30Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

30Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta SROVNÁNÍ PŘÍMÉHO MĚŘENÍ LDL-CHOLESTEROLU A VÝPOČTU LDL-CHOLESTEROLU V ZÁVISLOSTI NA HLADINĚ TRIGLYCERIDŮ Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Autor: Veronika Rašková Brno, duben 2011

Jméno a příjmení autora: Veronika Rašková Název bakalářské práce: Srovnání přímého měření LDL-cholesterolu a výpočtu LDL-cholesterolu v závislosti na hladině triglyceridů Pracoviště: Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice u sv. Anny, Brno Vedoucí bakalářské práce: doc. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Rok obhajoby bakalářské práce: 2011 Souhrn: Ve své bakalářské práci se zabývám stanovením LDL-cholesterolu dvěma metodami, přímým měřením a výpočtem. Cílem mé práce je porovnat tyto dvě metody v závislosti na hladině triglyceridů. Obě metody stanovení LDL-cholesterolu jsem proto srovnávala jak v rozmezí fyziologických, tak i patologických hodnot. Klíčová slova: cholesterol, lipoproteiny, výpočet dle Friedewalda, enzymatické stanovení Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. MUDr. Vladimíra Sošky, Csc. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne......

Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucímu své bakalářské práce doc. MUDr. Vladimíru Soškovi, CSc. za odborné vedení, věcné připomínky, vstřícnost, ochotu a čas. Dále bych chtěla poděkovat RNDr. Haně Dobrovolné za pomoc při zpracování praktické části své práce.

Pouţité symboly a zkratky ADP adenosindifosfát Apo apoprotein (apolipoprotein) ATP adenosintrifosfát CETP cholesterol ester transfer protein DM diabetes mellitus DSBmT N,N-bis(4-sulfobutyl-m-toluidindisodium) ELFO elektroforéza GK glycerolkináza GPO glycerolfosfátoxidáza HDL lipoproteiny o vysoké hustotě (high-density lipoproteins) CHE cholesterolesteráza CM chylomikrony CHOD cholesteroloxidáza IDL lipoproteiny o střední hustotě (intermediate-density lipoproteins) ID-MS izotopová diluce s detekcí hmotnostním spektrometrem KVO kardiovaskulární onemocnění LCAT lecitin-cholesterol acyltransferáza LDL lipoproteiny o nízké hustotě (low-density lipoproteins) LIS laboratorní informační systém LP lipoproteiny Lp (a) lipoprotein a LPL lipoproteinová lipáza MAU mikroalbuminurie MK mastná kyselina POD peroxidáza SEKK Systém externí kontroly kvality TG triglyceridy (triacylglyceroly) VLDL lipoproteiny o velmi nízké hustotě (very-low density lipoproteins)

Obsah A OBECNÁ ČÁST... 8 1 ÚVOD DO STUDOVANÉ PROBLEMATIKY... 8 1.1 Ateroskleróza... 8 1.1.1 Fáze vývoje aterosklerózy... 10 1.2 Cholesterol... 10 1.2.1 Chemická struktura a charakteristika... 10 1.2.2 Syntéza, metabolismus, vylučování... 11 1.2.3 Transport cholesterolu... 11 1.2.4 Koncentrace cholesterolu... 11 1.2.5 Indikace k vyšetření celkového cholesterolu... 12 1.2.6 Názvosloví cholesterolu podle lipoproteinů, které jej přenáší... 12 1.2.6.1 LDL-cholesterol... 12 1.2.6.2 HDL-cholesterol... 12 1.3 Lipoproteiny... 13 1.3.1 Struktura a charakteristika lipoproteinů... 13 1.3.2 Rozdělení lipoproteinů... 13 1.3.3 Chylomikra... 14 1.3.4 Lipoproteiny o velmi nízké hustotě... 14 1.3.5 Lipoproteiny o střední hustotě... 14 1.3.6 Lipoproteiny o nízké hustotě... 15 1.3.7 Lipoproteiny o vysoké hustotě... 16 1.3.8 Lipoprotein Lp(a)... 16 1.4 Dyslipoproteinémie... 17 1.4.1 Vrozené dyslipoproteinémie se zvýšenou koncentrací LDL-cholesterolu... 17 1.4.1.1 Familiární hypercholesterolemie... 17 1.4.1.2 Familiární defekt apolipoproteinu B-100... 17 1.4.1.3 Familiární kombinovaná hyperlipidemie... 17 1.5 Aterogenní indexy a výpočty... 17 1.5.1 Výpočet non-hdl cholesterolu... 17 1.5.2 Index celkový cholesterol/hdl-cholesterol... 17 2 LITERÁRNÍ REŠERŠE K UVEDENÉMU TÉMATU... 18 2.1 Výpočet LDL-cholesterolu dle Friedewalda... 18 2.2 Stanovení LDL-cholesterolu přímou metodou... 19 2.3 Klinické studie... 20 3 ZHODNOCENÍ SOUČASNÉHO STAVU STUDOVANÉ PROBLEMATIKY... 23 B SPECIÁLNÍ ČÁST... 24 4 FORMULACE CÍLŮ PRÁCE... 24 5 POPIS METODIKY... 25 6 POPIS SOUBORŮ... 26 6.1 Biologický materiál, preanalytická fáze... 26 7 POPIS POUŢITÝCH ANALYTICKÝCH METOD... 27 7.1 Stanovení LDL-cholesterolu přímou metodou... 27 7.1.1 Použití a princip testu... 27 7.1.2 Princip reakce... 27 7.1.3 Reagencie... 27 7.1.4 Kalibrace... 28 7.1.5 Kontrola kvality... 28 7.1.6 Pracovní rozsah... 28

7.2 Stanovení LDL-cholesterolu výpočtem... 28 7.2.1 Stanovení celkového cholesterolu... 28 7.2.1.1 Použití a princip testu... 28 7.2.1.2 Princip reakce... 29 7.2.1.3 Reagencie... 29 7.2.1.4 Kalibrace... 29 7.2.1.5 Kontrola kvality... 29 7.2.1.6 Pracovní rozsah... 30 7.2.2 Stanovení HDL-cholesterolu... 30 7.2.2.1 Použití a princip testu... 30 7.2.2.2 Princip reakce... 30 7.2.2.3 Reagencie... 30 7.2.2.4 Kalibrace... 31 7.2.2.5 Kontrola kvality... 31 7.2.2.6 Pracovní rozsah... 31 7.2.3 Stanovení triglyceridů... 31 7.2.3.1 Použití a princip testu... 31 7.2.3.2 Princip reakce... 32 7.2.3.3 Reagencie... 32 7.2.3.4 Kalibrace... 32 7.2.3.5.Kontrola kvality... 32 7.2.3.6 Pracovní rozsah... 33 7.3 Nejistoty použitých metod... 33 7.4 Interference použitých metod... 33 8 POPIS POUŢITÉ PŘÍSTROJOVÉ TECHNIKY... 35 9 POPIS POUŢITÝCH STATISTICKÝCH METOD... 35 10 VÝSLEDKY... 36 10.1 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG do 0,99 mmol/l... 37 10.2 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 1,00-1,99 mmol/l... 39 10.3 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 2,00-2,99 mmol/l... 41 10.4 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 3,00-4,50 mmol/l... 43 10.5 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 4,51-5,99 mmol/l... 45 10.6 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 6,00-11,99 mmol/l... 47 10.7 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG > 12,00 mmol/l... 49 11 VYHODNOCENÍ... 51 12 ZÁVĚR... 53 13 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY A ELEKTRONICKÝCH ZDROJŮ... 54

