HYDRAGEL HR K20 Ref. 3001 2015/06
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL HR K20 kit je určen k elektroforetickému rozdělení bílkovin lidského séra a dalších biologických tekutin jako je moč a likvor (CSF) na alkalicky pufrovaných agarózových gelech o ph 8.8. Separované bílkoviny jsou obarveny roztokem kyselé violeti (kvalitativní analýza séra, moči nebo likvoru či kvantitativní analýza séra) nebo roztokem amidočerni (kvantitativní analýza séra). Přebytek barvičky je odstraněn kyselým roztokem. Vyhodnocení je buď vizuální (hledání typových abnormalit) nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Každý agarózový gel HYDRAGEL HR K20 je určen k analýze 7mi vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke skríningu abnormalit bílkovin séra a některých dalších biologických tekutin. Je založena na principu zónové elektroforézy na vhodném podpůrném mediu. Agaróza slouží jako univerzální a efektivní podpůrné medium. Ačkoliv většina klinických laboratoří se spokojí s "tradičním" pětizónovým typem sérových proteinů, vysoce rozlišovací elektroforéza poskytuje další diagnostické informace. Metodou HYDRAGEL HR K20 jsou bílkoviny séra, moči a likvoru děleny na přibližně 10 frakcí. Každá frakce obsahuje jeden nebo více proteinů. Složení gelu, podmínky elektroforézy a volba barvičky (kyselá violeť nebo amidočerň) umožňují vynikající rozlišení a vysokou senzitivitu zvláště v gamazóně. Obarvené elektroforeogramy jsou vyhodnocovány vizuálně (hledání typových abnormalit). Toto vizuální vyhodnocení může být doplněno denzitometrií k obdržení semikvantitativních, relativních hodnot jednotlivých nebo kombinovaných proteinových frakcí. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL HR K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. Č. 3001 Agarózové gely (připraveny k použití) 10 gelů Tris-barbitálový pufr (zásobní roztok) 3 lahv. po 100 ml Roztok kyselé violeti (zásobní roztok) 1 lahv. 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 100 ml Aplikátory (7 zubů) (připraveny k použití) 1 bal., 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal., 10 ks PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 8.8 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu vzorků séra, moči a likvoru. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. TRIS-BARBITÁLOVÝ PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok s ph 8.7 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufr pro elektroforézu. Skladovat při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní roztok je stabilní několik let - nejméně do data expirace vyznačeného na balení kitu či na štítcích jednotlivých lahviček. Zředěný roztok je stabilní jeden rok v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Nepoužívejte naředěný pufr při změně jeho vzhledu, např. vzniku zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace. - 114 - SEBIA NÁVOD - Czech
3. ROZTOK KYSELÉ VIOLETI Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pro barvení gelů po elektroforéze. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky. Pracovní roztok vydrží 6 měsíců. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního odbarvovacího roztoku je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 1 litr pracovního roztoku doplněním 1 ml zásobního roztoku do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu či na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávat azid sodný. Pracovní odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, KAT. Č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 5. APLIKÁTORY K nanesení vzorku - připraveny k použití Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 6. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Musí se připravit v laboratoři (0.9 g/dl) NaCl 0.15 M roztok v destilované nebo deionizované vodě. Používá se k ředění vzorků. Skladování Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. 