Mikrobiologické aspekty tvorby biogenních aminů v potravinách živočišného původu. Bakalářská práce. Brno prof. MVDr. Tomáš Komprda, CSc.

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta v Brně Ústav technologie potravin Mikrobiologické aspekty tvorby biogenních aminů v potravinách živočišného původu Bakalářská práce Brno 2006 Vedoucí bakalářské práce prof. MVDr. Tomáš Komprda, CSc. Vypracovala Jana Tručková

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: Mikrobiologické aspekty tvorby biogenních aminů v potravinách živočišného původu vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne. Podpis bakaláře...

3 Poděkování Děkuji panu Prof. MVDr. Tomáši Komprdovi CSc. za odborný dohled, poskytnutí potřebných materiálů a za rady při vypracování bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat paní MVDr. Olze Cwikové za poskytnutí materiálů, údajů a informací, které mi umožnily realizovat zadané téma.

4 ANNOTATION Biogenic amines are important nitrogen compounds of biological importance in vegetable, microbial and animal cells. They can be detected in both raw and processed foods. In food microbiology they have sometimes been related to spoilage and fermentation processes. Some toxicological characteristics and outbreaks of food poisoning are associated with histamine and tyramine. Secondary amines may undergo nitrosation and form nitrosamines. A better knowledge of the factors controlling their formation is necessary in order to improve the quality and safety of food. A large number of techniques have been employed to analyse food for biogenic amines, including gas chromatography, thin layer chromatography, high-performance liquid chromatography, capilary elektrophoresis and enzyme methods. Amino acid decarboxylases are enzymes present in many microorganisms of food concern. They have been found in species of the genera Bacillus, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Escherichia. Furthermore, many lactic acid bacteria belonging to the genera Lactobacillus, Pediococcus and Enterococcus are able to decarboxylate amino acids. The screening plate method have been used for the detection of amino acid decarboxylase-positive microorganisms (especiall lactic acid bacteria) in the fermented meat products and cheeses.

5 OBSAH 1 ÚVOD...8 2 CÍL PRÁCE...9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...10 3.1 Biogenní aminy...10 3.1.1 Význam biogenních aminů...10 3.1.2 Vznik biogenních aminů...12 3.1.3 Výskyt biogenních aminů v potravinách...12 3.1.3.1 Nefermentované potraviny...12 3.1.3.2 Fermentované potraviny...14 3.1.4 Odstranění biogenních aminů z potravin...15 3.1.5 Toxicita biogenních aminů...15 3.1.5.1 Toxikologické dávky...17 3.1.6 Metody stanovení biogenních aminů...17 3.2 Faktory ovlivňující aktivitu dekarboxylázy aminokyselin...18 3.3 Mikroorganizmy produkující biogenní aminy...19 3.4 Metody detekce nejvýznamnější bakterií s dekarboxylázovou aktivitou...21 3.4.1 Screeningová plotnová metoda...21 3.4.2 Bakterie mléčného kvašení...21 3.4.2.1 Rod Lactobacillus...22 3.4.2.1.1 Stanovení počtu bakterií rodu Lactobacillus...24 3.4.2.2 Stanovení bakterií mléčného kvašení...24 3.4.3 Rod Enterococcus...25 3.4.3.1 Stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus...26

6 3.5 Izolace, kultivace a průkaz mikroorganizmů ve vytypované skupině potravin...27 3.5.1 Izolace, kultivace a průkaz bakterií mléčného kvašení a enterokoků ve fermentovaných masných výrobcích...27 3.5.2 Izolace, kultivace a průkaz bakterií mléčného kvašení a enterokoků v sýrech typu Čedar a Gouda...28 4 ZÁVĚR...29 LITERATURA...30 PŘÍLOHY...33

7 SEZNAM TABULEK Tab. č.1.: Biogenní aminy, jejich prekurzory a biologický význam...10 Tab. č.2.: Změny koncentrace biogenních aminů během fermentace trvanlivých salámů...14 Tab. č.3.: Významné mikroorganizmy produkující biogenní aminy...19 Tab. č.4.: Růstové podmínky a výskyt lactobacilů...22

8 1 ÚVOD Biogenní aminy jsou nízkomolekulární organické dusíkaté báze, které jsou přítomny ve všech živých organizmech. Proces jejich vzniku je katalyzován zpravidla mikrobiálními enzymy a tvorba těchto látek postupuje od bílkovin přes peptidy k aminokyselinám, jejichž dekarboxylace vede ke vzniku aminů. Biogenní aminy mají v organizmu řadu funkcí, například ovlivňují regulaci tělesné teploty, objemu žaludku a ph žaludečních šťáv, takže mohou zásadně ovlivnit zdraví a pohodu člověka. Biogenní aminy mohou i při požití velmi malého množství (např. ve zrajícím sýru nebo v jedné sklence červeného vína) vyvolat nepříjemné symptomy nevolnost, dýchací potíže, návaly horka, pocení, srdeční palpitace, výsev rudých skvrn, pálení v hrdle a snížení nebo naopak zvýšení krevního tlaku. Jsou také přítomny i v některých potravinářských produktech, například v čokoládě, kysaném zelí, rybách a rybích výrobcích, v pivu, červeném vínu i ve zrajících sýrech a masných výrobcích. Biogenní aminy také mohou vznikat z aminokyselin působením bakterií (Bacillus, Salmonella, Shigella, Klebsiella, bakterie mléčného kvašení Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus a další), takže mohou být obsaženy ve všech výrobcích, připravovaných fermentačními postupy, nebo vystavených během výroby nebo skladování kontaminaci mikroorganizmy. Ke stanovení biogenních aminů se využívají zejména chromatografické metody. Plynová chromatografie je používána spíše ojediněle. Nejobvyklejší je stanovení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Také lze použít imunochemické metody (RIA, ELISA).

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je vypracovat literární rešerži se zaměřením na tvorbu biogenních aminů ve fermentovaných potravinách živočišného původu, dále navržení metod detekce nejvýznamnějších bakterií s dekarboxylázovou aktivitou a navržení metodického postupu izolace, kultivace a průkazu výše uvedených mikroorganizmů ve vytypované skupině potravin.