A Obecná část 1 Úvod do studované problematiky Zvýšená koncentrace LDL-cholesterolu je jedním z hlavních rizikových faktorů pro rozvoj kardiovaskulárních onemocnění. Pro jeho stanovení se dnes používají dva rutinní způsoby přímé stanovení a výpočet pomocí Friedewaldovy rovnice. Oba přístupy ke stanovení LDLcholesterolu mají své klady i zápory, jedním z hlavních limitujících faktorů je koncentrace triglyceridů. Ve své práci proto porovnávám stanovení koncentrace LDL-cholesterolu oběma metodami v závislosti právě na hladině triglyceridů (TG). 1.1 Ateroskleróza Ateroskleróza je dlouhotrvající onemocnění. Její příčinou je ukládání cholesterolu ve stěnách cév. Stěny cév se zužují, snižuje se jejich pružnost a dochází ke snížení průtoku krve. Postižené tkáně pak mohou trpět nedostatkem kyslíku a může dojít k jejich poškození [13]. Ateroskleróza je příčinou kardiovaskulárních onemocnění (KVO). Riziko KVO se zvyšuje se zvýšenou koncentrací celkového a LDL-cholesterolu (graf 1) [18]. Graf 1 Riziko ischemické choroby srdeční v závislosti na koncentraci celkového cholesterolu [18] Legenda: ICHS - ischemická choroba srdeční 8

Rizikových faktorů pro vznik tohoto onemocnění je identifikováno již více než 200. Mezi ty základní patří: mužské pohlaví, vyšší věk, kouření, hypertenze, diabetes mellitus, zvýšené hladiny celkového cholesterolu a LDL-cholesterolu a snížená koncentrace HDL-cholesterolu. Důležitou roli hraje životní styl i genetika [4,13]. Zhodnocení celkového rizika fatální kardiovaskulární příhody se provádí pomocí tabulek SCORE pro Českou republiku (tab. 1) [24]. Tab. 1 Tabulka kardiovaskulárního rizika [24] 9

1.1.1 Fáze vývoje aterosklerózy Ateroskleróza probíhá desítky let aniž by se musela klinicky projevit [4]. 1. Časná fáze a) izolované pěnové buňky b) tukové proužky - nahromaděné pěnové buňky c) intermediární léze d) aterom - vznik lipidového jádra, nahromadění lipidů 2. Pozdní fáze a) fibroaterom - buňky hladkého svalstva proliferují a vytváří vazivovou vrstvu nad lipidovým jádrem b) komplikované léze - kalcifikace, ulcerace, vznik trombu [14] 1.2 Cholesterol 1.2.1 Chemická struktura a charakteristika Cholesterol je látka steroidní povahy tvořená 27 uhlíky (obr. 1). V organismu jej najdeme ve volné nebo esterifikované podobě. Celkové množství cholesterolu v těle je 260 mmol (asi 100 g) a je nerovnoměrně rozložený. Je základním stavebním kamenem buněčných membrán, myelinových pochev a vnějšího obalu plazmatických lipoproteinů (LP). Cholesterol potřebujeme také pro tvorbu hormonů, žlučových kyselin a vitamínu D (obr. 2) [4,6,23]. Obr. 1 Cholesterol [7] 10

Obr. 2 Přeměny cholesterolu v těle [10] 1.2.2 Syntéza, metabolismus, vylučování Asi polovina cholesterolu je přijímaná potravou (živočišné výrobky). Druhá polovina je tvořena v játrech. Při nedostatku cholesterolu v těle jsou schopny jeho syntézy všechny buňky, především jaterní, ale také střevní. Syntéza probíhá na hladkém endoplazmatickém retikulu. Primárním zdrojem pro tvorbu cholesterolu je acetyl-coa vznikající β-oxidací v mitochondriích, který je sledem 30 chemických reakcí přeměněn na cholesterol. Syntéza je regulována množstvím cholesterolu, který je přítomen v buňce. Denně se vytvoří asi 1g cholesterolu [4,6,10]. Cholesterol je degradován a vylučován játry. Ta jej přeměňují na žlučové kyseliny či odvádí přímo do žluče. Střevní bakterie cholesterol hydrogenují na koprostanol a ten je vyloučen stolicí. Denně je takto odstraněn asi 1g [4,6]. 1.2.3 Transport cholesterolu Cholesterol je z jater a ze střeva do periferní krve a zpět transportován v lipoproteinech. Součástí LP jsou kromě cholesterolu také fosfolipidy, bílkoviny apolipoproteiny (Apo) a TG [3]. 1.2.4 Koncentrace cholesterolu Doporučené koncentrace celkového cholesterolu ukazuje tabulka 2. Tab. 2 Doporučené hladiny celkového cholesterolu [24] populace obecně bez KVO, riziko 5%, DM 1 s MAU, DM 2 s KVO celkový cholesterol < 5 mmol/l < 4,5 mmol/l < 4 mmol/l Legenda: KVO - kardiovaskulární onemocnění; DM 1 - diabetes mellitus typ 1; DM 2 - diabetes mellitus typ 2; MAU - mikroalbuminurie 11

1.2.5 Indikace k vyšetření celkového cholesterolu Celkový cholesterol má být vyšetřen 1x za 5 let u osob od 18 let. Je-li koncentrace > 5 mmol/l a je-li současně zvýšené riziko kardiovaskulárních onemocnění, je vhodné vyšetřit HDL-cholesterol, TG a LDL-cholesterol [18,24]. 1.2.6 Názvosloví cholesterolu podle lipoproteinů, které jej přenáší Podle toho, v jakých LP je cholesterol přenášen, rozlišujeme LDL-cholesterol, HDLcholesterol, VLDL-cholesterol, IDL-cholesterol a cholesterol nesený v chylomikronech (CM) [5]. 1.2.6.1 LDL-cholesterol Je to cholesterol přenášený v LP o nízké hustotě. Tyto LP transportují cholesterol z jater do periferních tkání, většina těchto LP je vychytána opět játry. Zvýšená koncentrace je považována za rizikový faktor aterosklerózy. Doporučená hodnota pro zdravou populaci je < 3,0 mmol/l (tab. 3). Hladina LDL-cholesterolu může být zvýšená například vlivem špatného životního stylu, při některých vrozených hyperlipoproteinémiích a při sekundárních hyperlipoproteinémiích (např. při obezitě, hypotyreóze, nefrotickém syndromu) [5,16,18]. Tab.3 Doporučené hladiny LDL-cholesterolu [24] populace obecně bez KVO, riziko 5%, DM 1 s MAU, DM 2 s KVO LDL- cholesterol < 3 mmol/l < 2,5 mmol/l < 2 mmol/l Legenda: KVO - kardiovaskulární onemocnění; DM 1 - diabetes mellitus typ 1; DM 2 - diabetes mellitus typ 2; MAU - mikroalbuminurie 1.2.6.2 HDL-cholesterol Je cholesterol přenášený v LP o vysoké hustotě. Tyto LP transportují cholesterol z periferních tkání do jater, kde je vyloučen do žluče. Doporučená hodnota je > 1,0 mmol/l pro muže a > 1,2mmol/l pro ženy. Zvýšení koncentrace HDL znamená nižší riziko rozvoje aterosklerózy, protože HDL částice se účastní reverzního transportu cholesterolu a také brání oxidaci částic LDL. Koncentrace HDL v krvi stoupá např. při pravidelném pohybu (5x týdně 30 minut) a po požití malých dávek alkoholu (0,5 l piva nebo 2 dcl vína) [5,13,16,24]. 12

1.3 Lipoproteiny 1.3.1 Struktura a charakteristika lipoproteinů Lipoproteiny jsou částice, které slouží k transportu hydrofóbních lipidů v plazmě [13]. Jsou to struktury podobné micelám. Mají kulovitý tvar. Skládají se z jádra a obalu. Jádro je tvořeno TG a estery cholesterolu. Jednovrstevný povrch tvoří neesterifikovaný cholesterol a fosfolipidy, do kterých jsou zanořeny bílkovinné nosiče lipidů apoproteiny (obr. 3). Tyto složky jsou vázány hydrofóbními vazbami [4,14]. Obr. 3 Obecná struktura lipoproteinů [23] 1.3.2 Rozdělení lipoproteinů Podle hustoty dělíme LP na 5 skupin: 1. chylomikrony (0,93 g/cm 3 ) 2. VLDL (1,006-1,019 g/cm 3 ) 3. IDL (1,00-1,019 g/cm 3 ) 4. LDL (1,019-1,063 g/cm 3 ) 5. HDL (1,063-1,21 g/cm 3 ) [4] Podle elektroforetického rozdělení na 5 skupin: 1.chylomikrony (na startu) 2.β-lipoproteiny (LDL) 3.pás mezi β a pre-β (Lp (a), IDL) 4.pre -β lipoproteiny (VLDL) 5.α-lipoproteiny (HDL) [4] 13