2. FLUIDIL SEBIA, kat. č. 4587, 1 lahvička, 5 ml roztok je ihned použitelný. Ředění vzorků s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku (například viskózní nebo zakalené vzorky, jako jsou séra s obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu, vzorky s polymerizovaným Ig M, ) nebo s nízkou intenzitou elektroforetického záznamu. Skladování Při teplotě místnosti. Stabilní do doby expirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny. 3. FIXAČNÍ ROZTOK (volitelná položka) Nejméně 15 minut před použitím připravte roztok obsahující (obj. / obj.): 60 % etanolu, 10 % kys. octové a 30 % destilované nebo deionizované vody. Dobře promíchejte. K fixaci elektroforeticky separovaných proteinů na agarózových plotnách. - 115 -
Skladujte při pokojové teplotě pečlivě těsně uzavřeno k zabránění odpařování. Po třech měsících odstraňte. Každých 150 ml fixačního roztoku je určeno na fixaci 4 gelových ploten. 4. AMIDOČERŇ (volitelná položka SEBIA, kat. č. 4554) Koncentrát amidočerni je viskózní roztok, který může gelovatět. Citlivost zásobního barvícího roztoku není změněna zvýšením viskozity nebo ztuhnutím. V každém případě je pro dosažení správného rozpuštění barvícího roztoku nutné dodržet následující postup : 1. Přidejte 15 ml ředícího roztoku pro amidočerň do lahvičky s koncentrovanou amidočerní. 2. Pečlivě uzavřete lahvičku. 3. Lahvičku pořádně protřepejte po dobu cca 5 sekund. 4. Přelijte tento roztok do odměrného válce pro přípravu barvicího roztoku. 5. Opakujte tento krok 2-3x, až do úplného rozpuštění koncentrované amidočerni. 6. Nalijte zbylý obsah lahvičky s ředícím roztokem pro amidočerň do odměrného válce a doplňte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. 7. Promíchávejte obsah válce po dobu 5-10 minut. Barvící roztok je připraven k použití. POZNÁMKA : Nesprávná příprava barvícího roztoku povede k nedostatečnému barvení albuminové frakce (nízká procentuální hodnota světlého středu frakce). Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok o ph 2 ; amidočerň ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. Zásobní i pracovní barvicí roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky rozpouštědla pro barvicí roztok. Pracovní barvicí roztok je stabilní 1 měsíc. Stabilita roztoku může být prodloužena na 3 měsíce, pokud je uchováván v chladničce. Ihned po použití musí být uzavřené nádoby uloženy v chladničce. Neskladujte pracovní barvicí roztok v blízkosti zdrojů tepla. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, kat. č. 1302 nebo MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. 3. Vlhká komůrka kat. č. 1270. 4. Elektroforetická komora K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi - HYDRAGEL Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 10 µl a 200 µl. 7. Sušička-inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 8. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. 9. Kontrolní sérum. ANALYZOVANÉ VZORKY Vzorky ke kvalitatívní analýze pomocí této metody mohou být sérum, moč nebo likvor. Sérové proteiny lze rovněž kvantifikovat po barvení kyselou violetí nebo amidočerní. Odběr a skladování vzorků Nejlepších výsledků se dosahuje analýzou čerstvých vzorků - v případě nutnosti lze po dobu jednoho týdne skladovat v chladničce. V případě potřeby lze séra skladovat při teplotě 2 až 8 C až po dobu jednoho týdne. Zmražené vzorky jsou stabilní nejméně 1 měsíc. Mražení séra a likvoru s azidem sodným, 0.02 g/dl zvyšuje stabilitu stejně jako mražení močí s HEPES 0.1 M (ph 6.75) a s azidem sodným, 0.02 g/dl. Zmražené vzorky po rozpuštění zanechávají na startu rovněž stopu z denaturovaných proteinů a lipoproteinů. DŮLEŽITÉ : Kyselinu boritou jako konzervační činidlo nepoužívejte. vzorků ke kvalitativní analýze (barvení kyselou violetí) Sérum Používejte neředěná séra. Úprava sérových