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Biogenní aminy Biogenní aminy jsou bazické dusíkaté sloučeniny, vznikající převážně dekarboxylací aminokyselin nebo aminací a transaminací aldehydů a ketonů. Tyto nízkomolekulární organické báze se mohou tvořit působením nativních enzymů potravin, resp. potravinových surovin nebo činností enzymů bakteriálních dekarboxyláz (SANTOS, 1996). V potravinách a krmivech představují biogenní aminy jedny z nežádoucích zplodin konečného rozkladu bílkovin (KŘÍŽEK, KALAČ, 1998). Na základě chemické struktury je možno biologicky aktivní aminy rozdělit do několika skupin: - alifatické (putrescin-put, kadaverin-cad, spermin-spm, spermidin-spd) - aromatické (tyramin-tyr, fenyletylamin-pea) - heterocyklické (histamin-his, tryptamin-try) - polyaminy (putrescin-put, spermidin-spd, spermin-spm) (SANTOS, 1996). 3.1.1 Význam biogenních aminů Obecně mohou být biogenní aminy zdrojem dusíku v různých biochemických reakcích. Některé biogenní aminy spoluvytvářejí aroma výsledného produktu (KOMPRDA, 2004). Jiné mají významné biologické vlastnosti, neboť jsou např. tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenyletylamin), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin (VELÍŠEK, 2002). Polyaminy a také kadaverin jsou nepostradatelnými složkami živých buněk (funkce při regulaci buněčného růstu) a jsou také důležité v regulování funkce nukleových kyselin a syntéze bílkovin, pravděpodobně i ve stabilizaci membrán (KOMPRDA, 2004). Histamin vzniká dekarboxylací histidinu a má centrální úlohu v mnoha alergických reakcích (MURRAY, et al., 1998). Přehled biogenních aminů vyskytujících se v potravinách, jejich prekurzorů a biologický význam je uveden v tab.1.

11 Z hygienického hlediska slouží biogenní aminy jako indikátory stupně kažení potravin. Významný je zde vliv teploty skladování: při teplotě blízko 0 C nastanou negativní senzorické změny dříve, než hodnoty obsahu biogenních aminů dosáhnou toxických dávek, při teplotě 10 C je tomu naopak. Ovšem některé bakterie jsou naopak schopny vytvořené biogenní aminy ve skladované potravině rozkládat: Pseudomonas spp., Serratia mercescens, Sarcina lutea (KOMPRDA, 2004). Tabulka 1. Biogenní aminy, jejich prekurzory a biologický význam (VELÍŠEK, 2002). Biogenní amin Původní Biologický význam aminokyselina histamin histidin lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak, sekreci žaludeční šťávy, účast při anafylaktickém šoku a alergických reakcích kadaverin lysin stabilizace makromolekul (nukleové kyseliny), subcelulárních struktur (ribisomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon putrescin agmatin fenylethylamin arginin via ornithin nebo citrullin arginin fenylalanin stabilizace makromolekul (NK), subcelulárních struktur (ribosomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon stabilizace makromolekul (NK), subcelulárních struktur (ribosomy), stimulace diferenciace buněk, rostlinný hormon prekurzor tyraminu tyramin tyrosin prekurzor dopaminu, lokální tkáňový hormon, vliv na krevní tlak a kontrakce hladkého svalstva dopamin DOPA mediátory sympatických nervů tryptamin tryptofan lokální tkáňové a rostlinné hormony (katecholaminy), vliv na krevní tlak, peristaltiku střev, psychické funkce

12 3.1.2 Vznik biogenních aminů Základní podmínky vzniku biogenních aminů v potravinách působením mikroorganizmů jsou tři: 1) V substrátu (potravině) musí být přítomny volné aminokyseliny 2) Musí být přítomny mikroorganizmy s dekarboxylázovou aktivitou 3) Musí být navozeny takové podmínky, které umožní růst bakterií, syntézu dekarboxyláz a jejich aktivitu. 3.1.3 Výskyt biogenních aminů v potravinách Výskyt biologicky aktivních aminů lze očekávat prakticky ve všech potravinách, které obsahují proteiny nebo volné aminokyseliny a jsou vystaveny podmínkám umožňujícím mikrobiální aktivitu. Mezi tyto potraviny patří především výrobky z ryb, masa a mléka, víno, pivo, zelenina, ovoce, ořechy a čokoláda (SANTOS, 1996). Vysoké koncentrace biogenních aminů se vyskytují u potravin v pokročilém stupni kažení (VELÍŠEK, 2002). Protože biogenní aminy vznikají převážně činností bakterií, můžeme rozdělit potraviny z hlediska výskytu biogenních aminů na nefermentované a fermentované. 3.1.3.1 Nefermentované potraviny V nefermentovaných potravinách je výskyt biogenních aminů nad určitou úroveň indikátorem nežádoucí mikrobiální aktivity (kažení potravin). Avšak přítomnost biogenních aminů v potravině nemusí být v přímém vztahu s růstem mikroorganizmů kazících tyto potraviny, protože ne všechny tyto mikroorganizmy vykazují dekarboxylázovou aktivitu. Obsah některých biogenních aminů v průběhu kažení potravin roste (histamin, putrescin, kadaverin), jiných naopak klesá (spermin a spermidin).

13 Nejvýznamnější skupinou nefermentovaných potravin jsou z hlediska výskytu biogenních aminů ryby, zvláště ryby makrelovité. Tzv. skombrotoxicita je spojována především s vysokým obsahem histaminu v těchto rybách. Mořské ryby (makrela, sleď, tuňák, sardinka) mohou obsahovat rozdílné biogenní aminy histamin, putrescin, kadaverin, tyramin, spermin, spermidin (SANTOS, 1996). V čerstvém rybím mase je obsah biogenních aminů malý, např. v mase tuňáka bývá 0-10 mg/kg histaminu a 0-2 mg/kg tyraminu. Obsah biogenních aminů však roste při nevhodném skladování. Při skladování ryb při teplotě kolem 0 C a nižších vznikají biogenní aminy v téměř zanedbatelném množství. Při vyšších teplotách je přítomnou mikroflórou dekarboxylován hlavně histidin a tkáně zejména makrelovitých ryb mohou obsahovat až 3000 mg/kg (makrela) nebo dokonce 8000 mg/kg (tuňák) histaminu. Také ostatní biogenní aminy, jako je tyramin, kadaverin, putrescin a další, vznikají v relativně vysokém množství (VELÍŠEK, 2002). Indikátorem kažení rybího i jiného masa je index biogenních aminů BAI (obsah biogenních aminů v mg/kg): BAI = HIS + PUT + CAD/(1 + SPD + SPM) (KOMPRDA, 2004). Nejdůležitějším biogenním aminem, nalezeným v ovocných šťávách vyrobených z pomerančů, citronů, grapefruitů, mandarinek, vinné révy, malin, jahod a rybízu je putrescin. Vysoké obsahy biogenních aminů se nacházejí také v pomerančovém džusu (noradrenalin, tryptamin), rajčatech (tyramin, tryptamin, histamin), banánech (tyramin, noradrenalin, tryptamin, serotonin), ve švestkách a špenátu. Fenyletylamin je přirozenou součástí kakaových bobů a nachází se tedy v čokoládě, čokoládových výrobcích a v cukrářských výrobcích obsahujících čokoládu. Některé druhy hub mohou také obsahovat vysoká množství fenyletylaminu. V bílém a černém pepři, v sojové omáčce mohou být vysoká množství pyrolidinu. V karagenu z řas může být přítomen histamin a kadaverin (SANTOS, 1996). Při skladování masa dochází vlivem enzymové aktivity přítomné mikroflóry k růstu obsahu biogenních aminů, a obsah některých z nich lze proto využít jako indikátor čerstvosti masa. V mase jsou hlavními biogenními aminy histidin, kadaverin, putrescin a tyramin. Ve vepřovém mase byly zjištěny relativně vysoké koncentrace spermidinu a sperminu, naopak histamin a tyramin zde byl nalezen v malém množství. Dále čerstvé vepřové maso může obsahovat 7 mg.kg -1 kadaverinu a putrescinu, zatímco maso zkažené 60 mg.kg -1 a více (STRAKA, MALOTA, 2006).