Lipoproteiny lze rozdělit pomocí ultracentrifugace nebo pomocí elektroforézy. Další možností separace LP je rozdělovací tenkovrstevná chromatografie [5]. 1.3.3 Chylomikra Chylomikra jsou větší částice s nízkou hustotou. Jsou tvořeny převážně TG, cholesterolem a fosfolipidy. Slouží k přenosu TG ze střeva do tkání (zdroj energie pro svalové buňky) a k přenosu cholesterolu do jater. V plazmě se jejich koncentrace zvyšuje po jídle a plazma odebraná po jídle je proto chylózní (mléčně zkalená). Nejvyšší koncentrace CM je 3-6 hod po jídle. Po 12 až 14 hodinovém lačnění by neměly být prokazatelné v krvi. Zvýšená koncentrace CM bývá spojena s vysokou koncentrací TG, ale není rizikovým faktorem aterosklerózy. Zvýšené hladiny se objevují např. u dekompenzovaného diabetu, alkoholismu, při jaterní steatóze a u pacientů, kteří nedodrželi lačnění před vyšetřením [4,6,13,23]. Syntéza CM probíhá v buňkách střevní sliznice. Jejich vyplavování do krve závisí na syntéze Apo B-48. V kapilárách svalové a tukové tkáně jsou TG degradovány působením lipoproteinové lipázy (LPL) na glycerol a mastné kyseliny (MK) a vznikají tzv. chylomikronové zbytky (remnanty). Ty jsou vázány na specifické receptory hepatocytů a fibroblastů. Remnanta CM jsou silně aterogenní a cytotoxické [4,18]. 1.3.4 Lipoproteiny o velmi nízké hustotě VLDL vznikají v játrech. Pro jejich syntézu je nezbytný apo B-100 [4]. VLDL se podílí na transportu TG z jater do tkání (obr. 4). V krevních kapilárách svalové a tukové tkáně jsou TG účinkem LPL degradovány na MK a glycerol a z částice VLDL vzniká částice IDL [18]. Zvýšená koncentrace VLDL je rizikovým faktorem aterosklerózy [18]. 1.3.5 Lipoproteiny o střední hustotě IDL vznikají katabolismem VLDL. Skládají se z TG, volného i esterifikovaného cholesterolu, fosfolipidů a volných MK. Jsou vychytávány receptory v játrech nebo jsou degradovány na LDL (obr. 4) [4,18]. Dlouhodobě zvýšená koncentrace IDL je rizikovým faktorem kardiovaskulárních onemocnění [18]. 14

1.3.6 Lipoproteiny o nízké hustotě LDL vznikají katabolismem IDL tak, že jaterní lipáza hydrolyzuje v IDL triglyceridy (obr. 4). LDL částice jsou tvořeny cholesterolem volným i esterifikovaným (až 80 %) a fosfolipidy. Obsah TG je zanedbatelný. Hlavní funkcí LDL je přenos cholesterolu periferním buňkám [13,14]. Asi 75 % těchto LP je vychytáváno játry, zbytek pak periferními buňkami přes specifické receptory (ligandou je Apo B-100). Takto získaný cholesterol pak buňka využívá k syntéze buněčné membrány nebo ho ukládá do zásoby. LDL receptory byly objeveny roku 1985 J.Goldsteinem a M. Brownem. Tyto receptory slouží pro udržování cholesterolové homeostázy a zpětnovazebným mechanismem. zabraňují hromadění cholesterolu v buňce [13,14]. LDL částice také podléhají chemickým přeměnám jako je oxidace nebo glykace. Tyto procesy probíhají v mezibuněčné hmotě a podléhá jim převážně Apo B-100. Takto modifikované LDL částice jsou vysoce aterogenní. Protože nejsou rozpoznány LDL receptory, bývají odstraňovány tzv. scavengerovými receptory. Ty se nachází na makrofázích a v buňkách endotelu cév. Z makrofágů s pohlcenými modifikovanými LDL částicemi se pak stávají pěnové buňky a jejich vznik je počátkem aterosklerotického procesu [13,18]. Při degradaci velkých VLDL mohou vznikat také malé denzní LDL (tzv. LDL 3 ). Ty snadno pronikají endotelem cév, podléhají oxidaci a mají sníženou afinitu k LDL receptorům. Jsou proto významné pro vznik aterosklerózy. LDL 3 nesou 1 molekulu Apo B-100, ale méně cholesterolu. Výskyt malých denzních LDL je spojen se zvýšenou koncentrací TG [18]. 15

Obr. 4 Metabolismus VLDL-IDL-LDL [18] Legenda: Apo - apolipoprotein; HDL - lipoproteiny o vysoké hustotě; VLDL - lipoproteiny o velmi nízké hustotě; IDL - lipoproteiny o střední hustotě; LDL - lipoproteiny o nízké hustotě 1.3.7 Lipoproteiny o vysoké hustotě HDL se tvoří převážně v játrech a střevě jako tzv. nascentní částice. Částice mají diskovitý tvar a obsahují dvojvrstvu fosfolipidů a apoproteiny A-I, A-II, C a E. Apoproteiny jsou uspořádány do podoby α-helixů [14]. HDL slouží k reverznímu transportu volného cholesterolu z tkání do jater. Účinkem LCAT je v HDL cholesterol esterifikován. Část esterifikovaného cholesterolu je poté přenášena do jiných lipoproteinových částic pomocí transportní bílkoviny CETP a část zpátky do jater [18]. 1.3.8 Lipoprotein Lp(a) Tento LP je velmi podobný LDL. Na jeho povrchu se nachází Apo B-100 a na něj je disulfidickou vazbou připojen Apo (a). Jeho molekulová hmotnost je 5 400 000. Lp (a) inhibuje fibrinolýzu [4]. Normální hodnota je < 0,3 g/l [4]. 16

1.4 Dyslipoproteinémie Dyslipoproteinémie jsou metabolické poruchy charakterizované zvýšenou koncentrací lipidů či LP v krvi v důsledku odlišné skladby, složení a metabolismu LP a Apo. Na jejich vzniku se podílí genetika, vnější vlivy (kouření, strava) nebo jiná onemocnění [4,13,14,18]. 1.4.1 Vrozené dyslipoproteinémie se zvýšenou koncentrací LDL-cholesterolu 1.4.1.1 Familiární hypercholesterolemie Je vrozená porucha genu pro LDL receptor. Těchto receptorů vzniká méně nebo jsou nefunkční (u heterozygotů) nebo se netvoří vůbec (u homozygotů). Hladina LDLcholesterolu je výrazně zvýšená a zvyšuje se i riziko aterosklerózy [4,13]. 1.4.1.2 Familiární defekt apolipoproteinu B-100 Tvoří se defektní Apo B-100. Není schopen vázat se na LDL receptor a umožnit tak průnik LDL-cholesterolu do buňky [4]. 1.4.1.3 Familiární kombinovaná hyperlipidemie Dochází ke zvýšení koncentrace LDL vlivem zvýšené tvorby Apo B-100 a VLDL [4]. 1.5 Aterogenní indexy a výpočty Tyto indexy mají zpřesnit stanovení rizika aterosklerózy [18]. 1.5.1 Výpočet non-hdl cholesterolu Zahrnuje všechny aterogenní LP (LDL, VLDL, IDL, CM). Doporučená hodnota je do 3,8 mmol/l pro osoby v primární prevenci KVO. Může nahrazovat výpočet LDL-cholesterolu při hodnotách TG > 4,5 mmol/l [13,18]. Vypočítá se: Non-HDL cholesterol = celkový cholesterol HDL-cholesterol [18] 1.5.2 Index celkový cholesterol/hdl-cholesterol Optimální hodnota má být < 5 mmol/l. Tento index bere v úvahu to, že výsledná výše rizika je dána nejen celkovým cholesterolem, ale také HDL-cholesterolem, který je negativním rizikovým faktorem. Současné zvýšení celkového i HDL- cholesterolu nemusí znamenat vyšší riziko KVO [18]. 17

