dědičnost srpkovité anémie... 29 3.8 Beta talasemie... 29 3.9 Dědičnost barvy očí a levorukosti u člověka... 29 3.10 Dědičnost krevně skupinového systému AB0... 30 3.11 Dědičnost Rh faktoru... 30 3.12 Příklady snadno zjistitelných znaků u člověka s jednoduchou mendelovskou dědičností... 31 4. Gonozomální dědičnost a rodokmeny... 33 Dědičnost znaku vázaného na pohlaví... 34 4.1 Dědičnost hemofilie... 34 4.2 Dědičnost daltonismu... 34 4.3 Dědičnost deficitu G6PD... 34 4.4 Fosfátový diabetes... 35 Rozbor rodokmenů genealogická metoda... 36 4.5 Rozbor rodokmenů... 38 3 v20150212

4.6 Sestavte rodokmen podle rodinné anamnézy... 40 5. Vazba genů a mapování chromozomů... 41 I. Genová vazba při zpětném křížení... 46 5.1 Testovací křížení... 46 5.2 Testovací křížení... 46 5.3 Vazba genů u drozofily... 46 II. Genová vazba u člověka... 47 5.4 Zjišťování genové vazby v rodině... 47 5.5 Rh faktor a eliptocytóza... 48 5.6 Daltonismus a hemofilie A... 48 5.7 Asociace znaků... 48 III. Lokalizace lidských genů pomocí somatické hybridizace... 49 5.8 Lokalizace genů kódujících enzymy... 49 5.9 Lokalizace HLA a P lokusů... 49 5.10 Vybrané lokusy lidského genomu... 49 6. Nemendelovská dědičnost... 51 I. Interakce nealelních genů... 51 I. A) Epistáze... 51 6.1 Recesivní epistáze u člověka: Bombay fenotyp u krevních skupin... 51 I. B) Geny duplicitní... 52 6.2 Duplicitní geny: dědičnost barvy pokožky u člověka... 52 II. Multifaktoriální dědičnost... 53 II. A) Kvantitativní znaky... 53 II. B) Diskrétní neboli kvalitativní znaky / nemoci... 53 Heritabilita a genetické studium dvojčat... 54 6.3 Vrozená luxace kyčelního kloubu... 55 6.4 Hypertenzní nemoc... 55 6.5 Schizofrenie... 55 6.6 Prořezávání zubů... 55 6.7 Osm nemocí... 56 III. Mitochondriální dědičnost... 57 6.8 Nakreslete rodokmen... 57 7. Genová kontrola metabolismu... 58 7.1 Metabolizmus fenylalaninu... 59 7.2 Trávení laktózy... 60 7.3 Deficit glukóza-6-fosfátdehydrogenázy... 60 7.4 Familiární hypercholesterolemie (FH)... 61 7.5 Diabetes mellitus... 61 8. Genetika populací... 63 4 v20150212

I. Běžné sňatky... 65 I. A) Autozomální geny v populaci... 65 8.1 Dědičnost barvy očí... 65 8.2 Dědičnost Rh-faktoru... 65 8.3 Cystická fibróza (CF) mukoviscidóza... 65 8.4 Fenylketonurie (PKU)... 65 8.5 Další autozomálně recesivní choroby... 65 8.6 Srpkovitá anemie... 66 8.7 Dens caninus... 66 8.8 Izolovaný rozštěp patra palatoschisis... 66 8.9 Trema... 66 I. B) X-vázané geny v populaci... 66 8.10 Daltonismus... 66 8.11 Hemofilie... 66 8.12 Deficit glukóza-6-fosfát-dehydrogenázy (G6PD)... 66 II. Inbríding, příbuzenské sňatky, koeficient inbrídingu... 67 II. A) Koeficient inbrídingu (F)... 68 II. B) Koeficient příbuznosti (R xy )... 69 8.13 Vypočítejte koeficient inbrídingu... 69 8.14 Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění... 69 9. Genetická prognostika... 71 9.1 Albinismus... 74 9.2 Cystická fibróza (CF, mukoviscidóza)... 74 9.3 Myopatie... 74 9.4 Fenylketonurie... 74 9.5 Choroba podmíněná XD... 75 9.6 Hemofilie... 75 9.7 Hluchota... 75 9.8 Marfanův syndrom (arachnodaktylie)... 75 9.9 Hemolytická sférocytární anémie... 75 9.10 Hemofilie... 75 9.11 Barvoslepost (daltonismus)... 75 9.12 Katarakta... 76 9.13 Porucha zubní skloviny... 76 9.14 Inbríding a autozomálně recesivně dědičné onemocnění... 76 9.15 Downův syndrom... 76 10. Genová kontrola imunity... 77 I. Charakteristika polymorfismu HLA systému... 78 10.1 Stanovení teoretického počtu haplotypů... 79 5 v20150212