14 V mléce se nacházejí pouze nízké koncentrace polyaminů - spermin, spermidin, putrescin (SANTOS, 1996). 3.1.3.2 Fermentované potraviny Během přípravy fermentovaných potravin můžeme očekávat přítomnost mnoha druhů mikroorganizmů, některé z nich jsou schopny produkce biogenních aminů. Ve většině produktů, v kterých rostou bakterie mléčného kvašení, je obsaženo významné množství putrescinu, kadaverinu, histaminu a tyraminu (SANTOS, 1996). Nejvýznamnější skupinou fermentovaných potravin jsou z hlediska obsahu biogenních aminů sýry. Při jejich zrání dochází k výrazné tvorbě biogenních aminů v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry (VELÍŠEK, 2002). Sýry se tak mohou stát příčinou alimentárních otrav způsobených histaminem. V různých typech sýrů se kromě histaminu mohou nacházet různá množství tyraminu, kadaverinu, putrescinu, tryptaminu a fenyletylaminu. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry poměrně malá množství biogenních aminů. Ve fermentované zelenině, především v láku kysaného zelí, je přítomen putrescin a ve fermentovaných sojových bobech tyramin a histamin. Důležitým faktorem výskytu biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích je bakteriální startovací kultura (SANTOS, 1996). Nárůst biogenních aminů je patrný zejména v počátečních fázích fermentace výrobků a je závislý na druhu přítomných mikroorganizmů. Na vzniku biogenních aminů v trvanlivých salámech se mohou podílet mikroorganizmy použité ve startovacích kulturách i mikroorganizmy zpracovávané suroviny. V ojedinělých případech mohou výrobky obsahovat 100 až 1000 mg.kg -1 histaminu. Správné použití startovací kultury má za následek výskyt mnohem nižších množství biogenních aminů, než když je za fermentaci odpovědná přirozená mikroflóra. Změny koncentrace biogenních aminů během fermentace trvanlivých salámů jsou uvedeny v tab.2.

15 Tabulka 2. Změny koncentrace biogenních aminů během fermentace trvanlivých salámů (VELÍŠEK, 2002). Startovací kultura Doba Obsah v mg.kg -1 dny histamin kadaverin putrescin fenylethylamin tyramin s vysokou aktivitou 0 3 1 1 2 2 dekarboxyláz 1 4 7 21 2 69 2 5 35 18 9 95 9 8 64 15 11 142 21 6 84 13 11 120 s nízkou aktivitou 0 3 1 1 2 2 dekarboxyláz 1 3 1 1 2 2 2 3 1 1 2 5 9 4 1 2 2 20 21 3 1 3 2 21 3.1.4 Odstranění biogenních aminů z potravin Odstranění již jednou vzniklých biogenních aminů z potravin je velmi obtížné. Snížení jejich koncentrace lze např. dosáhnout použitím diaminooxidázy, ale v praxi není tento způsob dekontaminace použitelný. K částečnému snížení obsahu aminů dochází také v tepelně zpracovaných výrobcích jejich reakcí s redukujícími cukry, resp. s rozkladnými produkty cukrů v reakci Maillarda. Nejvhodnějším způsobem výroby potravin obsahujících malé množství biogenních aminů je však dodržování takových technologických postupů a hygienických podmínek výroby, které brání jejich vzniku (VELÍŠEK, 2002). 3.1.5 Toxicita biogenních aminů Pokud jde o toxikologický význam, mohou být biogenní aminy prekurzory karcinogenních N-nitroso sloučenin, a to především sekundární aminy (R-NH 2 -R), které vytvářejí stabilní a tedy nebezpečné produkty na rozdíl od primárních aminů (NH 2 -R) (KOMPRDA, 2004). Protože biogenní aminy (histamin, tyramin, putrescin) ovlivňují významné fyziologické funkce v organizmu člověka a jsou to tedy látky tělu vlastní, toxický účinek mohou mít pouze, když je vyšší množství těchto látek přijímáno

16 v potravinách. Nejvýznamnější alimentární intoxikace vlivem biogenních aminů jsou způsobeny histaminem, a to zejména po požití kontaminovaných sýrů a ryb (SANTOS, 1996). Nejvýznamnějším vazoaktivním (na cévu působícím) biogenním aminem je tyramin, který zvyšuje krevní tlak s možným důsledkem hypertenzní krize, migrenózních bolestí hlavy, krvácení do mozku a selhání srdce (KOMPRDA, 2004). Toxické působení histaminu v organizmu je umožněno jeho interakcí s příslušnými receptory na buněčných membránách. Důsledkem této interakce je: - dilatace hladké svaloviny periferních krevních cév (pokles tlaku, zrudnutí obličeje, bolesti hlavy) - kontrakce hladké svaloviny střeva (břišní křeče, průjmy, zvracení) - urticaria (kopřivka), zrudnutí očí, dechové potíže, třes (SANTOS, 1996). Toxický účinek histaminu závisí na velikosti přijatého množství, přítomnosti jiných aminů, aktivitě aminooxidáz a celkovém stavu fyziologie střeva (KOMPRDA, 2004). Střevo savců má k dispozici účinný detoxikační systém schopný metabolizovat běžné koncentrace biogenních aminů obsažených v potravinách. Za normálních podmínek jsou exogenní (s potravou přijaté) aminy po absorbci rychle detoxikovány působením aminooxidázy nebo konjugačním mechanizmem (SANTOS, 1996). Prekurzory hygienicky nejdůležitějších biogenních aminů, které mají toxikologický význam v potravinách, jsou následující: histidin tyrozin hydroxytryptofan tryptofan lyzin ornitin arginin arginin histamine tyramin serotonin tryptamin kadaverin putrescin spermin spermidin