2 Literární rešerše k uvedenému tématu 2.1 Výpočet LDL-cholesterolu dle Friedewalda Protože přímé měření LDL-cholesterolu dříve nebylo dostupné a stanovení LDLcholesterolu pomocí ultracentrifugace je časově, finančně i přístrojově náročné, hladina LDL-cholesterolu se stanovovala výpočtem, tzv. Friedewaldovou rovnicí (viz níže). Rovnice byla vytvořena již roku 1972 Williamem Friedewaldem, Robertem Levy a Donaldem Fredricksonem. I dnes je tato metoda v laboratořích klinické biochemie nejrozšířenější. Výpočet je založen na fyziologickém zastoupení TG a cholesterolu v jednotlivých LP (graf 2) [15,18]. LDL-chol = celkový chol (HDL chol + TGxf) f = VLDL-chol/VLDL-TG = 0,45 [8] LDL-chol = celkový chol (HDL chol + TG/2,2) koeficient 2,2 pro mmol/l [18] Graf 2 Fyziologické rozložení TG a celkového cholesterolu v LP [18] 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% c holes terol trigly c eridy CM LDL V LDL HDL Legenda: HDL - lipoproteiny o vysoké hustotě; VLDL - lipoproteiny o velmi nízké hustotě; LDL - lipoproteiny o nízké hustotě; CM - chylomikra Tento výpočet lze použít pouze pokud sérum není chylózní, koncentrace TG nepřesahuje hodnotu 4,5 mmol/l a v séru nejsou přítomny jinak zanedbatelné LP (např. IDL). U většiny pacientů jsou hodnoty TG < 4,5 mmol/l, lze tedy výpočet použít [11,17,18]. Při použití výpočtu není zapotřebí náročné ultracentrifugace jako je to u referenční β-kvantifikace. Výpočet je závislý na přesnosti měření tří dalších testů stanovení 18

HDL-cholesterolu, celkového cholesterolu a TG. Krev musí být odebrána po 12-14 hodinovém lačnění. Musí být vyloučeny chylózní vzorky (předpokládá se, že CM nejsou přítomny díky lačnění). U pacientů s hyperlipoproteinémií III. typu je obsaženo hodně cholesterolových zbytků ve frakci IDL, proto nelze výpočet použít. Onemocnění je ale vzácné. Dále je výpočet ovlivněn přítomností malých denzních LDL. Ty nesou menší množství cholesterolu a rozdíl mezi výpočtem a přímým měřením může být až 0,5 mmol/l. Z těchto důvodů byl odvozen obdobný vzorec, který zahrnuje stanovení Apo B (viz níže) [1,9,15,21]. LDL-chol = 0,41 celkový chol 0,32 TG + 1,70 Apo B 0,27 v mmol/l [1] Tato rovnice je přesnější než klasický Friedewaldův výpočet pro koncentraci TG > 2,26 mmol/l a lze ji použít i pro koncentraci TG > 4,5 mmol/l. Apo B se nachází v LDL, VLDL a IDL (množství částic VLDL a IDL je ve srovnání s počtem částic LDL skoro zanedbatelné). Stanovení množství Apo B je ale lepším ukazatelem aterogenního rizika než LDL-cholesterol, je tedy zbytečné po stanovení Apo B ještě počítat LDL-cholesterol (hodnoty LDL-cholesterolu významně korelují s hodnotami Apo B) a navíc se tento výpočet stanovením Apo B velmi prodraží [1,15,18,19,22]. Další modifikací této rovnice je výpočet dle Longa: LDL-chol = celkový chol (HDL chol + 0,37 TG) a pro pacienty s diabetem II. typu byl doporučován vzorec: LDL-chol = 0,385 celkový chol 0,342 TG + 2,01 Apo B [8] Friedewaldova rovnice je však nadále považována ze přesnou, spolehlivou a finančně výhodnou metodu stanovení LDL-cholesterolu, i když existují rozdíly mezi hodnotami vypočtenými a změřenými i do koncentrace TG 4,5 mmol/l (zvláště u diabetiků, pacientů s metabolickým syndromem X či cholestázou). U těchto pacientů může být vhodné použít přímé měření LDL-cholesterolu [8,20,21]. 2.2 Stanovení LDL-cholesterolu přímou metodou Přímé stanovení LDL-cholesterolu je nyní dostupnější v laboratořích klinické biochemie, ale z ekonomického hlediska je náročnější, proto většina laboratoří dává přednost výpočtu. Použití přímého stanovení je vhodné u pacientů s vysokými hladinami TG, ale při koncentracích TG > 12 mmol/l jsou i výsledky přímého měření LDL-cholesterolu také nesprávné [16]. 19

Metody přímého stanovení využívají různé pomocné látky, které separují v krvi částice LDL od ostatních LP a měření koncentrace cholesterolu pak probíhá pouze v částicích LDL [19]. Tato metoda je u některých pacientů srovnatelná s referenční metodou (β-kvantifikace). Ve srovnání s výpočtem tato metoda dává často o něco vyšší výsledky [19]. Přímé stanovení LDL-cholesterolu má jednu velkou nevýhodu. Prakticky všechna odborná doporučení pro diagnostiku a léčbu dyslipoproteinémií vycházejí z klinických studií, ve kterých byl LDL-cholesterol stanoven pomocí výpočtu podle Friedewalda. Současné referenční meze a doporučené hodnoty LDL-cholesterolu proto platí pro jeho hodnotu vypočtenou a nikoliv pro jeho přímé měření [2]. Stanovit LDL-cholesterol přímou metodou je možné několika způsoby. Mimo metodu s použitím detergentů, může být LDL-cholesterol stanovován imunoseparační metodou. Dříve se používala také metoda turbidimetrická, elektroforetická, precipitační nebo vysokoúčinná gelová chromatografie. Metoda imunoseparační využívá ke stanovení reakci mezi protilátkou a Apo E a Apo AI, čímž dojde k odstranění všech LP kromě LDL (ty na svém povrchu nesou pouze Apo B). Tuto metodu můžeme použít až do koncentrace TG = 38 mmol/l. Nevýhodou tohoto stanovení je finanční náročnost, velký variační koeficient a také chybí standardizace [5,18]. 2.3 Klinické studie Existuje velký počet klinických studií, které se zabývají porovnáním obou metod stanovení LDL-cholesterolu (výpočet dle Friedewalda, přímé měření). Zde uvádím několik z nich. Baruch [2] ve své práci porovnával přímé stanovení LDL-cholesterolu s použitím Siemens Advia Chemie systému a výpočet dle Friedewalda. Studie se zúčastnilo 81 pacientů. U každého byl LDL-cholesterol změřen oběma metodami a u 64 z nich byl změřen ještě po 4 až 6 týdnech léčby (terapie simvastatinem nebo simvastatin/ezetimibem). Byla zjištěna významná korelace mezi těmito metodami. Korelace byla výrazně lepší u pacientů s nižší hladinou HDL-cholesterolu, TG a celkového cholesterolu. U 60 % pacientů byl rozdíl mezi výpočtem a přímým měřením větší než 0,13 mmol/l (asi 6 %), u 1/3 pacientů byl rozdíl více než0,39 mmol/l, zatímco u 25 % pacientů byl rozdíl více než 0,52 mmol/l. U 47 % pacientů byl rozdíl mezi metodami na začátku a v průběhu léčby větší než 0,26 mmol/l (asi 10 %). Zjištění naznačují, že přímé stanovení klinicky neodpovídá výpočtu, což zpochybňuje doporučené použití přímé metody v situacích, kdy výpočet je nepřesný (při TG > 4,5 mmol/l). 20