10.2 Stanovení teoretického počtu genotypů... 79 II. Rozbor segregace HLA alel v rodinách... 80 10.3 Určení genotypu... 81 10.4 Genotypy v rodinách... 81 10.5 Paternitní spor... 81 III. Výběr dárce pro transplantace... 82 10.6 Fenotypy kompatibilních dárců... 82 10.7 Vhodnost dárcovství... 82 IV. HLA asociace... 83 10.8 Relativní riziko vzniku choroby... 83 V. Studium HLA genetické struktury populace... 84 10.9 Určení četnosti genotypu z haplotypových četností... 84 10.10 Určení četnosti fenotypu z haplotypových četností... 84 11. Molekulární genetika I... 87 11.1 DNA diagnostika... 91 11.2 Sekvenování DNA... 91 11.3 PCR reakce... 91 11.4 Restrikční analýza... 91 11.5 Analýza přítomnosti mutace IVS-1-I (G A) ß-globinového genu... 91 11.6 Analýza přítomnosti mutace V617F genu JAK2... 92 11.7 PCR detekce mutace u dědičného onemocnění... 92 11.8 Analýza přítomnosti fúzního genu... 92 11.9 Paternitní spor... 93 11.10 Doplňte tabulku... 93 12. Molekulární genetika II: Proteiny, aplikace v medicíně... 94 I. Využití detekce proteinů v diagnostice... 94 II. Využití proteinů v terapii... 95 6 v20150212

1. Vrozené chromozomové aberace Studijní příprava Mitóza, meioza, chromozomy. Teoretický úvod Eukaryontní chromozomy jsou strukturní jednotky genetické informace, tvořené dvouvláknovou DNA a asociovanými proteiny. Ve světelném mikroskopu jsou viditelné pouze v průběhu dělení buňky (mitózy a meiozy), kdy musí být zajištěno rovnoměrné rozdělení genetické informace do buněk dceřiných. Většina buněk v lidském organizmu je diploidních (2n) a obsahuje 46 chromozomů. Každý chromozom se v těchto buňkách vyskytuje dvakrát, vytváří se tzv. pár homologních chromozomů (např. dva chromozomy 15). Říkáme, že buňka obsahuje 2 sady chromozomů.výjimku tvoří chromozomy X a Y v somatických buňkách mužského těla tyto jsou zde přítomny pouze v jediné kopii. Chromozomy odlišných párů nazýváme nehomologní (např. chromozom 2 a 17). Somatické buňky, které jsou diploidní, se dělí mitózou. Výsledkem meiozy, čili redukčního dělení, jsou pohlavní buňky neboli gamety, které jsou haploidní (n). Gamety obsahují pouze 1 sadu chromozomů (tj. 23 chromozomů). V průběhu 1. meiotického dělení dochází k segregaci párů homologních chromozomů, vytvořené gamety pak obsahují z každého páru homologních chromozomů pouze jeden. Chromozomové abnormality mohou být buď strukturní nebo numerické. Strukturní chromozomové aberace mění tvar a strukturu chromozomů a budou předmětem příštího praktika. Numerické chromozomové aberace označované také jako genomové mutace mění počet chromozomů v buňce. V některých případech dochází v důsledku strukturní aberace chromozomu i k aberaci numerické, to znamená, že se mění počet chromozomů v buňce (příklad Robertsonova translokace centrická fúze viz. 1.7). Terminologie: euploidie... přesný násobek sady chromozomů (n, 2n, 3n, 4n,...) diploidní 2n (2 sady chromozomů; somatické buňky) haploidní n (1 sada chromozomů; gamety) Numerické aberace polyploidie buňky obsahují více sad chromozomů (triploidie 3n, tetraploidie 4n, atd.) aneuploidie změna počtu jednotlivých chromozomů monozomie ztráta chromozomu 2n-1 (45) trizomie přítomnost nadbytečného chromozomu 2n+1 (47) Chromozomové abnormality vznikají nejčastěji v průběhu života jedince v buňkách somatických a jsou příčinou vzniku nádorových onemocnění. Předmětem dnešního praktika budou vrozené chromozomové aberace, které vznikají v průběhu tvorby gamet nebo v průběhu rýhovacích dělení zygoty a jsou příčinou vzniku vrozených vývojových vad. Nejčastější příčinou aneuploidií je meiotická nondisjunkce, kdy dochází k poruše oddělení páru chromozomů během jednoho ze dvou meiotických dělení, většinou v průběhu prvního z nich (Obr. 1). Většina aneuploidií je letálních, trizomie jsou častější než monozomie. Postnatálně slučitelné se životem jsou pouze tři nemozaikové trizomie autozomů a trizomie pohlavních chromozomů: 7 v20150212