vzorků pomocí Fluidil: Úprava sérových vzorků přípravkem Fluidil se musí provést v následujících případech: - Sérové vzorky s narušenými difusními vlastnostmi přes zuby aplikátoru vzorku, například viskózní nebo zakalené vzorky po skladování při teplotě 2 až 8 C nebo po zmrazení (zejména vzorky obsahem kryoglobulinu nebo kryogelu). - Sérové vzorky s polymerizovaným Ig M. - Sérové vzorky s elektroforetickým záznamem s nízkou intenzitou. V takových případech přidejte 25 μl přípravku Fluidil na 75 μl séra a odstřeďujte na vortextu po dobu 15 sekund. Dále pokračujte podle standardního postupu. - 116 -
Likvor nebo dvojice sérum / likvor Aplikujte vzorky s koncentrací celkové bílkoviny 0.6 až 1.0 g/dl. DŮLEŽITÉ : Dvojice séra a likvoru musí mít stejnou koncentraci celkové bílkoviny. Moče K analýze používáme nezahuštěné vzorky moče. Zahustěte je jen v případě potřeby vyšší senzitivity. POZNÁMKA : Difuze močových vzorků do zubů aplikátoru se může ztížit pokud moč (nativní nebo koncentrovaná) je zakalená. Je doporučeno, aby pevné částice byly odstraněny centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. 0.45 µm stříkačkový filtr). Nezahuštěné moče : Naneste nativní vzorek moči. Zahuštěné moče : Analyzují se vzorky zahuštěné na koncentraci celkové bílkoviny 0.5 g/dl. DŮLEŽITÉ : Některé moče obsahují zvýšené množství solí, která může způsobit deformaci gelu a následně poškození migračních profilů. Tyto moče je nutno dialyzovat a soli odstranit. séra pro semi-kvantitativní analýzu (barvení amidočerní nebo kyselou violetí) Barvení amidočerní Použijte neředěné vzorky séra. Barvení kyselou violetí Použijte vzorky séra předtím 4x zředěné (1 obj. / 3 obj.) fyziologickým roztokem. Potom pokračujte standardním postupem. Nepoužívat Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra hemolýza zvyšuje alfa-2 a beta frakce. Vzorky plasmy proužek fibrinogenu v blízkosti místa aplikace by mohl být zaměněn za monoklonální imunoglobulin a mohl by měnit procentuální složení odpovídajících zón. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 µl destilované (deionizované) vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujete, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. UPOZORNĚNÍ : Neponechávejte filtrační papír v delším kontaktu s gelem dochází k dehydrataci. 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku - gelem nahoru (viz obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou (switch) v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut! - Aplikátor použijte okamžitě. - Pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopte za plastikovou část chránící zoubky a celou komoru umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 5 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESNIŽUJTE PRUDCE. - Analýza séra : Ponechejte aplikátor v kontaktu s gelem po dobu 30 sec. - Analýza dvojic likvor / sérum a koncentrovaných močí : Ponechejte aplikátor v kontaktu s gelem 2 minuty. - Analýza nezahuštěných močí : Kontakt aplikátoru s gelem 7 min. 30 sec. 13. Po nanesení vzorku aplikátor uvolněte, vyjměte jej a vyhoďte! 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGEL ovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte komoru ke zdroji proudu. - 117 -
PODMÍNKY DĚLENÍ 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu II. FIXACE Zpracujte gel jedním z následujících postupů. Horkovzdušná fixace (doporučuje se pouze s inkubátorem-sušičkou SEBIA IS 80) : Gel zcela osušte v inkubátoru-sušičce při 80 C (asi 10 min). SEBIA K20 SÉRUM / SÉRUM A LIKVOR Objem pufru na komoru 150 ml 150 ml Celkový objem pufru 300 ml 300 ml Doba dělení 40 minut 30 minut Konstatntní napětí 80 V 90 V Počáteční proud (na gel) 9 ± 1 ma 9 ± 1 ma Fixace pomocí fixačního roztoku : 1. Vložte gel do držáku. 2. 150 ml fixačního roztoku nalejte do jedné z nádobek HYDRAGEL K20 Accessory Kitu. 3. Gel ponořte na 15 minut do fixačního roztoku. 