Aktuální možnosti diagnostiky Lymeskéborreliózy a interpretace výsledků na Ústavu mikrobiologie FNOL a LF UP Mgr. Pavel Sauer, Ph.D.
spirochety Borrelia sp. způsobují onemocnění lymeskou boreliózu(a69.2) 9 druhů potvrzeno ve spojitosti s LB, nejčastěji Borrelia afzelii, B. garinii a B. burgdorferi s.s., B. spielmanii LB postihuje nejčastěji kůži (B. afzelii), nervový systém (B. garinii), klouby (B. burgdorferi s. stricto) a srdce přenašečem je zejména klíště obecné Ixodes ricinus, ostatní hmyz nepotvrzen
Lymeská borrelióza časná - lokalizovaná erythema migrans borreliový lymfocytom široká škála projevů (kůže, nervový systém, muskuloskeletární systém, kardiovaskulární systém) neuroborrelióza
Lymeská neuroborrelióza časná neuroborrelióza - kraniální neuritidy s obrnami hlavových nervů (n. facialis), Bannwarthova syndromu (meningomyeloradikuloneuritida), meningitida x encefalitida intratekální produkce anti-borreliových protilátek, pleocytóza (10 1000 leukocytů/mm3), borreliová DNA, CXCL13? pozdní neuroborrelióza zahrnuje chronickou progresivní encefalitidu a chronickou asymetrickou polyneuritidu
Lymeská artritida Lymeská borrelióza - pozdní pozdní projev borreliózy s intermitentním průběhem (epizody artritidy trvající týdny až měsíce odděleny obdobími remise trvající týdny až roky) postižení typicky mono- či oligoartikulární (1-3 klouby), migrující (postupně zánět různých kloubů) a asymetrické borrelie vázány na proteoglykany chrupavky (u 90% pacientů borrelie po několika týdnech eliminovány) chronický neurologický syndrom psychiatrický lymeský syndrom (i jako první příznak LB)
Lymeská borrelióza - pozdní ostatní projevy lymeské borreliózy Lymeská karditida: poruchy srdečního rytmu, perikarditida, myokarditida relativně vzácná oční manifestace: zejména konjunktivitida, iridocyklitida a chorioiditida acrodermatitis chronica atrophicans (ACA): pozdní projev na akrálních částech končetin vedoucí ke vzniku atrofických ložisek, kůže vzhled pomačkaného cigaretového papíru
Lymeská borrelióza diagnostika Přímé metody průkazu: - Kultivace - Mikroskopie světelná v zástinu - Elektronová mikroskopie - Histologie - Průkaz DNA - Detekce antigenů Nepřímé metody průkazu - Průkaz protilátek sérum, likvor (ELISA, chemiluminiscence) - Immunoblot
Lymeská borrelióza nepřímá diagnostika Sérologické vyšetření u Lymeské borreliózy rutinní vyhledávání: ELISA, chemiluminiscenční testy nástup protilátkové odpovědi pomalý (týdny) protilátková odpověď různě silná možná falešná pozitivita (přítomností jiné spirochetové infekce - syfilis, leptospiróza či spirochet v dutině ústní, pozitivním revmatoidním či antinukleárním faktorem, při EBV infekci) pozitivní výsledky ELISA testu konfirmovat metodou immunoblot časná LB odpověď proti několika málo antigenům pozdní LB protilátky proti pestrému spektru antigenů
Lymeská borrelióza nepřímá diagnostika Sérologické vyšetření u Lymeské borreliózy OspC(outer surface protein) kódován na plasmidu - exprese v iniciální fázi infekce, detekce IgM třídy protilátek VlsE(Vmp like sequence protein expressed) plasmid - variace antigenů VlsE přispívá k immune escape mechanismu, detekce jak IgM, tak IgG protilátek Chemiluminiscenční vyšetření LIAISON (DiaSorin): - BorreliaIgMQuant: OspC + VlsE (rekombinantní) - BorreliaIgG: VlsE (rekombinantní)
Lymeská borrelióza nepřímá diagnostika sérum immunoblot Vydání výsledku likvor Výpočet AI sérum/likvor immunonblot
Lymeská borrelióza sérologie, interpretace Anti Borrelia sp. IgM: < 18 AU/ml negativní, 18-22 AU/ml hraniční, > 22 AU/ml pozitivní Anti Borrelia sp. IgG: < 10 AU/ml negativní, 10-15 AU/ml hraniční, > 15 AU/ml pozitivní protilátky proti borreliím má 5-20% zdravých osob, séropozitivita bez klinických příznaků se proto neléčí po nákaze a přeléčení přetrvávají protilátky i řadu let, výše titru neposkytuje žádné informace o závažnosti onemocnění, aktivitě infekce, úspěchu léčby ani prognóze
Lymeská borrelióza sérum, interpretace Komentáře: Anti Borrelia sp. IgM - + - Anti Borrelia sp. IgG - -(+) + 1: bez komentáře 1 2 3 2: Není vyloučena aktivní infekce,nutno porovnat s klinickým obrazem. Vyšetření blotovací technikou bude provedeno v nejbližším možném termínu. doplánování immunoblotu 3: KOM 2 x Susp. přetrvávající protilátky.