Jiná práce [11] zjišťovala správnost výpočtu LDL-cholesterolu pomocí referenční metody (ultracentrifugace). U každého pacienta byla změřena hladina referenční metodou a výpočtem. Studie se zúčastnilo 1215 pacientů. Správnost výpočtu byla relativně nízká. U 36 % pacientů byla chyba více než 5%. 5-28 % pacientů bylo chybně zařazeno do kategorie rizika kardiovaskulárních onemocnění. Ze studie vyplynulo, že výpočet by měl být používán s opatrností při zařazování pacientů do kategorií rizika kardiovaskulárních onemocnění. U pacientů s hypertriglyceridémii by neměl být používán vůbec. Další studie [20] srovnávala výpočet dle Friedewalda s přímým stanovením magnetickým LDL testem LipiDirect. Vyšetřeno bylo 661 ambulantních pacientů bez zjevných kardiovaskulárních onemocnění a s koncentrací TG 4,52 mmol/l. Byly provedeny dvě analýzy - lineární regrese a nepárový T-test. Vypočítané a přímo změřené koncentrace LDLcholesterolu byly značně odlišné. V 93 % případů přímo naměřené hodnoty byly vyšší než hodnoty vypočtené. Rozdíl mezi nimi se lineárně zvětšoval s rostoucí koncentrací TG. Klinické rozdíly existovaly i při normální nebo mírně zvýšené koncentraci TG. Shodné výsledky pro zařazení pacientů do kategorie kardiovaskulárního rizika byly přítomny pouze u 48,1 % vzorků. Existují tedy významné rozdíly mezi těmito metodami a to také u zdravých jedinců. Tyto rozdíly jsou přímo úměrné koncentraci TG. U jiné studie [21] byla přezkoumána platnost Friedewaldova vzorce pro odhad LDLcholesterolu pomocí preparativní ultracentrifugace. Studie se zúčastnilo 9477 pacientů, jejichž hladina celkového cholesterolu pokryla širokou škálu hodnot. Bylo zjištěno, že u velmi nízkých hladin LDL-cholesterolu byly vypočtené koncentrace shodné s koncentracemi změřenými referenční metodou. V podskupině jedinců s TG 4,5 mmol/l výpočet podceňoval koncentraci LDL-cholesterolu. Zajímavé je, že vzorec nevykázal žádné významné vychýlení u pacientů s plazmatickou hladinou TG mezi 4,52 a 8,82 mmol/l, což naznačuje, že vypočtené hodnoty LDL-cholesterolu mohou být spolehlivé a klinicky užitečné i u pacientů s hladinou TG > 4,5 mmol/l, která je stanovena jako cut-off hodnota ve většině doporučení. Vícenásobná regresní analýza ale ukázala ovlivnění výpočtu poměrem VLDL-cholesterol/TG. Ze studie vyplývá, že Friedewaldův vzorec je spolehlivý u pacientů s nízkými hladinami LDL-cholesterolu, dále je spolehlivý do koncentrace TG až 9 mmol/l, ale musí být používán s opatrností při vysokém poměru VLDL-cholesterol/TG, který najdeme u pacientů s dyslipoproteinémií typu III. Další studie [12] se týkala proudové frakcionace (AF4), která byla vyvinuta k oddělení různých typů lipoproteinů z lidského séra. Důraz byl kladen na optimalizaci metody pro stanovení největších lipoproteinových frakcí (VLDL a LDL), které není možné stanovit 21

chromatograficky v rutinním provozu. Byly testovány různé modifikace této metody (použití různých délek kanálů apod.). Poměr signálu absorpce ultrafialového záření (500 nm) na signálu rozptylu světla byl použit k ověření vztahu mezi retenčním časem a velikostí frakcionovaných částic. Frakcionace může být snadno spojena s enzymatickými reakcemi ke stanovení TG a cholesterolu. Po sérii testů bylo zjištěno, že použitím krátkých AF4 kanálů dosáhneme vyšší citlivosti a nižší spotřeby drahých enzymatických činidel. Navržená metoda může být přínosná pro diagnostické studie i pro rutinní analýzu. Různé druhy sérových lipoproteinů mohou být rozděleny do 40 minut. Metoda je vysoce selektivní ve VLDL-LDL rozsahu. Chen [9] ve své práci porovnává tři metody stanovení LDL-cholesterolu - Friedewaldovu rovnici, přímé stanovení a modifikovaný výpočet (LDL-C (mg / dl) = Non-HDL-C 90% - TG 10%). Studie se zúčastnilo 2180 pacientů, kteří byli rozděleni do několika skupin podle koncentrace TG. Dvojice metod byly porovnávány pomocí lineární regrese a Bland- Altmanova grafu. Koncentrace LDL-cholesterolu zjištěné přímou metodou odpovídaly výsledkům vypočítaným modifikovaným vzorcem, výsledky vypočítané dle Friedewalda se významně lišily, zvláště u pacientů s hypertriglyceridémií. Modifikovaný vzorec je tedy podle této práce srovnatelný s přímou metodou stanovení. 22

3 Zhodnocení současného stavu studované problematiky Problematika stanovení LDL-cholesterolu stále není jednoznačně vyřešena. Některé laboratoře dávají přednost výpočtu (nelze použít při TG > 4,5 mmol/l), jiné přímému stanovení a některé kombinují obě metody (výpočet u TG do 4,5 mmol/l a u vyšších koncentrací TG pak metodu přímou). Z literatury vyplývá, že u pacientů s koncentrací TG < 4,5 mmol/l je pravděpodobně vhodné používat stanovení výpočtem, který je podle některých autorů srovnatelný s metodou referenční. Podle jiných autorů má být raději vždy u hypertriglyceridémie použito přímé stanovení LDL-cholesterolu. U pacientů s hladinou TG > 4,5 mmol/l je podle většiny publikovaných studií vhodná metoda přímá, ale existuje i práce, která nalezla dobrou korelaci mezi výpočtem LDL-cholesterolu a referenční metodou až do koncentrace triglyceridů až 9 mmol/l. V současné době však můžeme stanovení LDL-cholesterolu nahradit stanovením apoproteinu Apo-B, jehož koncentrace lépe předpovídá rizika kardiovaskulárních onemocnění než koncentrace LDL-cholesterolu. Stanovení můžeme také nahradit výpočtem nonhdlcholesterolu. Tato problematika je tedy stále živá a je nezbytné se jí i nadále věnovat. 23

B Speciální část 4 Formulace cílů práce Stanovila jsem si následující cíle své bakalářské práce.: 1. Porovnat výsledky stanovení LDL-cholesterolu získané výpočtem (Friedewaldova rovnice) a přímým měřením v závislosti na tom, jaká je koncentrace triglyceridů. Hypotéza: 1. Výsledky obou metod se budou statisticky významně lišit u pacientů s hypertriglyceridémií. 2. Hodnoty LDL-cholesterolu získané přímou metodou budou vyšší než hodnoty vypočtené, avšak při koncentraci TG < 4,5 mmol/l mezi nimi bude statisticky významná korelace. 3. Se zvyšující se hladinou TG budou narůstat rozdíly mezi hodnotami LDL-cholesterolu stanovenými výpočtem a přímým měřením. 24