4. Gel vyjměte a osušte při 80 C. DŮLEŽITÉ : Gel musí být perfektně suchý. HYDRAGEL HR K20-2015/06 III. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení a ochlazení ponořte usušený gel do barvícího roztoku (kyselá violeť nebo amidočerň) na 10 minut. 2. Odbarvujte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 3. Odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel při 80 C teplého vzduchu. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. IV. SKENOVÁNÍ Separace se interpretují z hlediska abnormalit vizuálně. Vizuální pozorování je možné dokončit denzitometrií pro získání semikvantitativních, relativních hodnot pro individuální nebo kombinované frakce bílkovin. Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. MOČ KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum. VÝSLEDKY Hodnoty (kvantitativní analýza) Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) jednotlivých proteinových zón. Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) hlavních elektroforetických zón proteinů 225 sér zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL HR K20 : FRAKCE HYRYS PHORESIS Albumin 56.2-69.0 57.5-67.9 Alfa-1 globuliny 1.2-3.2 1.0-3.8 Alfa-2 globuliny 7.8-13.4 7.2-12.8 Beta globuliny 7.4-13.4 7.6-13.6 Gama globuliny 9.8-18.6 10.3-18.3 Doporučuje se, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Je kvalitativní. Viz LITERARURA. SÉROVÉ PROTEINY Interpretace se provádí porovnáváním elektroforeogramů vyšetřovaných klinických vzorků a normálních kontrol. V případě zvýšených, snížených či přídatných frakcí je obvykle nutné potvrdit pozorované změny jinými testy jako je kvantifikace specifických proteinů, imunoelektroforéza nebo imunofixace. Mezi početnými plasmatickými proteiny existuje přibližně patnáct v množství potřebném pro vznik dostatečné barevné intenzity proužků pozorovaných na gelech HYDRAGEL 7 HR. Hodnota této metodiky spočívá právě v možnosti průkazu slabých monoklonálních a oligoklonálních proužků. - 118 -
LIKVOROVÉ PROTEINY Mozkomíšní mok je biologická tekutina s nízkým obsahem bílkovin v normálním moku je to jen kolem 30 ± 15 mg/dl. Likvorové bílkoviny většinou pochází ze séra, odkud jsou filtrovány přes hemato-encefalickou bariéru. K analýze na gelech HYDRAGEL 7 HR je nutno likvor zahustit na koncentraci 0.6-1.0 g/dl. Normální elfogram bílkovin v moku vykazuje následující pořadí zón : Prealbumin transthyretin, nejrychlejší frakce ; Albumin, hlavní frakce, tvořící přes 75 % celkových bílkovin ; Alfa-1, tvořená primárně alfa-1 antitrypsinem ; Alfa-2, obsahující bílkoviny s vysokou molekulovou hmotností; obyčejně velmi slabá, neboť bílkoviny s vyšší m.h. nemohou procházet hematolikvorovou bariérou ; Beta frakce, obsahující transferin ; Beta-2 zóna, obsahující karbohydrát (kyselina sialová) deficientní, "pro likvor specifický" transferin, zvaný rovněž "protein Tau" ; Gama frakce, obsahující především Ig G a někdy Ig A a Ig M. Intratékální syntéza imunoglobulinů se vyskytuje v souvislosti s různými onemocněními CNS demyelinizační, zánětlivé a infekční choroby stejně jako autoimunní reakce. Často se nachází ve spojení s redukovanou heterogenitou imunoglobulinů, jež se manifestuje jako "oligoklonální proužkování" dobře rozlišené HYDRAGEL HR elektroforézou. Význačným znakem intratékální syntézy Ig je přítomnost oligoklonálních proužků Ig v likvoru a jejich absence v séru. Proto je nezbytné : Analyzovat dvojice vzorků likvor / sérum odebraných od téhož pacienta současně : - Ve stejnou dobu za předpokladu vyloučení jakékoli manipulace se vzorky, jež by mohla ovlivnit koncentraci imunoglobulinů. - Aplikovat stejná množství proteinů (asi 1 g/dl) s každým z obou vzorků. - Každý abnormální proužek v gama zóně likvoru bez odpovídající frakce v séru, podrobit imunofixaci. Imunochemické potvrzení charakteru imunoglobulinu takového