Trizomie autozomů: trizomie 21 Downův syndrom trizomie 18 Edwardsův syndrom trizomie 13 Pataův syndrom 47,XX,+21 nebo 47,XY,+21 47,XX,+18 nebo 47,XY,+18 47,XX,+13 nebo 47,XY,+13 Trizomie pohlavních chromozomů: 47,XXX 47,XXY Klinefelterův syndrom 47,XYY syndrom dvou chromozomů Y Jediná monozomie celého chromozomu slučitelná se životem je monozomie pohlavního chromozomu X: 45,X Turnerův syndrom Tyto odchylky se vyskytují alespoň u 3-4% všech klinicky rozpoznatelných těhotenství a jsou spojeny s vážnými poruchami fyzického nebo mentálního vývoje. Výjimkou je syndrom dvou chromozomů Y (47,XYY), která ve většině případů není asociována s vážnými poruchami ani mentální retardací. Nondisjunkce se může objevit také při mitotickém dělení po vzniku zygoty. Jestliže k ní dojde v časné fázi rýhovacího dělení (od 2-buněčného stadia zygoty), je výsledkem klinicky významný mozaicismus, to je situace, kdy jsou v těle jedince přítomné různé buněčné populace lišící se počtem chromozomů (viz. 1.4; 1.5). Obr. 1. Pro zjednodušení je znázorněn jen 1 pár homologních chromozomů. A) ND v 1. meiotickém dělení B) ND ve 2. meiotickém dělení fáze pár homologních chromozomů S-fáze pár homologních chromozomů porucha separace páru homol. chromozomů porucha separace sesterských chromatid všechny gamety jsou abnormální 1 z páru homol. chromozomů výsledkem je trizomie nebo monozomie 1 / 2 gamet je normálních 8 v20150212

1.1 Doplňte schéma normální meiozy Zakreslete segregaci chromozomů a chromatid v průběhu spermatogeneze, doplňte jejich počty. pár homologních chromozomů (např. 21) S-fáze 1. meiotické dělení 2. meiotické dělení Kolik chromozomů má vajíčko? Kolik chromozomů má zygota? 9 v20150212

1.2 Doplňte schéma meiotické nondisjunkce Na schématech jsou příklady aberantní gametogeneze, kde v určitém stadiu došlo k nondisjunkci (ND) chromozomů A) Ch. 21, B) Ch. Y. Doplňte počty chromozomů, počty chromozomů spermií resp. vajíček a zygot vzniklých oplozením. Uveďte název syndromu, k jehož vzniku může dojít po splynutí takto vzniklé abnormální gamety s normální gametou. A) ND chromozomu 21 ve druhém meiotickém dělení při oogenezi pár homologních chromozomů (např. 21) S-fáze 1. meiotické dělení ND 2. meiotické dělení potenciální oocyty + + + + spermie potenciální zygoty 10 v20150212

B) ND chromozomů X v prvním meiotickém dělení při oogenezi chromozomy X S-fáze ND 1. meiotické dělení 2. meiotické dělení potenciální oocyty + + + + normální spermie potenciální zygoty 11 v20150212

C) ND chromozomu Y ve 2. meiotickém dělení při spermatogenezi chromozomy X + Y S-fáze 1. meiotické dělení ND 2. meiotické dělení + spermiogeneze spermie + + + + oocyty potenciální zygoty Spermatogeneze: proces vývoje spermií ze spermatogonií; zahrnuje mitotické dělení spermatogonií, meiozu a následnou přeměnu spermatid na spermie. Spermiogeneze: haploidní část spermatogeneze (přeměna spermatid na spermie). Dochází k přestavbě a kondenzaci jádra, vzniká akrozom a bičík, je redukován objem cytoplazmy. 12 v20150212