17 3.1.5.1 Toxikologické dávky Toxikologické dávky biogenních aminů v potravinách je obtížné stanovit, protože významnou roli zde hrají na jedné straně individuální rozdíly mezi lidmi, na straně druhé přítomnost jiných aminů. Například pro histamin je toxická dávka asi 7 10 mg/100g potraviny, pro tyramin asi 2 8 mg/100g. Již dávka 3 mg fenyletylaminu může u citlivých osob způsobit migrénové bolesti hlavy. U pacientů, u kterých jsou aplikovány inhibitory monoaminoxidázy, je nebezpečná dávka 6 mg tyraminu. Za jednoznačně zdravotně nebezpečnou je pokládána dávka 1000 mg biogenního aminu/kg potraviny. Jak již bylo řečeno, velkou roli zde hraje obsah synergicky (v součinnosti zesíleně) působících aminů (SANTOS, 1996). Limit obsahu histaminu v potravinách byl obecně navržen ve výši 100 mg/kg a v alkoholických nápojích 2 mg/l. V rámci Evropské unie je používán limit průměrného obsahu histaminu v rybách ve výši 10 20 mg/100 g (KOMPRDA, 2004). 3.1.6 Metody stanovení biogenních aminů Jednou z možností pro stanovení obsahu biogenních aminů v potravinách je měření fluorescence po aplikaci na iontově výměnnou kolonu a derivatizace o-ftalaldehydem. Samozřejmě byla pro dané účely modifikována celá řada chromatografických metod (chromatografie na trnké vrstvě, kapalinová i plynová). Nejjednodušší a velice často používanou metodou je iontově výměnná chromatografie za použití automatického analyzátoru aminokyselin (SANTOS, 1996). Novější postup stanovení aminů využívá jednu z nejmodernějších technik současnosti kapilární zónovou elektroforézu (CZE). Analytický postup vychází z Schotten- Baumannovy reakce, při níž z aminů vznikají deriváty detekovatelné UV detektorem (KŘÍŽEK, PELIKÁNOVÁ, 1998). V posledních dvaceti letech byly vypracovány nové imunochemické techniky, které se vyznačují zvýšenou citlivostí a přesností stanovení neznámé koncentrace antigenu. Jsou založeny na principu tzv. saturační analýzy. Vysoké citlivosti se u těchto metod dosahuje tím, že antigen přítomný v analyzovaném vzorku soutěží ve vazbě na protilátku se vždy

18 stejným množstvím téhož antigenu vhodně označeného, např. radionuklidem (radioimunostanovení RIA), enzymem (enzymoimunostanovení EIA a ELISA) nebo jinou značkou (VODRÁŽKA, 1992). Výhodou imunologických metod (RIA, ELISA) je jejich rychlost a mnohem jednodušší instrumentace ve srovnání např. s vysokotlakovou kapalinovou chromatografií (SANTOS, 1996). Heterogenní enzymová imunoanalýza (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) může být provedena jako kompetitivní nebo nekompetitivní. U kompetitivní ELISA pak rozlišujeme dvě základní provedení přímé a nepřímé. Hodnota koncentrace analytu se zjišťuje z kalibrační křivky sestrojené pomocí standardů. Nejcitlivější provedení umožňují stanovit analyt v množství 10-12 až 10-9 g (ZEHNÁLEK, 2005). 3.2 Faktory ovlivňující aktivitu dekarboxylázy aminokyselin Biogenní aminy se v potravinách tvoří na základě dekarboxylační aktivity enzymů přítomných v potravinách nebo bakteriálních enzymů. Obsah biogenních aminů v potravinách tedy lze ovlivnit inhibicí aktivity uvedených enzymů a omezením bakteriálního růstu. Produkce biogenních aminů je v prvé řadě ovlivněna dostupností substrátu (bílkoviny, volné aminokyseliny). Přítomnost fermentovatelných sacharidů (glukóza) podporuje mikrobiální růst i aktivitu dekarboxylázy aminokyselin. Z hlediska produkce biogenních aminů je optimální koncentrace glukózy v substrátu 0,5 2,0 hmotnostních procent. Nejdůležitějším opatřením pro zábranu tvorby biogenních aminů v potravinách je aplikace vhodné teploty skladování. Produkce histaminu je při teplotě 10 C již velmi zpomalena ve srovnání s 20 C a při 5 C téměř ustává. Tvorba biogenních aminů v mořských rybách (makrela) je při 2 C až dvacetkrát nižší ve srovnání se skladováním při 10 C. Teplota při skladování ryb má též velký význam v souvislosti s dobou skladování. Při nízké teplotě (kolem0 C) je totiž pravděpodobné, že toxický limit obsahu biogenních aminů bude dosažen až dlouho poté, co v dané potravině (ryba) nastanou výrazné senzorické změny. Naopak při teplotě kolem 10 C bývá toxický limit dosahován dříve, než

19 může být spotřebitel varován změnou organoleptických vlastností. Histamin je termicky stabilní, pokud se v potravině vytvoří, pak ho nelze varem účinně inaktivovat. Optimální ph pro tvorbu histaminu nebo tyraminu v sýru je 5,0. Optimum pro konverzi histidinu na histamin působením bakterie Klebsiella pneumoniae u mořských ryb (tuňák) je však poněkud nižší (ph 4,0). Solení potravin inhibuje tvorbu biogenních aminů v nich. Histamin a zvláště tyramin mají osmoprotektivní vliv na bakterie. Proto u některých z nich dochází při vzrůstu koncentrace solí (NaCl, dusitany) v substrátu naopak k aktivaci dekarboxylázy tyrozinu (histidinu), a tedy růstu koncentrace příslušných biogenních aminů. Dostupnost kyslíku má také významný vliv na biosyntézu biogenních aminů. Např. Klebsiella pneumoniae syntetizuje v anaerobních podmínkách méně kadaverinu než v podmínkách aerobních. Naopak snížení redox potenciálu stimuluje produkci histaminu. Doba skladování také ovlivňuje tvorbu biogenních aminů. Při skladování masa (hovězího i vepřového) dochází jak při chladírenských teplotách, tak i při teplotě pokojové k nárůstu obsahu biogenních aminů. U fermentovaných masných výrobků (trvanlivé salámy) se koncentrace histaminu a tyraminu, dvou nejvýznamnějších biogenních aminů, zvyšuje s rostoucí dobou fermentace (SANTOS, 1996). 3.3 Mikroorganizmy produkující biogenní aminy Dekarboxylační aktivitu vykazují následující bakteriální rody: Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella. Z laktátových bakterií jsou to: Pediococcus, Streptococcus a Lactobacillus (SANTOS, 1996) - jeho druhy se vyskytují v mléce, kde vyvolávají přirozené kysání tj. zkvašování laktosy v kyselinu mléčnou, která zastavuje rozmnožování hnilobných bakterií a stafylokoků (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Optimum působení dekarboxylázy aminokyselin nastává při teplotě 20 37 C a při ph 5 7. Počet příslušných mikroorganizmů musí přitom být nejméně 10 6 /gram potraviny. Nejvýznamnějšími producenty histaminu jsou Proteus (Morganella) morganii, Kleibsiella pneumonae a některé kmeny druhu Hafnia alvei. Speciálně v rybách jsou to dále Kleibsiella oxytoca a Plesiomonas shigelloides. Ve fermentovaných rybích výrobcích jsou to Staphylococcus spp., Vibrio spp. a Pseudomonas spp. V některých vínech je