proužku v likvoru je nezbytné, protože v gama zóně se mohou vyskytovat i proužky jiné, než Ig. Např.: frakce tau, karboanhydráza, post gama nebo CRP. Tyto proužky nemají stejný diagnostický význam jako "pravé" oligoklonální proužky s Ig. MOČ Elektroforézou se detekují monoklonální komponenty a jiné močové bílkoviny. Metodika HYDRAGEL HR K20 se používá jako skríningový test pro bílkoviny v moči. Dovoluje detekci monoklonálních komponent (které musí být potvrzeny a identifikovány imunofixací) a detekci proteinů tubulárního, glomerulárního nebo smíšeného původu, který musí být charakterizován vhodnými metodami jako je molekulární síto v SDS elektroforéze, nefelometrie nebo imunofixace odpovídajícími protilátkami. KONFIRMAČNÍ TESTY SEBIA nabízí následovné specializované testy : Monoklonální proteiny v séru : HYDRAGEL IF K20 (kat. č. 3031) a HYDRAGEL DOUBLE IF K20 SEBIA (kat. č. 3036), Bence Jonesova bílkovina v moči : HYDRAGEL BENCE JONES K20 SEBIA (kat. č. 3038), Charakterizace tubulárního a glomerulárního poškození (molekulární síto v SDS pufru) : HYDRAGEL PROTEINURIE K20 SEBIA (kat. č. 3004). Omezení Lipoproteiny LDL a HDL jsou komplexní složky s velmi proměnlivou přirozenou elektroforetickou mobilitou mezi beta a alfa-2 pásmem. S cílem zabránit komplikacím při integraci a interpretaci, jsou gely HYDRAGEL vyráběny s konkrétním chemickým složením, které obecně zajišťují umístění HDL v pásmu alfa-2 a LDL v pásmu beta. Migrace je velmi citlivá na následující parametry : - skladování vzorku, - koncentrace lipoproteinů, - ošetření léky (například heparinem), - míru dehydratace gelu (skladování gelu), - odchylky v kvalitě surovin, i malé. Z těchto důvodů je možné pozorovat slabý anodický posun těchto lipoproteinů, které jsou více patrné při rozšíření nebo mírnému rozdělení oblastí alfa-2 a / nebo beta. 1) Procentuální obsah frakcí alfa-2 a beta zůstává zcela nezměněn přes mírné rozdělení v důsledku odchylek elektroforetické mobility. 2) Charakteristický tvar frakce beta-lipoproteinů (s významně zaostřeným a nepravidelným tvarem) by neměl vést k chybné interpretaci, protože se změnil pouze tento aspekt. U rozmražených vzorků lze pozorovat stopy způsobené denaturovanými proteiny. Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra a nepoužívejte vzorky plasmy. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". - 119 -
HODNOTY Byly použity standardní materiály, příprava vzorků a techniky. Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně. Kvalitativní analýza Výsledky na HYDRAGEL HR K20 gelech indikují velice dobrou reprodukovatelnost mezi gely u všech testovaných vzorků a nebyly zde žádné vizuálně pozorovatelné rozdíly mezi jednotlivými opakováními. Jednosto šestnáct (116) různých vzorků (patologických i normálních sér, párů CSF / sérum a močí) bylo analyzováno na HYDRAGEL HR 20 gelech a jiných, komerčně dostupných gelových systémech s vysokým rozlišením. Vzorky byly připraveny dle doporučení pro tuto metodu. Podobnosti / rozdíly elektroforeogramů a přítomnost monoklonálních nebo oligoklonálních komponent byly základem pro srovnání. Vizuální, kvalitativní srovnání těchto dvou testů bylo založeno na srovnání počtu a umístění pozorovatelných proužků. Výsledky mezi těmito dvěma systémy byly ve shodě ve všech 116 případech i s jejich klinickou dg. Vzorek patologického séra s monoklonální bílkovinou (identifikován a kvantifikován jinou technikou) byl následně ředěn normálním sérem a takto ředěný vzorek byl elektroforeticky analyzován. Citlivost byla určena z nejvyššího ředění se zřetelným monoklonálním gradietem po nabarvení kyselou violetí a byla 0.1 g/dl. Semi-kvantitativní analýza Pro semi-kvantitativní analýzu výsledky na HYDRAGEL HR K20 gelech indikují velice dobrou reprodukovatelnost na a mezi gely na všechny testované aspekty a nebyly zde žádné vizuálně pozorovatelné rozdíly mezi jednotlivými