1.3 Rýhovací dělení zygoty a blastomer Předpokládejme normální rýhovací dělení zygoty doplňte počty chromozomů v jednotlivých buňkách. zygota 1. rýhovací dělení 2. rýhovací dělení 1.4 Mitotická nondisjunkce Mitotická nondisjunkce je poruchou separace sesterských chromatid jednoho z páru homologních chromozomů. Jeden chromozom se rozdělí normálně sesterské chromatidy se v anafázi oddělí a putují k opačným pólům a tedy do 2 dceřiných buněk. U druhého chromozomu vstupují obě chromatidy do jedné dceřiné buňky. Výsledkem jsou pak 2 dceřiné buňky s odlišným počtem chromozomů (jedna má 47 a druhá 45 chromozomů), který se liší i od normálního počtu chromozomů v buňce mateřské (46). 46 pár homologních chromozomů (např. 21) S-fáze 47 ND během mitózy 45 V důsledku mitotické nondisjunkce, která postihne jednotlivou buňku několikabuněčného embrya, vznikají tzv. mozaikovité typy vrozených vývojových vad, např. Downova syndromu. Důležité je, že jen část buněk v těle má trizomii 21, ostatní jsou euploidní (viz 1.5A). Postižený jedinec má mírnější klinické projevy ve srovnání s nemozaikovým typem, kdy všechny buňky v těle mají trizomii 21. 13 v20150212

1.5 Doplňte schémata ukazující mitotickou nondisjunkci chromozomů Na schématech je zachyceno rýhování oplozeného vajíčka, kdy v některém z rýhovacích dělení došlo k nondisjunkci (ND) A) Ch. 21 a B) Ch. X. Doplňte chromozomovou výbavu blastomer. A) Nondisjunkce chromozomu 21 ve druhém rýhovacím dělení zygota 46 1. rýhovací dělení ND 2. rýhovací dělení B) Nondisjunkce chromozomu X ve třetím rýhovacím dělení zygota 46 1. rýhovací dělení 2. rýhovací dělení ND 3. rýhovací dělení 1. Jaký je důsledek mitotické nondisjunkce? 2. Který syndrom způsobí mitotická nondisjunkce v příkladu A) a B)? 3. Jaký lze očekávat výsledek vyšetření X-chromatinu u těchto jedinců? 14 v20150212

1.6 Doplňte schéma normální meiozy a následné fertilizace Do prázdných kroužků zakreslete chromozomy, do čtverců doplňte počet chromozomů. chr. 13 chr. 21 S-fáze 1. meiotické dělení 2. meiotické dělení + spermiogeneze normální spermie + + + + oocyty potenciální zygoty 15 v20150212

1.7 Robertsonova translokace Robertsonova translokace, neboli centrická fúze, je příkladem strukturní aberace chromozomů, která zároveň vede i k aberaci numerické. Dlouhá raménka 2 akrocentrických chromozomů se spojí a vytvoří jeden chromozom. Dochází tedy k redukci počtu chromozomů na 45. Nosič Robertsonovy translokace je fenotypově normální. Problémy nastávají v průběhu meiozy ovlivněná je segregace chromozomů a následně mohou vznikat i gamety s abnormálním počtem chromozomů (22) nebo nebalancované gamety obsahující jeden normální chromozom (21 nebo 13) a jeden translokovaný chromozom 13;21. Po oplození těchto gamet pak vznikají abnormální zygoty (monozomické nebo s translokační trizomií). Nebezpečí Robertsonovy translokace tedy spočívá v možném postižení potomků rodičů, kteří jsou nositeli této fúze. chr. 13 45 chr. 21 S-fáze translokovaný chr. 13;21 3 možnosti segregace chromozomů v průběhu 1. meiotického dělení A) B) C) 2. meiotické dělení 2. meiotické dělení 2. meiotické dělení + + + + + + 16 v20150212

1.8 Vyvážená translokace chromozomů 14 a 21 Jeden z rodičů je nositelem vyvážené translokace dlouhých ramének chromozomu 21 na dlouhá raménka jednoho z chromozomů 14. Uveďte jakým způsobem budou segregovat chromozomy do gamet. Doplňte možné typy gamet a zygot, které vzniknou po splynutí těchto gamet s normálními partnerskými gametami. Do prázdných kroužků zakreslete chromozomy, do čtverců doplňte počet chromozomů. Jaké je riziko postižení dítěte? chr. 14 chr. 21 translokovaný chr. 14;21 S-fáze 3 možnosti segregace chromozomů v průběhu 1. meiotického dělení A) B) C) 2. meiotické dělení 2. meiotické dělení 2. meiotické dělení + normální spermie potenciální zygoty Kontrolní otázky: 1. Které trizomie celého chromozomu jsou slučitelné se životem? Která monozomie celého chromozomu není letální? Uveďte názvy zmíněných syndromů. 2. Co je výsledkem nondisjunkce chromozomů při mitotickém dělení? 3. Kolik chromozomů má nositel Robertsonovy translokace a uveďte, jaké má klinické příznaky? 4. Uveďte typy Downova syndromu, podle mechanizmu vzniku trizomie. 17 v20150212