20 pravděpodobně producentem histaminu Pediococcus cerevisiae. Produkce histaminu kvasinkami nebyla dosud potvrzena. Histamin a tyrosin je tvořen Escherichia coli a Pseudomonas spp. Tyrosindekarboxylační aktivita (přednostní tvorba tyrosinu) v sýrech typu Čedar je připisována druhu Enterococcus faecalis. Ve fermentovaných sojových výrobcích je tato aktivita spojována s druhy Enterococcus faecium a Lactobacillus bulgaricus. Přehled mikroorganizmů podílejících se na produkci biogenních aminů v jednotlivých potravinách je uveden v tab.3. Hovoříme-li o bakteriální tvorbě biogenních aminů, je nutno mít na paměti, že některé bakteriální druhy působící v potravinách naopak biogenní aminy odbourávají. Jsou to především Pseudomonas spp., Serratia marcescens nebo Sarcina lutea. Posledně jmenované bakterie však samozřejmě nemohou sloužit k sanitaci potravin, protože jejich proteolytická aktivita je mnohem vyšší než aktivita enzymů redukujících aminy. Dříve než ke snížení toxické koncentrace biogenních aminů by tedy použitím těchto bakteríí došlo ke kažení potravin (SANTOS, 1996). Tabulka 3. Významné mikroorganizmy produkující biogenní aminy (VELÍŠEK, 2002). Potravina Mikroorganizmy Produkované aminy ryby Morganella morganii, Kleibsiella pneumonia, histamin, tyramin, Hafnia alvei, Proteus vulgaris, Clostridium kadaverin, putrescin, perfringens, Enterobacter aerogenes spermin, spermidin sýry Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L.casei, histamin, kadaverin, L. acidophilus, Streptococcus faecium putrescin, tyramin maso a masné Pediococcus sp., Lactobacillus sp., Pseudomonas sp., histamin, kadaverin výrobky Streptococcus sp., čeleď Enterobacteriaceae putrescin, tyramin

21 3.4 Nejvýznamnější bakterie s dekarboxylázovou aktivitou a metody jejich detekce Mezi nejvýznamnější bakteriální rody, které vykazují dekarboxylační aktivitu patří: Morganella, Kleibsiella, Enterococcus. Z laktátových bakterií jsou to: Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus a Streptococcus (SANTOS, 1996). 3.4.1 Screeningová plotnová metoda K detekci mikroorganizmů produkujících biogenní aminy se používají metody kvantitativní i kvalitativní. Nejčastější metodou je použití média, které obsahuje ph indikátor (bromokrezolovou červeň) a základní složky (pepton, masový extrakt, kvasničný extrakt, glukózu nebo sůl), tyto složky jsou prekurzory aminokyselin. Novější metodou pro detekci mikroorganizmů s dekarboxylázovou aktivitou (speciálně bakterií mléčného kvašení) je zlepšená screeningová plotnová metoda. Vylepšení této metody spočívá ve změně média, a to snížením koncentrace glukózy a NaCl, zvýšením pufračního efektu uhličitanem vápenatým a fosforečnanem draselným. Na zvýšení dekarboxylázové aktivity je použit pyridoxal-5fosfát. Tato metoda je díky své jednoduchosti a citlivosti vhodnou metodou pro určení přítomnosti výše zmíněných mikroorganizmů (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 1999). 3.4.2 Bakterie mléčného kvašení Mezi bakterie mléčného kvašení patří tyto rody: Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Bifidobacterium. Tvoří skupinu nepohyblivých, nesporulujících, grampozitivních koků a paliček, které fermentují sacharidy za fakultativních anaerobních podmínek a tvoří přitom hlavně kyselinu mléčnou (GÖRNER, VALÍK, 2004).

22 Mléčné bakterie můžeme dělit na dvě skupiny: - homofermentativní: ty zkvašují laktózu, glukózu i další monosacharidy a přeměňují je na jediný produkt - kyselinu mléčnou. - heterofermentativní: ty přeměňují fermentovaný sacharid na kyselinu mléčnou, ethanol, CO 2, v menších množstvích i na kyselinu octovou a mravenčí (KLABAN, 1999). Bakterie mléčného kvašení jsou v stálém soupeření s ostatními skupinami bakterií, které se v potravinách vyskytují. Ve svém fermentativním metabolizmu produkují látky a vytvářejí podmínky, které jsou pro jiné bakterie škodlivé. Konzervační vlastnosti bakterií mléčného kvašení a jejich fermentačních produktů se využívá na prodloužení trvanlivosti potravin živočišného i rostlinného původu. Bakterie mléčného kvašení vyžadují bohatý přísun živin a růstových faktorů, nemají schopnost samy syntetizovat určité růstové faktory - aminokyseliny, vitamíny skupiny B a jiné. V mezofilním kyselém mléce a v měkkých a polotvrdých sýrech převládají příslušníci rodu Lactococcus. V potravinách s vyšším obsahem soli bývá bohatě zastoupený rod Enterococcus. Bakterie mléčného kvašení jsou důležitou složkou společenstev technologicky významných mikroorganizmů, které se používají jako výrobní prostředky při fermentačních procesech v technologii kysaných a kvašených potravin a pochutin živočišného i rostlinného původu (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.4.2.1 Rod Lactobacillus Do rodu Lactobacillus zařazujeme mléčné bakterie tvořící na pevné kultivační půdě většinou delší, tenké tyčinky, často seskupené do řetízků. Jsou grampozitivní, nepohyblivé, fakultativně či striktně anaerobní a nemají schopnost tvořit spory. Mohou se množit v kultivačním prostředí s hodnotou ph 5. Jestliže však ph poklesne pod 4, růst většiny laktobacilů se zastavuje. Laktobacily mají schopnost zkvašovat cukry včetně laktózy. Mohou také tvořit H 2 O 2 inhibující rozvoj nežádoucí mikroflóry (KLABAN, 1999). Růst mezofilních laktobacilů může způsobit poruchy textury a vůně. Růst jiných laktobacilů