5 Popis metodiky Z laboratorního informačního systému Oddělení klinické biochemie FN u sv. Anny v Brně jsem získala výsledky 294 pacientů, u kterých byl stanoven LDL-cholesterol přímou metodou a byly k dispozici také hodnoty krevních lipidů potřebné pro výpočet LDL-cholesterolu dle Friedewalda (celkový cholesterol, HDL-cholesterol, triacylglyceroly). Výpočet jsem provedla i u pacientů s koncentrací TG > 4,5 mmol/l s vědomím toho, že výsledky výpočtu nebudou pravděpodobně správné. Pro porovnání obou metod stanovení LDL-cholesterolu v celém rozmezí hladin TG byl však tento postup nutný. Výsledky měření LDL-cholesterolu byly od pacientů, kteří byli vyšetřeni po 10-12 hodinách lačnění, aby došlo k eliminaci přítomných chylomiker a stanovení tak nebylo ovlivněno. Soubor pacientů jsem rozdělila do sedmi skupin podle koncentrace TG. Zvolila jsem následující intervaly koncentrace TG do 0,99 mmol/l; 1,00-1,99 mmol/l; 2,00-2,99 mmol/l; 3,00-4,50 mmol/l; 4,51-5,99 mmol/l; 6,00-11,99 mmol/l a > 12,00 mmol/l. Hodnotu 4,50 mmol/l jsem zvolila, protože je udávána v literatuře jako cut-off hodnota pro stanovení LDL-cholesterolu výpočtem. Hodnota 11,99 mmol/l je pak mezní hodnotou, nad kterou bývají dle literatury i výsledky přímého stanovení chybné. Pro jednotlivé skupiny pacientů jsem pak zjišťovala, jak se hodnoty LDL-cholesterolu získané přímým měřením a výpočtem liší. K tomu jsem použila statistickou analýzu (nepárový T-test, lineární regresi a korelační koeficient). 25

6 Popis souborů Charakteristika jednotlivých skupin pacientů rozdělených podle koncentrace TG je uvedena v tabulce 4. Údaje o věku a pohlaví pacientů nejsou uvedeny, protože nebyly k dispozici. Tab. 4 Skupiny pacientů dle koncentrace triglyceridů koncentrace TG (mmol/l) počet pacientů 0,00-0,99 36 1,00-1,99 125 2,00-2,99 50 3,00-4,50 11 4,51-5,99 36 6,00-11,99 25 > 12,00 10 Legenda: TG - triglyceridy 6.1 Biologický materiál, preanalytická fáze Jako biologický materiál bylo použito sérum odebrané do hnědé zkumavky Sarstedt (o objemu 4,9 ml nebo 7,5 ml) nebo plazma odebrána do oranžové zkumavky Sarstedt (o stejném objemu) obsahující heparin litný jako protisrážlivé činidlo. Krev byla centrifugována při 4000 otáčkách 10 minut. 26

7 Popis pouţitých analytických metod 7.1 Stanovení LDL-cholesterolu přímou metodou 7.1.1 Pouţití a princip testu Jedná se o homogenní metodu bez nutnosti separace a ultracentrifugace. V reakci se využívají různé detergenty a reagencie, které rozpouštějí nebo specificky blokují jednotlivé LP frakce. Tak se oddělí LDL částice, v nichž poté stanovujeme množství cholesterolu fotometrickou enzymatickou reakcí. Po proběhnutí reakce vzniká barevný produkt, jehož absorbanci měříme při vlnové délce 546/660 nm. Absorbance vzniklého produktu je pak přímo úměrná koncentraci LDL-cholesterolu ve vzorku. Analyzátor spočítá koncentraci analytu automaticky. 7.1.2 Princip reakce V první fázi je pomocí detergentu uvolněn cholesterol z nonldl částic. Uvolněný cholesterol je pak přeměněn působením enzymů na 4-cholesten-3-on a peroxid vodíku. Peroxid vodíku se rozkládá na kyslík a vodu. Reakce je bezbarvá. Ve druhé fázi je přidán další detergent, který uvolní cholesterol z LDL částic a ten je stanoven obdobně jako cholesterol celkový. nonldl částice. solubilizované nonldl částice (specifický detergent 1) nonldl cholesterol 4-cholesten-3on + H 2 O 2 (CHE, CHOD) H 2 O 2 nebarevný produkt (POD) LDL částice solubilizované LDL částice (specifický detergent 2) LDL-cholesterol cholesterol + H 2 O 2 (CHE, CHOD) H 2 O 2 + DSBmT + amin barevný produkt (POD) 7.1.3 Reagencie Reagencie jsou připraveny přímo k použití, skladují se při 2-8 C, po otevření jsou stabilní po dobu 4 týdnů. Reagencie R1 obsahuje: detergent 1, MES pufr (ph 6,3), CHE, CHOD, POD, 4-aminoantipyrin, konzervační prostředek. Reagencie R2 obsahuje: detergent 2, MES pufr (ph 6,3), DSBmT, konzervační prostředek 27

7.1.4 Kalibrace Pro analýzu byl použit kalibrátor LDL cholesterol Calibrator. Jeho koncentrace byla stanovena ultracentrifugací. Kalibrátor je v lyofilizovaném stavu a před analýzou je nutné jej rozpustit v deionizované nebo destilované vodě. Připravený kalibrátor je stabilní 2 týdny při 2-8 C. Kalibrace je lineární, dvoubodová (1. bod fyziologický roztok, 2. bod kalibrátor). 7.1.5 Kontrola kvality Pro analýzu séra byly použity kontrolní materiály Precinorm L (normální hodnota) a Precipath L (rozhraní normální a patologické hodnoty nebo patologická hodnota). Precinorm L i Precipath L jsou lyofilizované kontrolní séra na bázi lidského. Po rozpuštění v destilované nebo deionizované vodě jsou stabilní pět dní při 2-8 C nebo 4 týdny při -15 až -25 C. Tab. 5 Parametry kontrolních materiálů pro analýzu v séru kontrolní materiál hodnota atestu akceptovatelné rozmezí Precinorm L 2,56 mmol/l 2,30-2,81 mmol/l Precipath L 2,27 mmol/l 2,05-2,49 mmol/l 7.1.6 Pracovní rozsah Pracovní rozsah metody je 0,007 25,6 mmol/l. 7.2 Stanovení LDL-cholesterolu výpočtem Pro stanovení LDL-cholesterolu výpočtem jsem použila vzorec: LDL-chol = celkový chol (HDL chol + TG/2,2) Jednotlivé proměnné byly stanoveny takto: 7.2.1 Stanovení celkového cholesterolu 7.2.1.1 Pouţití a princip testu Jedná se o end-point barevný test pro kvantitativní stanovení množství celkového cholesterolu ve vzorku séra nebo plazmy pomocí analyzátoru Modular Analytics Evo SWA. Princip testu spočívá v tvorbě barevného produktu, který je měřen při vlnové délce 28

505/700 nm (ve 35. bodě). Absorbance vzniklého produktu je pak přímo úměrná množství celkového cholesterolu ve vzorku. Analyzátor spočítá koncentraci analytu automaticky. 7.2.1.2 Princip reakce Nejprve dojde k rozkladu esterů cholesterolu na cholesterol a mastné kyseliny. Cholesterol je oxidován na cholestenon a peroxid vodíku za působení enzymu cholesteroloxidázy. Peroxid vodíku pak reaguje s činidlem a vzniká červené barvivo. esterifikovaný cholesterol + H 2 O cholesterol + mastná kyselina (CHE) cholesterol + O 2 4-cholesten-3-on + H 2 O 2 (CHOD) H 2 O 2 + 4-aminoantipyrin + fenol chinonmonoiminové barvivo + H 2 O (POD) 7.2.1.3 Reagencie Reagencie jsou připraveny přímo k použití, případné růžové zbarvení neinterferuje se stanovením. Skladují se při 2-8 C. Po otevření jsou stabilní po dobu 28 dní v chlazeném prostoru pro reagencie v analyzátoru, musí být chráněny před slunečním světlem a bakteriální kontaminací. Reagencie R1 obsahuje: PIPES pufr (ph 6,8), Mg 2+, cholát sodný, 4-aminofenazon, fenol, CHE, CHOD, POD, polyglykolether, stabilizátor, konzervační prostředek 7.2.1.4 Kalibrace Pro analýzu byl použit kalibrátor Calibrator for automated systems. Jeho koncentrace byla stanovena metodou dle Abell-Kendala. Kalibrátor je v lyofilizovaném stavu a před analýzou je nutné jej rozpustit v deionizované nebo destilované vodě. Připravený kalibrátor je stabilní 2 dny při 2-8 C. Kalibrace je lineární, dvoubodová (1. bod fyziologický roztok, 2. bod kalibrátor). 7.2.1.5 Kontrola kvality Pro analýzu séra byly použity kontrolní materiály Precinorm U (normální hodnota) a Precipath U (rozhraní normální a patologické hodnoty nebo patologická hodnota). Precinorm U i Precipath U jsou lyofilizované kontrolní séra na bázi lidského. Po rozpuštění v destilované nebo deionizované vodě jsou stabilní dva dny při 2-8 C nebo 4 týdny při -15 až -25 C. 29