2. Mutace u lidských chorob Studijní příprava Mutageneze, transkripce, translace, genetický kód, karyotyp. Teoretický úvod Mutace jsou změny genetické informace (DNA), které mohou vést ke vzniku genetických patologických stavů. Rozdělení mutací A) podle kauzální příčiny spontánní (bez známé exogenní příčiny) indukované (působením fyzik., chem. nebo biol. mutagenů) B) podle charakteru genové mutace strukturní aberace chromozomů genomové mutace (numerické aberace chromozomů) C) podle druhu buněk, ve kterých mutace nastává: gametické: při vzniku gamet, přenáší se na potomstvo a jsou pak přítomny v každé buňce narozeného potomka somatické: v některé somatické buňce organizmu, mutace se přenáší pouze na její dceřiné buňky (např. vznik nádoru), mutace se nepřenášejí na potomstvo postiženého 2.1 Genové mutace Genové mutace postihují jeden nebo více nukleotidů jednoho genu a neprojeví se proto v morfologii chromozomu. K jejich odhalení slouží techniky molekulární biologie, o kterých uslyšíte na konci letního semestru. Genové mutace dělíme na: bodové mutace delece inzerce Bodové mutace Tyto mutace postihují jediný nukleotid v rámci sekvence DNA dochází k záměně jediného nukleotidu za jiný. Podle toho, jestli dochází/nedochází k ovlivnění aminokyselinového složení proteinu, hovoříme buď o tiché mutaci (vzniká triplet, který kóduje stejnou AMK); nebo o mutaci, která mění smysl missense mutace (vzniká triplet, který kóduje jinou AMK) anebo o tzv. stop mutaci nonsense mutace, která vede ke zkrácení proteinu (vzniká triplet, který kóduje STOP kodon). A) tichá mutace nedochází ke změně AMK v sekvenci proteinu Např. kodon TCT kóduje AMK serin. Serin je ale kódován i kodony TCA, TCG a TCC. Záměna třetího nukleotidu kodonu TCT v sekvenci DNA za jakýkoli jiný nukleotid proto neovlivní sekvenci aminokyselin v proteinu. 18 v20150212

B) missense mutace dochází k změně AMK v sekvenci proteinu Záměna nukleotidu vede ke tvorbě kodonu, který kóduje jinou AMK. Vytváří se tedy protein s jiným AMK složením. Příklad: Srpkovitá anémie. Záměna A za T (17. nukleotid) v beta globinovém genu vede k záměně šesté AMK: kys. glutamová je zaměněna za valin (triplet GAG kódující kys. glutamovou se mění na triplet GTG kódující valin). Vytváří se tak abnormální hemoglobin se změněnými vlastnostmi, který je zodpovědný za vznik tohoto onemocnění. C) nonsense mutace dochází ke zkrácení proteinu Záměna nukleotidu vede ke tvorbě STOP kodonu (TAA, TAG, TGA). Dochází tedy k předčasnému ukončení syntézy proteinu. Příklad: Cystická fibróza. Jednou ze známých mutací způsobujících cystickou fibrózu je záměna nukleotidu č. 1609 v genu CFTR (T je zaměněn za C). Místo původního kodonu pro glutamin (CAG) tak vzniká STOP kodon (TAG). Výsledkem je nefunkční protein, který má místo 1480 AMK pouze prvních 493 AMK. Delece a inzerce Tyto mutace představují ztrátu resp. přidání jednoho nebo několika nukleotidů do DNA sekvence genu. V důsledku toho může dojít k posunu čtecího rámce při vytváření proteinu a označujeme je pak jako tzv. frameshift mutace (mutace způsobující posun čtecího rámce). 2.2 Numerické a strukturní aberace chromozomů Numerické a strukturní aberace chromozomů postihují celé chromozomy resp. jejich větší části a tedy nejčastěji i více genů současně. Jsou velmi časté u vrozených vývojových defektů a maligních onemocnění. Aberace mohou být vizualizované pomocí různých cytogenetických technik, které umožní vyhodnocení karyotypu. Karyotyp je organizované zobrazení metafázních chromozomů, specifické pro daný druh. Poskytuje informace o počtu a morfologii chromozomů, konstituci pohlavních chromozomů a případně o chromozomových abnormalitách. Lidský karyotyp somatických buněk je složen z 22 párů autozomů a 1 páru gonozomů. Zápis karyotypu se řídí mezinárodně platnými pravidly (ISCN). Jako první se udává počet chromozomů, za ním se uvádí konstituce pohlavních chromozomů: 46,XX nebo 46,XY. U patologických karyotypů pak následuje zápis chromozomové abnormality, a to zkratka aberace a číslo chromozomu, který je aberací postižený: 47,XX,+21 (zápis Downova syndromu, trizomie chromozomu 21). 19 v20150212