23 může způsobit přítomnost vysokých úrovní aminů zejména tyraminu a histaminu, obvykle v sýrech vyrobených ze syrového mléka (WALSTRA, et al., 1999). Do rodu Lactobacillus patří zejména tyto druhy: L. acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. plantarum, L. brevis (KLABAN, 1999). Růstové podmínky a výskyt Lactobacillů je uveden v tab.4. Kmeny různých druhů laktobacilů nacházejí uplatnění zejména v mlékárenství a v masném průmyslu. Zde mají významnou úlohu při nakládání masa v láku a při fermentaci tepelně neopracovaných uzenin. Nacházejí se také ve startovacích kulturách spolu se streptokoky, pediokoky, mikrokoky a stafylokoky. Při skladování masných produktů za chladírenských teplot se rozmnožují různí laktobacily. Tito laktobacily svou metabolickou činností chrání masné produkty proti kažení, které je způsobeno proteolytickými bakteriemi. Mohou však také způsobit nevítané chyby, jako kyselou chuť, jiné pachutě, tvorbu plynu, slizu a nebo zelenání (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tabulka 4. Růstové podmínky a výskyt laktobacilů (GÖRNER, VALÍK, 2004) Druh, spp. Růst při 15 C 45 C Prostředí, v kterém se převážně vyskytují a jiné charakteristiky L. delbreckii spp. delbrueckii - + Rostlinný materiál fermentovaný při vyšších teplotách (40-53 C) L. delbreckii spp. bulgaricus - + Jogurty a sýry L. acidophilus - + Intestinální trakt lidí a zvířat, ústní dutina lidí L. casei spp. casei + + Mléko, sýry, mléčné produkty, pekárenský kvas, kravský hnůj, siláž, intest. trakt a ústní dutina lidí L. plantarum + - Mléčné produkty, pekárenský kvas, kravský hnůj, siláž, intest. trakt a ústní dutina lidí, kvašená zelenina L. brevis + - Mléko, sýry, mléčné produkty, pekárenský kvas, siláž, intestinální trakt a ústní dutina lidí

24 3.4.2.1.1 Stanovení počtu bakterií rodu Lactobacillus Podle normy ČSN 56 0094 se při plotnové metodě stanovený objem vzorku (1 ml) nebo jeho ředění zalévá 13 ml diagnostické agarové půdy (MRS agar). Inokulované půdy se inkubují 5 dnů při 30 C nebo 3 dny při 37 C. Spočítají se všechny kolonie charakteristické pro laktobacily (bezbarvé kolonie o průměru 1 3 mm, čočkovitého tvaru) a vyčíslí se jejich počet v 1 g nebo 1 ml vzorku. Při metodě MPN (most probably number) se očkuje stanovené množství vzorku nebo jeho ředění do řady zkumavek s diagnostickou tekutou půdou. Inokulované půdy se inkubují 5 dnů při 30 C nebo 3 dny při 37 C. Hodnotí se počet pozitivních zkumavek a podle tabulky se určuje MPN bakterií rodu Lactobacillus. 3.4.2.1 Stanovení bakterií mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení mají komplex růstových nároků a tyto nároky musí být splněny kultivačním médiem. Pro pomnožení, kultivaci a izolaci navrhl živnou půdu De Man, Rogosa a Sharpe (MRS agar) v roce 1960. Živná půda MRS obsahuje polysorbát, acetát, hořčík a mangan, tyto prvky jsou růstovými faktory bakterií mléčného kvašení, a bohatou směs živných komponentů. Půda je složená z peptonu, masového extraktu, kvasničného extraktu, glukózy, hydroganfosforečnanu didraselného, Tween 80 (specifický růstový stimulant), kyselý citran amonný, octan sodný, síran hořečnatý a manganatý. Selektivita je dosažena nízkým ph (5,4) společně s 0,2 M koncentrací octanu sodného. (FORSYTHE, HAYES, 1998). Norma ČSN ISO 13721 vymezuje metodu pro stanovení počtu životaschopných bakterií mléčného kvašení v mase a masných výrobcích včetně drůbeže a to technikou počítání kolonií vykultivovaných na pevné půdě po třídenní inkubaci při 30 C. Do dvou Petriho misek se očkuje určený objem zkušebního vzorku (1 ml), je-li zkoušený výrobek tekutý nebo určený objem výchozí suspenze u ostatních výrobků.

25 Inokulum se zalévá 15 ml agaru MRS o ph 5,7. Inokulum se opatrně promíchá, Petriho misky se nechají ztuhnout. Inokulované plotny se obrátí dnem vzhůru a umístí se do inkubátoru s teplotou 30 C na dobu 72 hodin. Po uplynutí specifické doby se v každé misce spočítají kolonie, vyberou se misky, na nichž ze dvou po sobě následujících ředění vyrostlo méně než 300 kolonií. Stanovením počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení v potravinách a krmivech se zabývá norma ČSN ISO 15214. Připravují se dvojice ploten agaru MRS o ph 5,7. Používá se technika zalití inokula touto půdou nebo případně technika očkování roztěrem na povrch této půdy. Stejně se postupuje při očkování dalších dvojic Petriho misek desetinásobnými ředěními analytického vzorku nebo výchozí suspenze. Naočkované plotny se inkubují při 30 C 72 hodin. Počet mezofilních bakterií mléčného kvašení v 1 g nebo 1 ml analytického vzorku se vypočítá z počtu všech kolonií získaných po inkubaci na vybraných plotnách. 3.4.3 Rod Enterococcus Enterokoky zahrnují grampozitivní, nesporulující a katalasanegativní koky. Jsou rezistentní vůči vysokému ph, snášejí i hodnotu 8,5. Mohou růst v prostředí s 6,5% koncentrací NaCl a rovněž jak při nízké teplotě 10 C, tak i při 45 C (KLABAN, 1999). Některé druhy přežívají i předepsané pasterační teploty, proto jsou normální součástí mikroflóry pasterovaného mléka. Intenzivně fermentují sacharidy a někdy se zúčastňují tvorby aroma a chuti potravin. Připisuje se jim toxicita a tvorba biogenních aminů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Rezistence enterokoků k teplotám pasterace a jejich přizpůsobivost k různým substrátům a růstovým podmínkám vede k tomu, že je lze nalézt v potravinách vyrobených ze syrových surovin (mléko, maso), ale i v potravinách, které byly získány tepelným procesem. To znamená, že uvedené bakterie mají schopnost přežít podmínky výroby potravin. Mohou rovněž kontaminovat již hotové výrobky (KVASNIČKOVÁ, 2006).