opakováními, průměrný CV bylo 3.8 %. HYDRAGEL HR K20 metoda s barvením kyselou violetí a amidočerní byla srovnána s jiným, komerčně dostupným gelovým systémem s vysokým rozlišením (tradiční rozdělení s sérových bílkovin s vysokým rozlišením a barvením kyselou violetí). Pro srovnání všech elektroforeogramů byly výsledky skenovány (žlutým filtrem) jako 5-ti zónová elektroforéza. Klinické vzorky séra (n = 56) byly analyzovány oběma technikami a relativní koncentrace pro každou frakci byla srovnána za použití lineární regresní analýzy, 0.952 byl střední korelační koeficient pro všechny proteinové frakce s oběma barvícími roztoky. FRAKCE Korelační koef. HYDRAGEL HR K20 (kys. violeť) Sklon y-úsek Rozsah % Korelační koef. HYDRAGEL HR K20 (amidočerň) Sklon y-úsek Rozsah % Albumin 0.960 0.95 1.35 35.4-65.6 0.953 0.96 2.42 38.0-68.5 Alfa-1 0.965 1.02 0.27 1.7-7.9 0.963 1.17-0.17 1.2-9.0 Alfa-2 0.920 0.93 1.00 6.5-24.3 0.966 0.95 0.29 6.3-24.4 Beta 0.909 0.95 0.19 5.3-20.4 0.936 0.87 0.69 5.0-19.4 Gama 0.985 0.95 2.41 9.5-39.4 0.962 1.03 0.01 6.1-38.4 Vzorek patologického séra s monoklonální bílkovinou (identifikován a kvantifikován jinou technikou) byl následně ředěn normálním sérem a takto ředěný vzorek byl elektroforeticky analyzován HYDRAGEL HR K20 technikou. Citlivost byla určena z nejvyššího ředění se zřetelným monoklonálním gradietem po nabarvení kyselou violetí. Přibližně stejná barvící citlivost / intenzita byla pozorována při elektroforéze nativního séra a barvení amidočerní vs. elektroforéza séra ředěného 1/4 následované barvením kyselou violetí a byla 0.1 g/dl. Metoda byla lineární do koncentrace nejméně 5.8 g/dl pro albumin a do 3.9 g/dl pro Ig G pro obě barvící metody. POZNÁMKA : V závislosti na umístění monoklonální komponenty a polyklonálním pozadí v gama zóně, se může detekční limit lišit. ELEKTROFOREOGRAM - 120 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171. 2. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28. 3. Cohen R, François B, Sabot JF, Bernard P, Picq JP, Adeleine P. 1985. Étude comparative de l immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. Path Biol, 33 : 23-26. 4. Davenport RD, Keren DF. 1988. Oligoclonal bands in cerebrospinal fluids, significance of corresponding bands in serum for diagnosis of multiple sclerosis. Clin Chem, 34 : 764-765. 5. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest, 43, 2332-2346. 6. Keren DF, High resolution electrophoresis and immunofixation techniques and interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 1994, 397 pp. 7. Laurell DB. 1972. Comparison and variation of the gel electrophoresis fractions of plasma cerebrospinal fluid and urine. Scand J Clin Lab Investigation, 29 : 71-82. 8. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L Eurobiologiste, 190 : 395-405. 9. Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d un protocole d exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : 29-37. 10. Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 : 41-47. 11. Linstedt G, Lindberg PA. 1974. Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell. Clin Chem Acta, 56 : 125-126. 12. Olsson JE, Link M. 1973. Immunoglobulin abnormalities in multiple sclerosis. 1973. Arch Neurol, 28 : 392-399. 13. Papadopoulos NM, Costello R, Kay AD, Cuttler NR, Papoport SL. 1984. Combined immunochemical and electrophoretic determination of protein in paired serum and cerebrospinal fluid samples. Clin Chem, 30 : 1814-1816. 14. Pearson SD, Wu JT. Sensitive, specific detection of oligoclonal banding in cerebrospinal fluid by agarose gel electrophoresis. 1989. Clin Chem, 35 : 1997. 15. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249. 16.; Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765. 17. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. - 154 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7-155 -