Tab. 6 Parametry kontrolních materiálů pro analýzu v séru kontrolní materiál hodnota atestu akceptovatelné rozmezí Precinorm U 2,79 mmol/l 2,59-2,98 mmol/l Precipath U 4,57 mmol/l 4,26-4,87 mmol/l 7.2.1.6 Pracovní rozsah Pracovní rozsah metody je 0,08 20,70 mmol/l. 7.2.2 Stanovení HDL-cholesterolu 7.2.2.1 Pouţití a princip testu Jedná se o homogenní metodu bez nutnosti separace a ultracentrifugace. V reakci se využívají různé detergenty a reagencie, které rozpouštějí nebo specificky blokují jednotlivé LP frakce. Tak se oddělí HDL částice, v nichž poté stanovujeme množství cholesterolu fotometrickou enzymatickou reakcí. Po proběhnutí reakce vzniká barevný produkt, jehož absorbanci měříme při vlnové délce 600/700 nm. Absorbance vzniklého produktu je pak přímo úměrná koncentraci HDL-cholesterolu ve vzorku. Analyzátor spočítá koncentraci analytu automaticky. 7.2.2.2 Princip reakce V prvním kroku jsou blokovány nonhdl částice. Zablokováním těchto částic se docílí toho, že v dalších reakcích cholesterol v nich obsažený nereaguje s enzymy používanými ke stanovení. Poté je přidán detergent pro rozpuštění HDL částic, tím je uvolněn cholesterol a stanoven enzymatickou reakcí. VLDL, CM, LDL, IDL nereaktivní VLDL, CM, IDL, LDL (akcelerátor, CHOD, POD, DSBmT) HDL částice solubilizované částice (detergent) HDL-cholesterol 4-cholesten-3-on + H 2 O 2 (CHE, CHOD) H 2 O 2 + DSBmT + 4-aminoantipyrin barevný produkt (POD) 7.2.2.3 Reagencie Reagencie jsou připraveny přímo k použití, skladují se při 2-8 C, po otevření jsou stabilní po dobu 4 týdnů. Reagencie R1 obsahuje:good pufr, CHE, POD, DSBmT, akcelerátor (urychlovač), konzervační prostředek 30

Reagencie R2 obsahuje: Good pufr, CHE, 4-aminoantipyrin, detergent, konzervační prostředek 7.2.2.4 Kalibrace Pro analýzu byl použit kalibrátor HDL cholesterol Calibrator. Jeho koncentrace byla stanovena ultracentrifugací. Kalibrátor je v lyofilizovaném stavu a před analýzou je nutné jej rozpustit v deionizované nebo destilované vodě. Připravený kalibrátor je stabilní 2 týdny při 2-8 C. Kalibrace je lineární, dvoubodová (1. bod fyziologický roztok, 2. bod kalibrátor). 7.2.2.5 Kontrola kvality Pro analýzu séra byly použity kontrolní materiály Precinorm L (normální hodnota) a Precipath L (rozhraní normální a patologické hodnoty nebo patologická hodnota). Precinorm L i Precipath L jsou lyofilizované kontrolní séra na bázi lidského. Po rozpuštění v destilované nebo deionizované vodě jsou stabilní pět dní při 2-8 C nebo 4 týdny při -15 až -25 C. Tab. 7 Parametry kontrolních materiálů pro analýzu v séru kontrolní materiál hodnota atestu akceptovatelné rozmezí Precinorm L 1,55 mmol/l 1,39-1,71 mmol/l Precipath L 1,87 mmol/l 1,69-2,05 mmol/l 7.2.2.6 Pracovní rozsah Pracovní rozsah metody je 0,06 5,18 mmol/l. 7.2.3 Stanovení triglyceridů 7.2.3.1 Pouţití a princip testu Jedná se o end-point barevný test pro kvantitativní stanovení množství triglyceridů ve vzorku séra nebo plazmy pomocí analyzátoru Modular Analytics Evo SWA. Princip testu spočívá v tvorbě barevného produktu, který je měřen při vlnové délce 505/700 nm (ve 35. bodě). Absorbance vzniklého produktu je pak přímo úměrná množství triglyceridů ve vzorku. Analyzátor spočítá koncentraci analytu automaticky. 31

7.2.3.2 Princip reakce TG jsou hydrolyzovány lipázou na glycerol a MK, poté je glycerol fosforylován působením glycerolkinásy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát a ten je oxidován na dihydroxyacetonfosfát. Vzniká také peroxid vodíku, který je tzv. Trinderovou reakcí přeměněn na barevný produkt, jehož absorbanci měříme. TG + 3 H 2 O glycerol + 3 MK (LPL) glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP (GK) glycerol-3-fosfát + O 2 dihydroxyacetonfosfát + H 2 O 2 (GPO) H 2 O 2 + 4-aminoantipyrin + fenol chinonmonoiminové barvivo + H 2 O (POD) 7.2.3.3 Reagencie Reagencie jsou připraveny k použití. Skladují se při 2-8 C, po otevření jsou v chlazeném prostoru pro reagencie analyzátoru stabilní 14 dnů. Reagencie R1 obsahuje: PIPES pufr (ph 6,8), Mg2+, cholát sodný, ATP, 4-aminofenazon, 4-cholorofenol, hexakyanoželeznatan draselný, polyglykolether, LPL, GK, POD, GPO, konzervační prostředek 7.2.3.4 Kalibrace Pro analýzu byl použit kalibrátor Calibrator for automated systems. Hodnota kalibrátoru je navázána na metodu ID-MS. Kalibrátor je v lyofilizovaném stavu a před analýzou je nutné jej rozpustit v deionizované nebo destilované vodě. Připravený kalibrátor je stabilní 2 dny při 2-8 C. Kalibrace je lineární, dvoubodová (1. bod fyziologický roztok, 2. bod kalibrátor). 7.2.3.5.Kontrola kvality Pro analýzu séra byly použity kontrolní materiály Precinorm U (normální hodnota) a Precipath U (rozhraní normální a patologické hodnoty nebo patologická hodnota). Precinorm U i Precipath U jsou lyofilizované kontrolní séra na bázi lidského. Po rozpuštění v destilované nebo deionizované vodě jsou stabilní dva dny při 2-8 C nebo 4 týdny při -15 až -25 C. 32