26 Enterokoky jsou obyvateli střevního traktu člověka a zvířat. V hygienické mikrobiologii a vodohospodářské praxi se pokládají za indikátory fekálního znečištění nejen potravinářských výrobků, ale i pitné nebo povrchové vody (KLABAN, 1999). Jsou stálou součástí mikroflóry sýrů, syrových fermentovaných klobás a šunek. Důvodem jejich přítomnosti v těchto výrobcích je zvýšený obsah NaCl a tím snížená aktivita vody (GÖRNER, VALÍK, 2004). Mezi významné druhy patří Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Jde o grampozitivní koky, dobře rostou na krevním agaru, na kterém vytvářejí šedobílé kolonie. Jsou součástí mikroflóry tlustého střeva, patří mezi podmíněně patogenní mikroorganizmy. Mohou způsobovat infekce močových a žlučových cest. Některé kmeny E. faecalis se používají v sýrařství jako doplňková kultura, zejména při výrobě sýrů typu Čedar a dalších druhů tvrdých sýrů, kterým dodávají výraznější chuť (KLABAN, 1999). Enterokoky se vyskytují také v sýrech vyráběných tradičním způsobem, zejména v jižní Evropě (Španělsko, Portugalsko, Řecko, Itálie), kde je výchozí surovinou syrové nebo pasterované kozí, ovčí, buvolí či kravské mléko. Vysoké hodnoty enterokoků obvykle vyplývají z nedostatečných hygienických podmínek během výroby těchto sýrů a vedou k zhoršení senzorických vlastností některých druhů. Na druhé straně hrají v mnohých případech významnou roli při zrání a vývoji aroma (FRANZ, HOLZAPFEL, STILES, 1999). 3.4.3.1 Stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus Existuje mnoho dostupných technik sloužících k izolaci a stanovení počtu enterokoků. Většina těchto technik využívá antibiotika a octanu sodného jako selektivní činitele, často se používá vysokých inkubačních teplot (45 C). Obvykle používané médium je Slanetz-Bartley obsahující trifenyltetrazolium chlorid, který udílí koloniím červenou barvu. Inkubace je 37 C 48 hodin. Spočítají se všechny charakteristické kolonie pro enterokoky (červeně zbarvené, průměr 2 mm) a vyčíslí se jejich počet v 1 g nebo 1 ml vzorku (FORSYTHE, HAYES, 1998).

27 3.5 Izolace, kultivace a průkaz výše uvedených mikroorganizmů ve vytypované skupině potravin Nejčastější skupinou potravin, v kterých se nacházejí biogenní aminy a tedy i mikroorganizmy s dekarboxylázovou aktivitou, jsou fermentované potraviny živočišného původu. Hlavními původci aminů v masných výrobcích a sýrech bývají bakterie mléčného kvašení (převážně rod Lactobacillus) a bakterie rodu Enterococcus. 3.5.1 Izolace, kultivace a průkaz bakterií mléčného kvašení a enterokoků ve fermentovaných masných výrobcích Vysoká množství aminů mohou být nalezena ve fermentovaných potravinách vyrobených ze syrových materiálů s vysokým obsahem bílkovin jako jsou salámy a sušené klobásy. Vysoká koncetrace putrescinu a přítomnost jiných aminů bývá závislá také na čerstvosti masa (SUZZI, GARDINI, 2003). Mikroflóra přirozeně se vyskytující v syrových materiálech má velký vliv na tvorbu biogenních aminů během zrání, proto vhodný výběr kvalitních surovin může minimalizovat počet bakterií produkujících aminy. Tvorba biogenních aminů může být také ovlivněna technologickými podmínkami při výrobě klobás. Důležitým faktorem pro prevenci přitomnosti biogenních aminů je přídavek vhodné startovací kultury. Startovací kultury se skládají z bakterií mléčného kvašení a mikrokoků (BOVER-SID, et al., 1999). Některé z těchto bakterií mohou vykazovat dekarboxylázovou aktivitu a mohou tedy tvořit biogenní aminy - Lactobacillus buchneri, L. brevis (SANTOS, 1998). Ke stanovení bakterií mléčného kvašení ve fermentovaných masných produktech se odebírá 10 gramů vzorku, který se homogenizuje 2 minuty v tryptonové vodě. Připravená desetinná ředění se zalévají MRS agarem do dvou Petriho misek. Inkubace se provádí při teplotě 30 C 48-72 hodin.

28 Ke stanovení nejpravděpodobnějšího počtu výše uvedených bakterií se používá médium obsahující kvasničný extrakt, trypton, glukózu, vodu, bromokrezolovou červeň nebo modř, ph je 5,5. Za pozitivní výsledek se považuje změna barvy ve zkumavkách ze žluté na červenou (SANTOS, 1998). 3.5.2 Izolace, kultivace a průkaz bakterií mléčného kvašení a enterokoků v sýrech typu Čedar a Gouda Tradiční sýry typu Čedar nebo Gouda jsou většinou vyráběny za nevhodných hygienických podmínek a také výrobními postupy, které jsou u každého výrobce sýrů jiné. Významnou roli zde také hraje přirozená mikroflóra, která ovlivňuje organoleptické vlastnosti a bezpečnost produktu. Polotvrdé sýry jsou ideálním prostředím pro tvorbu proteolytických produktů volných aminokyselin a biogenních aminů, což je přímo ovlivněno aktivitou bakterií, ph, koncentrací solí a nepřímo vodní aktivitou, teplotou skladování a zrajícím časem (ÖNER, SAGDIC, SIMSEK, 2004). Ke stanovení bakterií mléčného kvašení a enterokoků v polotvrdých sýrech se odebírá 10 gramů vzorku, který se homogenizuje ve sterilní peptonové vodě. Připravená desetinná ředění se zalévají selektivním médiem (pro laktobacily je to MRS agar, ph 5,4 a pro enterokoky Slanetz-Bartley agar) do dvou Petriho misek. Inkubace se provádí u laktobacilů při teplotě 30 C 5 dnů v anaerobních podmínkách a u enterokoků při 37 C 48 hodin (MARTUSCELLI, et al., 2005). Enterokoky můžeme také očkovat na KAA agaru (Kanamycin Aesculin Azide agar) s inkubací 37 C 24 hodin (REA, et al., 2004). Průkaz výše uvedených mikroorganizmů v sýru byl proveden pomocí média, určeného k detekci dekarboxylázy. Toto médium je složeno z tryptonu, kvasničného extraktu, NaCl, glukózy, bromokrezolové červeně, agaru, histidinu nebo tyraminu a ph je 5,5 (LEUSCHNER, KURIHARA, HAMMES, 1999).