Lymeská borrelióza immunoblot Následné vyšetření u vzorků s pozitivitou IgM (popř. vysokými hladinami IgG bez historie v anamnéze) borreliové antigeny nanesené na nitrocelulózovou membránu po vytvoření imunokomplexů s protilátkami ze séra reakce s konjugátem (IgG x IgM protilátky s alkalickou fosfatasou) vizualizace substrátem
Lymeská borrelióza immunoblot OspC - nativní VlsE - rekombinantní BmpA - protein borreliové membrány p83 - protoplasmový protein iv1-iv4 in-vivo exprimované antigeny EBV Epstein-Barr virus capsid antigen
Lymeská borrelióza immunoblot Komentáře: Anti Borrelia sp. IgM - +(OspC) + (OspC nebo jiný antigen) Anti Borrelia sp. IgG - -(+)(VlSE) +(2 a více antigenů) 1 2 3 1: Závěr: negativní. 2: Závěr: pozitivní. Susp. časná LB. Vyjmenování antigenů. Nelze hodnotit pouze na základě laboratorního vyšetření. Nutná korelace s dalšími lab. a klinickými markery. Opakujte vyšetření za 6-8 týdnů. 3: Závěr: pozitivní. Vyjmenování antigenů. Susp. pokročilá(roztroušená) LB, popř. susp. přetrvávající protilátky. Nelze hodnotit pouze na základě laboratorního vyšetření. Nutná korelace s dalšími lab. a klinickými markery. Opakujte vyšetření za 6-8 týdnů.
Lymeská borrelióza immunoblot
Lymeská borrelióza immunoblot Komentář: Společné celkové posouzení antiborreliových protilátek: Závěr - POZITIVNÍ. Susp. přetrvávající protilátky, popř. susp. pokročilá borelióza. Bez větších změn proti vyšetření z roku XX. Protilátková odpověď může přetrvávat dlouhodobě bez korelace s klinickou symptomatologií! Nelze hodnotit jen na základě laboratorního vyšetření! Interpretace sérologických výsledků by měla být vždy srovnávána s klinickým obrazem, epidemiologickými údaji a dalšími laboratorními nálezy.
Lymeská borrelióza likvor 1. krok: detekce protilátek v séru a likvoru negativní: vydání výsledku pozitivní: krok 2 2. krok: biochemie proteinů v séru a likvoru(albumin, IgM, IgG) 3. Výpočet protilátkových indexů AI (IgM, IgG): průkaz intratekální produkce antiborreliových protilátek v CNS Mygland. A -EFNS guidelines on the diagnosis and managementofeuropeanlymeneuroborreliosis, European Journal of Neurology 2010, 17: 8 16
Lymeská borrelióza likvor
Lymeskáborrelióza likvor, interpretace AI (IgM, IgG): negativní komentář 1 pozitivní komentář2 1. Závěr: negativní AI Nelze hodnotit pouze na základě laboratorního vyšetření. Nutná korelace s dalšími lab. a klinickými markery. Podle možností opakujte vyšetření za 6-8 týdnů. 2. Závěr: AI pozitivní: susp. antigen-specifická produkce protilátek v CNS Nelze hodnotit pouze na základě laboratorního vyšetření. Nutná korelace s dalšími lab. a klinickými markery. Podle možností opakujte vyšetření za 6-8 týdnů.
Lymeská borrelióza přímá, molekulárně biologická diagnostika B.burgdorferi ssb31 (1 chromozóm, 21 plasmidů) detekce klinicky významných kmenů skupiny Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. andersonii, B. bissettii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi, B. sinica) obvykle PCR amplifikace sekvencí DNA chromozomálních genů kódujících protein flagelin a 16S rdna specifických pro patogenní borrelie soupravy musí být testovány na souboru lokálních kmenů borelií citlivost souprav dosahuje jednotek genomu borelií na PCR reakci
Lymeská borrelióza molekulárně biologická diagnostika klin. materiál: synoviální tekutina, mozkomíšní mok, moč, krev, bioptické vzorky, klíště detekce pomocí PCR nepotvrzuje aktivní infekci u LB v Evropě se spirochety vyskytují v organismu přechodně a je relativně těžké je ze vzorku zachytit
vzorek kůže PCR- senzitivita PCR - specifita erythema migrans 69 98-100 ACA 76 100 boreliový lymfocytom / / likvor 38 93-100 synoviální tekutina 78 100 krev 14 100 Aguero-Rosenfeld et al. 2005 - Diagnosis of Lyme Borreliosis, Clinical Microbiology Reviews, vol. 18, No.3
Lymeská borrelióza molekulárně biologická diagnostika Neuroborrelióza: - v případech akutní LNB PCR průkaz pouze v 10-30% - meningitida: spirochety v zánětlivě pozměněných meningách (kultivačně průkaz jen u 10 % případů) - encefalitida: spirochety hlavně na oligodendroglii
Lymeská borrelióza elióza budoucí trendy v diagnostice? CXCL13 chemotactic cytokine, BLC (B-lymphocyte chemoattractant), produkce před anti-borreliovými protilátkami (CXCL13 ELISA, Euroimmun) Borde, J.P.- CXCL13 may improve diagnosis in early neuroborreliosis with atypical laboratory findings, BMC BMC Infectious Diseases 2012, 12:344 doi:10.1186/1471-2334-12-344 RT PCR detekce - amplifikace vybraných úseků 16S rrna pomocí reverzní transkripce, 100-1000 x více cílových sekvencí 16S rrna pro amplifikaci než původní kopie 16S rdna (faamplisens) ORNSTEIN, K.; BARBOUR, A.G. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay of Borrelia burgdorferi 16S rrna for highly sensitive quantification of pathogen load in a vector. Vector-Borne Zoonot., v.6, p.103-112, 2006. MALDI - po kultivaci borrelií, popř. spektrum proteinů v likvoru identifikace zánětlivého markeru specifického pro LB Adriana Calderaro et al. - Identification of Borrelia Species after Creation of an In-House MALDI-TOF MS Database. PLOS One, February 12, 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0088895 Segawa, S. et al. - Direct application of MALDI-TOF mass spectrometry to cerebrospinal fluid for rapid pathogen identification in a patient with bacterial meningitis. Clin Chim Acta, p.59-61, 2014