Numerické aberace polyploidie aneuploidie: o monozomie o trizomie o hyperdiploidie nespecificky zvýšený počet chromozomů (neřadí se sem specifické trisomie jako např. Downůw syndrom, Klinefelterův syndrom a další) Strukturní aberace Mění tvar a strukturu chromozomů. Předpokladem jejich vzniku je alespoň jeden zlom. Mezi chromozomové aberace patří: delece, duplikace, inzerce, inverze, ring chromozom (kruhový chromozom), translokace. Zkratky používané pro zápis strukturních aberací: Typ delece duplikace inzerce inverze ring (kruhový chromozom) translokace Zkratka podle ISCN del dup ins inv r t Chromozomové aberace u nádorů Diagnostika nádorů, především leukémií, je z velké části založena na analýze karyotypu. Pro jednotlivé typy hematologických malignit je totiž charakteristická přítomnost specifických chromozomových odchylek, především translokací. Prokázání přítomnosti specifické translokace v leukemických buňkách je důležité pro správné určení diagnózy a prognózy onemocnění a mnohdy i pro adekvátní volbu terapie. Kromě translokací se u hematologických malignit často vyskytují i výrazné hyperdiploidie (někdy i >70 chromozomů). 20 v20150212

2.3 Patologické karyotypy u vrozených vývojových vad U následujících 4 příkladů patologických karyotypů, které byly připraveny konvenční cytogenetickou metodou, proveďte jejich zápis. Uveďte, o jaký typ odchylky se jedná, postihuje-li autozomy nebo gonozomy a jaký syndrom způsobuje. Důležité je, abyste si uvědomili, že se tyto chromozomové odchylky nachází ve všech buňkách organizmu. I. Probandkou je 18ti letá dívka malého vzrůstu, infantilního vzhledu. 21 v20150212

II. Probandem je malý chlapec s mentálním postižením a typickou fyziognomií, nejmladší ze šesti sourozenců. Jeho matka měla v době porodu 41 let. III. Probandkou je žena bez klinických příznaků, jejíž dcera je postižena Downovým syndromem. Předchozí těhotenství ženy skončilo spontánním potratem. 22 v20150212

IV. Probandem je tříletý chlapec s opožděným duševním a motorickým vývojem, se svalovou hypotonií a řadou výrazných vrozených odchylek. 23 v20150212

2.4 Patologický karyotyp u nádorových onemocnění Na obrázku je znázorněn karyotyp krevních buněk pacienta s nádorovým onemocněním krve chronickou myeloidní leukémií. Šipky označují chromozomy 9 a 22, mezi kterými došlo k reciproké translokaci. Důležité je, abyste si uvědomili, že tato chromozomová odchylka se nachází pouze v postižených buňkách krve. Tuto chromozomovou abnormalitu nenajdeme v žádné jiné buňce organizmu. Na přípravu tohoto karyotypu byla použita jiná cytogenetická technika (tzv. proužkování) než u předchozích případů. zápis: 46,XX,t(9;22) 2.5 Lidské metafázní chromozomy: trvalé preparáty Materiál: Trvalé preparáty lidských buněk. Lidské buňky byly vystaveny působení kolchicinu, který zastavil buněčné dělení v metafázi. Vaším úkolem bude najít buňky zastavené v metafázi a určit počet chromozomů. 2.6 Příprava cytogenetického preparátu pro zjištění ploidie buněk Princip metody Dělící se buňky se po dobu tří hodin vystaví působení kolchicinu, který zastaví buněčné dělení v metafázi. Posléze se buňky zpracují, nakápnou na podložní sklíčko a obarví. V metafázních buňkách se mikroskopicky zjišťuje počet chromozomů. K dispozici budete mít buněčnou suspenzi (buňky zastavené v metafázi) ve fixačním roztoku Carnoy (1 díl ledové kyseliny octové a 3 díly metanolu). Postup přípravy preparátu: Buněčnou suspenzi promícháme. Podložní sklo (umyté v 96% alkoholu) navlhčíme namražením na ledě. Navlhčení skla umožní pomalejší zaschnutí chromozomů na sklíčku, které je nutné pro oddálení jednotlivých chromozomů v metafázi od sebe (tj. chromozomy nejsou nahloučeny do jednoho místa). Na takto navlhčené podložní sklo kápneme suspenzi z výšky asi 50 cm a zafixujeme ji na plotýnce vyhřáté na 80 C (méně než minutu, do odpaření fixačního roztoku). 24 v20150212