29 4 ZÁVĚR Biogenní aminy jsou nízkomolekulární organické dusíkaté báze, které jsou přítomny ve všech živých organizmech. Proces jejich vzniku je katalyzován zpravidla mikrobiálními enzymy a tvorba těchto látek postupuje od bílkovin přes peptidy k aminokyselinám, jejichž dekarboxylace vede ke vzniku aminů. Ke stanovení biogenních aminů se využívají zejména chromatografické metody. Nejobvyklejší je stanovení pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Také lze použít imunochemické metody (RIA, ELISA). Mezi nejvýznamnější bakteriální rody, které vykazují dekarboxylační aktivitu patří: Morganella, Kleibsiella, Enterococcus. Z laktátových bakterií jsou to: Lactobacillus, Pediococcus, Staphylococcus a Streptococcus. Výskyt biologicky aktivních aminů lze očekávat prakticky ve všech potravinách, které obsahují proteiny nebo volné aminokyseliny a jsou vystaveny podmínkám umožňujícím mikrobiální aktivitu. Mezi tyto potraviny patří především výrobky z ryb a fermentované potraviny živočišného původu. Nejvýznamnější skupinou fermentovaných potravin jsou z hlediska obsahu biogenních aminů sýry a masné výrobky. Při jejich zrání dochází k výrazné tvorbě biogenních aminů v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Hlavními původci aminů v masných výrobcích a sýrech bývají bakterie mléčného kvašení (převážně rod Lactobacillus) a bakterie rodu Enterococcus. Izolace, kultivace a stanovení počtu těchto mikroorganizmů se provádí pomocí technických norem ČSN 56 0094, ČSN ISO 13721, ČSN ISO 15214. K průkazu mikroorganizmů s dekarboxylázovou aktivitou se nejčastěji využívá médium, které navrhli S.Bover-Cid a W.H Holzapfel.

30 LITERATURA BOVER-CID, S., HOLZAPFEL, W.H.: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International J. of Food Microbiology, 53, 1999, s.33-41 BOVER-CID, S., IZQUIERDO-PULIDO, M., VIDAL-CAROU, M.: Effect of proteolytic starter cultures of Staphylococcus spp. on biogenic amine formation during ripening of dry fermented sausages. International J. of Food Microbiology, 46, 1999, s.95-104 FORSYTHE, S.J., HAYES, P.R.: Food hygiene, microbiology and HACCP. An Aspen Publishers, Maryland 1998, 449s., ISBN 0-7514-0450-0 FRANZ, CH., HOLZAPFEL, W.H., STILES, M.E.: Enterococci at the crossroads of food safety. International J. of Food Microbiology, 47, 1999, s.1-24 GÖRNER, F., VALÍK, L.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Malé centrum, Bratislava 2004, 528s., ISBN 80-967064-9-7 KLABAN, V.: Svět mikrobů, malý mikrobiologický slovník. Gaudeamus, Hradec Králové 1999, 303s., ISBN 80-7041-639-4 KOMPRDA, T.: Obecná hygiena potravin. MZLU, Brno 2004, 104s., ISBN 80-7157-757-x KŘÍŽEK, M., KALAČ, P.: Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě. Czech J. Food Sci., 16, 1998, s.151-159 KŘÍŽEK, M., PELIKÁNOVÁ, T.: Determination of seven biogenic amines in foods by micellar electrokinetic capillary chromatography. J. Chromatogr. A, 815, 1998, s.243-250

31 KVASNIČKOVÁ, A.: http://www.bezpecnostpotravin.cz/htm. Využití enterokoků v potravinářské výrobě. 28.1. 2006 Praha LEUSCHNER, R.G.K., KURIHARA, R., HAMMES, W.P.: Formation of biogenic amines by proteolytic enterococci during cheese ripening. J. Sci. Food Agriculture, 79, 1999, s.1141-1144 MARTUSCELLI, M., et al.: Production of biogenic amines during the rippening of Pecorino Abruzzese cheese. International Dairy Journal, 15, 2005, s.571-578 MURRAY, R., et al.: Harperova biochemie. H&H, Jinočany 1998, 872s., ISBN 80-85787-38-5 ÖNER, Z., SAGDIC, O., SIMSEK, B.: Lactic acid bacteria profiles and tyramine and tryptamine contents of Turkish tulum cheeses. Eur Food Res. Technology, 219, 2004, s.455-459 SANTOS, S.: Amino acid decarboxylase capability of microorganisms isolated in Spanish fermented meat products. International J. of Food Microbiology, 39, 1998, s.227-230 SANTOS, S.: Biogenic amines: their importance in foods. International J. of Food Microbiology, 29, 1996, s.213-231 STRAKA, I., MALOTA, L.: Chemické vyšetření masa. Ossis, Tábor 2006, 104s., ISBN 80-86659-09-7 SUZZI, G., GARDINI, F.: Biogenic amines in dry fermented sausages. International J. of Food Microbiology, 88, 2003, s.41-54 ŠILHÁNKOVÁ, L.: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha 2002, 363s., ISBN 80-85605-71-6

32 VELÍŠEK, J.: Chemie potravin III. Ossis, Tábor 2002, 362s., ISBN 80-86659-02-X VODRÁŽKA, Z.: Biochemie I. Academia, Praha 1992, 184s., ISBN 80-200-0438-6 WALSTRA, P., et al.: Dairy technology: Principles of Milk Properties and Processes. Marcel Decker, New York 1999, 727s., ISBN 0-8247-0228-X ZEHNÁLEK, J.: Biochemie cvičení. MZLU, Brno 2005, 72s., ISBN 80-7157-867-3 ČSN 56 0094: Potravinářské výrobky Stanovení počtu bakterií rodu Lactobacillus. Český normalizační institut, Praha 1988 ČSN ISO 13721: Maso a masné výrobky Stanovení počtu bakterií mléčného kvašení Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C. Český normalizační institut, Praha 1998 ČSN ISO 15214: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu mezofilních bakterií mléčného kvašení Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C. Český normalizační institut, Praha 2000

33 PŘÍLOHA Obr. 1.: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus kultivace na MRS agaru Obr. 2.: Enterococcus faecalis kultivace na žluč-eskulinovém agaru