Separační metody používané v proteomice
Proteome = komplexní směsi proteinů Lidská buňka 10,000 typů proteinů Rozdíl v koncentraci 10 6,plasma10 9 Nutnost separace, frakcionace Na úrovni Proteinů Obtížně identifikovatelné, je nutné měřit velké molekulové hmotnosti, s velkým rozlišením lze pomocí FTICR Peptidů štěpení
Proteinové štěpení Chemické CNBr M Enzymatické Vysoce specifické Trypsin K, R AspN - D GluC E ArgC R LysC - K Méně specifické Chymotrypsin - aromatické Pepsin F,L,W,Y Nespecifické Proteináza K
Vlastnosti proteinů, peptidů pi mw Hydrofobicita
Alanine Valine Aspartic acid
Rozložení aminokyselin v proteinech podle četnosti
Separační metody Elektromigrační metody SDS PAGE 2DE IEF SDS PAGE Nativní elektroforéza Kapilární elektroforéza Free flow eletrophoresis Chromatografické metody Jednorozměrná Na reverzní fázi Iontově výměnná Gelová chromatografie Hydrofilní Afinitní Vícerozměrná 2D nejčastěji SCX+RP Chromatofokusace Beckman-Coulter
Elektromigrační metody 1DE - SDS PAGE 2DE IEF SDS PAGE Nativní elektroforéza Kapilární elektroforéza Free flow electrophoresis
Elektromigrační metody SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) Molekulová hmotnost
Elektromigrační metody isoelektrická fokusace Separace proteinů v závislosti na isoelektrickém bodě IPG proužky imobilizovaný ph gradient Různý Gradient ph 3-10, 4-7, 6-11, 4,5-5,5
Elektromigrační metody Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE IEF SDS PAGE MS analýza +
Elektromigrační metody + Dvoudimensionální elektroforéza 2-DE První dimense -- + + - + - - - -- - ++ + + + + - + + ++ -- - + - - - - - - - pi 3 -- - - - - + ++ -- - - - + + + + - -- + + - + -- + ++ pi 10 _ + - + + -- Druhá dimense - - Polyakrylamid rylamidový gel + + ++ - - +
Elektromigrační metody 2-DE Vizualizace proteinů: Citlivost Kompatibilita s identifikací Dynamický rozsah Stříbření Modření koloidní coomasie modří Fluorescenční barvení Sypro Ruby
Elektromigrační metody 2-DE
Elektromigrační metody DIGE - Differential gel electrophoresis Modifikace 2DE vzorky označené různou flourescenční barvou CY-2, CY-3, CY-5 různé maximum excitační energie
Elektromigrační metody Nativní elektroforéza Elektroforéza bez denaturačních činidel a detergentů Zachovává aktivní konformaci proteinů Lze testovat aktivitu Lze purifikovat velké komplexy Modrá nativní elektroforéza BN Coomasie modř, udává proteinům negativní náboj V kombinaci s SDS PAGE 2D BN/SDS PAGE
2-D BN/SDS-PAGE membránových proteinových komplexů E. coli J.-P. Lasserre et al. Electrophoresis 2006, 27, 3306 3321
Elektromigrační metody Kapilární elektroforéza Vysoké rozlišení spojení s MALDI Nekompatibilní s ESI, příliš solí v pufrech
Elektromigrační metody Free Flow electrophoresis Metoda založená na principu isoelektrické fokusace v roztoku Vysoké rozlišení Odpadá problém s precipitací proteinů v gelu Obdobný princip ROTOFOR ZOOM
Chromatografické metody HPLC vysokotlaká kapalinová chromatografie Jednorozměrná Na reverzní fázi Iontově výměnná Gelová chromatografie Hydrofilní Afinitní Vícerozměrná 2D nejčastěji SCX+RP Nízkotlaká chrom. - FPLC Extrakce na tuhé fázi - SPE video