Suché sklo barvíme roztokem Giemsa ve fosfátovém pufru (1 díl barvy a 9 dílů pufru). Barvíme 5 minut a poté sklo opláchneme v destilované vodě a necháme okapat a uschnout. Prohlížíme v mikroskopu (zvětšení 200 až 400, zájemci si příp. mohou prohlédnout metafázní chromozomy imerzním objektivem). Nejsou-li chromozomy dostatečně nabarveny, můžeme je zpětně dobarvit v roztoku Giemsa opakováním barvícího postupu. Vaším úkolem bude určit počet chromozomů (ploidii) a rozhodnout, zda buněčná suspenze obsahuje buňky normální nebo buňky nádorové tkáně. Kontrolní otázky: 1. Jaké techniky barvení chromozomů znáte? 2. Vysvětlete rozdíl mezi mutací v zárodečné a somatické buňce. 3. Vysvětlete pojem reciproká translokace. 4. Co je to tzv. Filadelfský chromozom? 5. Co je hlavním důsledkem hyperdiploidního počtu chromozomů? 6. Jak vzniká hyperdiploidie? 7. Proč nakapáváme buněčnou suspenzi z výšky 50 cm? 8. Jak působí kolchicin? 25 v20150212

3. Mendelovská dědičnost Studijní příprava Mendelovy zákony, základní genetická terminologie, interakce alelních genů, typy dědičnosti. Teoretický úvod Mendelovská dědičnost popisuje pravidla, která se uplatňují při přenosu dědičných znaků/nemocí z rodičů na potomky. Tato pravidla nazývaná jako Mendelovy zákony se uplatňují při dědičnosti znaků, které jsou podmíněné pouze jedním genem, čili monogenně. Základní terminologie Alela je alternativní forma genu lišící se od jiných variant téhož genu v nukleotidové sekvenci DNA. U diploidních organizmů 2 alely vytváří genotyp znaku a jsou lokalizované na homologních chromozomech. Lokus je specifické místo genu (alely) na chromozomu. Homozygot na lokusu obou homologních chromozomů obsahuje stejnou alelu. Heterozygot na lokusu homologních chromozomů obsahuje 2 různé alely. Polymorfismus/Mnohotná alelie je stav, kdy se v populaci vyskytuje více než 2 varianty/alely genu. Soubor těchto alel vytváří alelickou sérii (např. alely pro krevní skupinu AB0, alely pro HLA). Každý jedinec však může mít z této série pouze 2 alely pro určitý gen! Důvodem je diploidie. Vztah mezi alelami téhož genu se nazývá interakce alelních genů. Typ interakce mezi alelami určitého genu určíme podle fenotypu heterozygota. Rozlišujeme 3 typy interakcí mezi alelami určitého genu: úplná dominance (A>a) Fenotyp heterozygota Aa je stejný jako fenotyp homozygota AA. Alelu dominantní zapisujeme velkým písmenem A. Alelu recesivní zapisujeme zpravidla tímtéž, ale malým písmenem a. U heterozygota alela A potlačí fenotypový projev alely a. Výsledný fenotypový projev heterozygota bude pouze projevem alely A. neúplná dominance (semidominance) (A a) Fenotyp heterozygota (Aa) je mezi fenotypem obou homozygotů (AA a aa). U heterozygota Aa je vyjádření dominantní alely mírnější než u homozygota AA. U heterozygota Aa dominantní alela nepotlačuje recesivní alelu úplně. Recesivní alela se také částečně projeví ve fenotypu. kodominance (A = B) Vyjádření obou alel (A i B) ve fenotypu heterozygota je rovnocenné, obě alely jsou plně exprimované. U heterozygota AB se vyskytují fenotypy přítomné u homozygotů, tj. jak u AA, tak u BB. Kodominance je charakteristická např. pro geny kódující lidské antigeny nebo AB0 krevní systém. Monogenní znaky/onemocnění mohou vykazovat 4 základní typy dědičnosti: dominantní recesivní autozomální autozom. dominantní (AD) autozom. recesivní (AR) vázanou na X chromozom X-vázaná dominantní (XD) X-vázaná recesivní (XR) 26 v20150212