Tab. 8 Parametry kontrolních materiálů pro analýzu v séru kontrolní materiál hodnota atestu akceptovatelné rozmezí Precinorm U 1,00 mmol/l 0,90-1,10 mmol/l Precipath U 1,88 mmol/l 1,70-2,06 mmol/l 7.2.3.6 Pracovní rozsah Pracovní rozsah metody je 0,10 11,40 mmol/l. 7.3 Nejistoty pouţitých metod Nejistoty stanovení (zjištěné při vlastním měření vzorků) a akceptovatelné chyby SEKK uvádí tab. 9. Tab. 9 Nejistoty metod Nejistota měření (%) Hladina (mmol/l) Akceptovatelné chyby SEKK (%) LDL-cholesterol 7,75 2,99 15 8,12 4,40 celkový cholesterol 2,40 2,32 15 4,00 1,06 HDL-cholesterol 5,17 6,18 10 4,19 4,35 triglyceridy 12,30 1,30 15 16,00 1,93 7.4 Interference pouţitých metod Stanovení krevních lipidů není přesné u sér hemolytických nebo ikterických. Stanovení LDL a HDL cholesterolu je také ovlivněno vysokou koncentrací TG. Limity koncentrací hemoglobinu, bilirubinu a TG bez významných interferencí, podle příbalových letáků výrobců reagencií, jsou uvedeny v tabulce 10. 33

Tab. 10 Interference hemoglobinu,bilirubinu, a TG při stanovení krevních lipidů LDL-P CHOL HDL-chol TG Hemoglobin do 5 g/l do 7 g/l do10 g/l do 5 g/l Bilirubin do 342 μmol/l do 428 μmol/l do 1000 μmol/l do 171 μmol/l TG do 14,6 mmol/l neuvedeno do 22,6 mmol/l neuvedeno Legenda: LDL-P - LDL-cholesterol měřený; CHOL - celkový cholesterol; HDL-chol - HDLcholesterol; TG - triacylglyceridy 34

8 Popis pouţité přístrojové techniky Koncentrace TG, celkového cholesterolu a HDL-cholesterolu pro výpočet, stejně jako hladina LDL-cholesterolu byly stanoveny na analyzátoru Modular Analytics Evo SWA (Serum Work Area) firmy Roche. Přístroj je spojen s preanalytickým systémem MPA téže firmy. 9 Popis pouţitých statistických metod Pro statistickou analýzu získaných dat jsem použila programy MedCalc a MS Office Excel. Pro porovnání statistické významnosti rozdílů metodami stanovení LDL-cholesterolu (výpočet a přímé měření) a grafické zobrazení výsledků jsem použila neparametrickou regresi Passing-Bablock a Bland-Altmanův rozdílový graf. Pomocí MS Office Excel jsem vyhodnotila aritmetický průměr, medián, nejmenší a největší hodnotu, směrodatnou odchylku a variační koeficient hodnot LDL-cholesterolu měřeného přímým měřením a výpočtem pro jednotlivé skupiny pacientů dle koncentrace TG. Dále jsem pomocí MS Office Excel vyhodnotila Studentův nepárový T-test k porovnání rozdílu mezi přímou metodou a výpočtem pro jednotlivé skupiny pacientů rozdělených dle koncentrace TG (za statisticky významný rozdíl mezi metodami stanovení LDL-cholesterolu je považována hodnota p < 0,05). 35

R oz d íl ho dn ot (LD L -měř. - LD L vyp.) 10 Výsledky Soubor 294 pacientů byl rozdělen do několika skupin podle koncentrace TG. V tabulce 11 jsou uvedeny naměřené hodnoty krevních lipidů u jednotlivých skupin pacientů. Tab. 11 Charakteristika sledovaných skupin triglyceridy počet cholesterol LDL-V LDL-P HDL triglyceridy (mmol/l) pacientů (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) 0,00-0,99 36 4,17 ± 0,92 2,25 ± 0,65 2,49 ± 0,80 1,57 ± 0,55 0,76 ± 0,17 1,00-1,99 125 4,88 ± 1,25 2,88 ± 1,03 3,33 ± 1,16 1,31 ± 0,48 1,53 ± 0,27 2,00-2,99 50 5,44 ± 1,07 3,07 ± 0,92 3,58 ± 0,99 1,28 ± 0,41 2,42 ± 0,28 3,00-4,50 11 5,98 ± 1,64 3,28 ± 1,47 3,93 ± 1,60 1,13 ± 0,35 3,50 ± 0,55 4,51-5,99 36 6,02 ± 1,23 2,61 ± 1,16 3,28 ± 1,17 1,08 ± 0,30 5,18 ± 0,39 6,00-11,99 25 6,18 ± 1,27 1,61 ±1,44 2,53 ± 1,02 0,98 ± 0,35 7,98 ± 1,36 > 12,00 10 7,83 ± 1,19-0,93 ± 1,70 2,03 ± 0,56 0,92 ± 0,33 17,4 ± 4,01 Legenda: hodnoty jsou udávány jako průměr ± 1SD; LDL-V - LDL-cholesterol vypočítaný dle Friedewalda; LDL-P - LDL-cholesterol změřený; HDL - HDL-cholesterol Graf 3 Závislost rozdílu LDL-cholesterolu (přímá metoda - výpočet) na hladině TG 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 2 4 6 8 10 12 Konce ntra ce TG Legenda: TG - triglyceridy; LDL-měř. - LDL-cholesterol změřený; LDL-vyp. - LDLcholesterol vypočítaný 36

10.1 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG do 0,99 mmol/l Tab. 12 Popisná statistika souboru dat LDL chol- vypočítaný LDL chol-změřený počet pacientů 36 průměr 2,25 mmol/l 2,49 mmol/l medián 2,37 mmol/l 2,68 mmol/l nejmenší hodnota 0,96 mmol/l 0,85 mmol/l největší hodnota 3,50 mmol/l 3,98 mmol/l SD 0,65 mmol/l 0,80 mmol/l CV 28,62 % 32,23 % p 0,18 korelační koeficient 0,98 slope: 95% CI 1,14 1,29 Legenda: LDL chol - LDL-cholesterol; SD - směrodatná odchylka; CV - variační koeficient; p - testovací kritérium (výsledek T-testu); CI interval spolehlivosti (tj. intervalu, v jehož hranicích předpokládáme, že odhadovaná hodnota s předem určenou pravděpodobností leží) 37

PRIMA METODA Graf 4 Rozdílový Bland-Altmanův graf znázorňující závislost mezi průměry a rozdíly přímého stanovení a výpočtu LDL-chlosterolu pro skupinu pacientů s hodnotami TG do 0,99 mmol/l 0.8 P RI M A M ET O D A - V Y P 0.6 0.4 0.2 0.0-0.2 +1.96 SD 0.65 Mean 0.23-1.96 SD -0.18-0.4 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 AVERAGE of PRIMA METODA and VYPOCET Legenda: SD - směrodatná odchylka; average of prima metoda and vypocet (osa x) - průměr hodnot LDL-cholesterolu získaných přímou metodou a výpočtem; prima metoda-vyp. (osa y) - rozdíl mezi hodnotami LDL-cholesterolu získanými přímou metodou a výpočtem Graf 5 Neparametrická regrese znázorňující lineární regresi přímé metody stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro skupinu pacientů s hodnotami TG do 0,99 mmol/l 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 VYPOCET Legenda: vypocet (osa x) - hodnota LDL-cholesterolu získaná výpočtem; prima metoda (osa y) - hodnota LDL-cholesterolu získaná přímým měřením 38

10.2 Srovnání přímého stanovení a výpočtu LDL-cholesterolu pro pacienty s koncentrací TG = 1,00-1,99 mmol/l Tab. 13 Popisná statistika souboru dat LDL chol- vypočítaný LDL chol-změřený počet pacientů 125 průměr 2,88 mmol/l 3,33 mmol/l medián 2,75 mmol/l 3,22 mmol/l nejmenší hodnota 0,79 mmol/l 1,11 mmol/l největší hodnota 5,80 mmol/l 6,90 mmol/l SD 1,03 mmol/l 1,16 mmol/l CV 35,93 % 34,66 % p 0,001 korelační koeficient 0,98 slope: 95% CI 1,09 1,16 Legenda: LDL chol - LDL-cholesterol; SD - směrodatná odchylka; CV - variační koeficient; p - testovací kritérium (výsledek T-testu); CI interval spolehlivosti (tj. intervalu, v jehož hranicích předpokládáme, že odhadovaná hodnota s předem určenou pravděpodobností leží) 39