Chromatografické metody HPLC - Reverzní fáze (RP) Sorbent - stacionární fáze - je hydorfóbní náplň Uhlovodíkový řetězec navázaný na: silikagelu polymeru Hydrofobicita Různý počet uhlíků C4, C8, C18 Mobilní fáze Vodný roztok s přídavkem TFA nebo kys. mravenčí Gradient tvořený organickým rozpouštědlem ACN Hydrofóbní řetězec rozměry kolony velikost částic porozita Příklad označení kolony: C18, 75 um x 15 cm, 3um, 300Å
Chromatografické metody HPLC -RP mv Rozdělení směsi 9-ti peptidů UV detekce -8,40-8,60-8,80-9,00-9,20-9,40-9,60 1-9,80-10,00-10,20 mv -7,00-7,50-8,00-8,50-9,00 1-11,701 7-17,039 11-18,833 12-19,264 2-12,370 15-21,734 16-22,201 17-22,639 3-13,141 4-14,115 6-16,757 5-16,595 8-17,563 9-17,684 10-18,104 21-25,794 23-26,726 24-27,633 25-28,124 26-29,106 27-29,322 28-30,150 29-32,998 31-34,917 32-36,430 18-22,895 22-26,181 30-33,538 13-20,557 14-21,169 19-23,500 20-23,677 4-19,487 9-28,752 1-10,974 2-12,987 3-14,090 5-20,907 6-22,845 7-26,681 8-28,053 10-29,423 Rozdělení tryptického digestu hemoglobinu UV detekce -9,50 2-10,00-10,68 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 56,0 min
Chromatografické metody Iontově výměnná chromatografie Separace probíhá na základě afinity nabitých proteinových/peptidových částic ke stacionární fázi Eluce probíhá vyplavením pufru o větší iontové síle krokově gradientově Kationtově výměnná Aniontově výměnná
Chromatografické metody Gelová chromatografie (size exclusion chrom.) Větší částice se pohybují rychleji než malé, které jsou brzděny interakcí s póry gelu Spíše jako hrubá frakcionace
Chromatografické metody Afinitní chromatografie Vazba proteinu přes specifickou vazebnou schopnost Substrát Protilátka Využíváno např. pro odstranění proteinů o veliké koncentraci ze séra Až 20 nejkoncentrovanějších (albumin, immunoglobuliny) purifikaci proteinových komplexů
Ukázka specificity separačních technik
Chromatografické metody Multidimenzionální kapalinová chromatografie Iontově výměnná + na reverzní fázi SCX-RPLC, WAX-RPLC Gelová permeační + na reverzní fázi SEC-RPLC Afinitní + na reverzní fázi AC-RPLC Na reverzní fázi + kapilární elektroforéza RPLC-CE
Chromatografické metody 2D-LC SCX kolona 1. dimenze nástřik trap RP odpad pumpa pumpa peptidová směs RP kolona 2. dimenze MS (ESI) štěpení proteinová směs (celý lysát, frakce)
Chromatografické metody Separace komplexních peptidových směsí Benefit: Drawback: Sensitive Not Robust Yates J.R. (1999) Nature Biotechnol. 17, 676-682. Yates J.R. (2001) Nature Biotechnol. 19, 242-247.
Chromatografické metody 2DLC MS - příklady SCX-RPLC Kvasinky 1484 proteinů (Washburn et al, Nat. Biotech, 19, 2001, 242-247) Nano 2D-LC 100 fmol BSA 100-300 proteinů E.coli / analýzu (celkem 500) (Nagele et al, J.Chromatogr. A, 1009, 2003, 197-205)
Chromatografické metody Analýza HMEC (human mammary epithelial cells) Lyzát celých buněk Gelová permeační chromatografie 6 frakcí Digesce (trypsin) 1574 proteinů SCX separace RP separace 114 frakcí (NET evaluace) 5836 jedinečných peptidů 700000 MSMS spekter (LCQ Thermo Finnigan) 16836 peptidů Jacobs et al., J. Proteome Res, 2004, Vol 3, No.1
Separace organel - frakcionace Analýza subproteomu Cytoplasma Membrány G- Bakterie Vnější Vnitřní Mitochondrie, chloroplasty Fagozómy, jiné buněčné váčky Jádro
Frakcionace Diferenciální centifugace různé sedimentační schopnosti organel Zónální centrifugace gradient Sacharóza, ClCs