U monogenních onemocnění se můžeme setkat s variabilní expresivitou, resp. penetrancí genu. Variabilní expresivita genu říká, že tentýž genotyp se u různých jedinců může do fenotypu promítnout různě silně (různý stupeň závažnosti klinických projevů). Neúplná penetrance poukazuje na to, že jen určitý podíl jedinců daného genotypu vykazuje příslušný fenotyp (někteří nositelé mutantního genu jsou nemocní, jiní jsou bez klinických projevů). Příklady, které budeme řešit, jsou vesměs monogenně podmíněné znaky a platí pro ně Mendelovy zákony dědičnosti. Pro řešení příkladů je důležité vědět: 1. Do každé gamety vstupuje při meioze z každého páru alel jen jedna alela. 2. Homozygot tvoří všechny gamety stejného genotypu. Heterozygot (Aa) tvoří dva druhy gamet (polovinu gamet s alelou A, polovinu s alelou a). Dvojitý heterozygot (AaBb) tvoří čtyři druhy gamet rozdílného genotypu (AB, Ab, ab, ab), jestliže jsou oba alelové páry (A/a, B/b) umístěny na různých chromozomech. 3. Zygota, resp. potomek, dostává pro daný znak vždy jednu alelu od matky (z vajíčka) a druhou alelu téhož genu od otce (ze spermie). Symboly čteme takto: A... dominantní alela a... recesivní alela AA... dominantní homozygot v genu A Aa... heterozygot v genu A aa... recesivní homozygot v genu A Postup při řešení úkolů Jsou dvě základní situace: 1. Známe fenotypy rodičů a chceme určit fenotypy jejich potomků: a) Určíme genotypy rodičů podle typu interakce alel. b) Určíme genotypy jejich gamet pomocí úvahy o segregaci alel. c) Určíme genotypy zygot spojením (kombinací) jednotlivých genotypů spermií a vajíček. d) Zygotickým genotypům přiřadíme fenotypy odpovídající danému typu interakce alel. Dostaneme fenotypy potomků. 2. Známe fenotypy potomků a chceme určit genotypy nebo fenotypy jejich rodičů. a) Určíme genotypy potomků, odpovídající danému typu interakce alel. b) Pro každý alelový pár v genotypu potomka platí, že jednu alelu dostal od matky, druhou od otce. Symboly těchto alel zapíšeme jako složku genotypu matky a genotypu otce. Získáme genotypy obou rodičů. c) Rodičovským genotypům přiřadíme fenotypy odpovídající typu interakce alel v daném případě. Výsledek řešení nemusí být vždy jednoznačný, protože často je teoreticky možných genotypů více. 27 v20150212

Při řešení příkladů nám pomůže nákres rodokmenu. Symboly používané v rodokmenech: 3.1 Dědičnost barvy očí Barva očí je výsledkem interakce několika párů alel různých genů, které dědičně určují tvorbu a ukládání pigmentu v duhovce. Pro jednoduchost se omezíme na jediný alelový pár, ve kterém alela pro hnědou barvu očí B je dominantní nad alelou pro modrou barvu očí b. a) Hnědooký muž se ožení s modrookou ženou a mají 8 hnědookých dětí. Jaké jsou genotypy všech členů rodiny? b) Hnědooký muž, jehož oba rodiče byli hnědoocí, se ožení s hnědookou ženou, jejíž otec byl hnědooký a matka modrooká. Mají jedno modrooké dítě. Jaký je genotyp všech členů rodiny? 3.2 Dědičnost monogenně založeného onemocnění Byl sledován výskyt jistého onemocnění v souboru 100 rodin. Na základě výsledků vyšetření určete, zda se jedná o dominantní nebo recesivní chorobu a napište genotypy rodičů. Fenotyp rodičů Počet rodin Fenotyp dětí zdravé nemocné zdravý nemocný 51 80 37 zdravý zdravý 40 90 16 nemocný nemocný 9 0 17 28 v20150212