Imunologické metody Obratlovci vystavení působení cizorodých molekul a organismů reagují imunitní odpovědí, jejímž cílem je eliminace jejich škodlivého vlivu. Imunitní odpověď je dvojího typu, humorální typ - produkce a cirkulace protilátek (antibody - Ab), odpověď na buněčné úrovni - produkce specializovaných buněk, které reagují s antigeny na povrchu hostitelských buněk. Protilátky se vytvářejí ve zralých B lymfocytech, nazývaných plazmové buňky. Ab mají specifitu proti danému antigenu, určitá linie plazmových buněk produkuje stejné monoklonální protilátky (MAb). Jiné linie tvoří Ab proti stejnému antigenu, ale odlišné struktury. Vzniká tak směs - polyklonální protilátka. Antigenní determinant neboli epitop = strukturní element antigenu, který je rozpoznáván protilátkou. Proteiny - několik aminokyselin, vyšší sacharidy - několik cukerných zbytků. Z krve imunizovaných obratlovců se izoluje antisérum (případně se přečišťuje), které obsahuje polyklonální protilátky. Monoklonální protilátky se připravují v kulturách hybridomových buněk, které vzniknou fúzí B buněk s rychle se dělícími tumorovými buňkami. Alternativní cestou je nadměrná exprese monoklon. Ab v buňkách E. coli jako hostitelském organismu. Struktura protilátek Všeobecná struktura je stejná, čtyři polypeptidové řetězce, dvě kopie těžkého řetězce (H) a dvě kopie lehkého řetězce (L). Vyjímkou velbloud - pouze pár těžkých řetězců. 1
Lehký řetězec má dvě formy, těžký řetězec 5 forem, které se liší v aminokyselinové sekvenci. H řetězce jsou glykosylovány. Nekovalentní interakce řetězců, -S-S- vazby. N-koncové části obou řetězců jsou tzv. variabilní domény - vazebné místo pro antigen. Dvě identická vazebná místa. Typ H řetězců určuje třídu: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM IgA a IgG se dělí do podtříd (indexy). IgG jsou dominantní, IgM jsou jediné pentamerní (1000 kda), jinak 150-200 kda. Různé konc. v séru, funkce, poločas. Konstantní oblasti - fyziologické funkce protilátek, vazba komplementu. 2
Štěpení proteolytickým enzymem papainem probíhá mezi c H 1 a c H 2, vzniknou dvě kopie tzv. Fab fragmentu (monovalentní) a jeden Fc fragment. Pepsin poskytuje bivalentní F(ab) 2. Fab = fragment antibody Bohužel se shlukují ( sticking ), což činí potíže při terapii. Příprava protilátek Imunologické metody jsou nezastupilné v biochemických, ale zejména klinických laboratořích. Polyklonální protilátky se připravuji imunizací laboratorních zvířat. Nejčastěji se imunizuje biopolymery - proteiny, ale i polysacharidy. Nukleové kyseliny jsou špatnými antigeny. Pro kvalitu (specifitu) protilátek je nutná čistota antigenu. Nízkomolekulární látky (peptidy, léčiva) mohou vyvolávat imunitní odpověď po vazbě na inertní nosič. Pak se z nich stávají tzv. hapteny. Jako nosiče se používají např. hemocyanin, BSA. Často se provádí několik typů konjugací pro možnost porovnání specifity generovaných protilátek. 3
Přečištění antigenů používaných pro imunizaci V případě proteinů je nejvýhodnější použití preparativní SDS- PAGE, chromatografické metody - afinitní chromatografie. Po preparativní ELFO se vzorek vyřízne z gelu (bez barvení, musí být známa pozice v gelu), rozdrtí se, suspenduje v PBS pufru a protlačuje injekční stříkačkou pro jemné rozdrcení. Pak je možná imunizace. Pro imunizaci se obvykle aplikuje 1-1000 µg proteinu smíseného s adjuvans - funguje jako depot pro pomalé uvolňování antigenu a nespecifický aktivátor imunitní reakce. Freundovo adjuvans - obsahuje mannidomonooleát a parafínový olej. Je-li kompletní, obsahuje dále inaktivované mykobaktérie pro stimulaci imunitního systému zvířete. Kompletní F.a. se užívá pouze na počátku imunizace, dále následuje použití inkompletního F.a. Emulze použitá pro inokulaci musí být stabilní (ultrazvuk). V některých zemích je použití F.a. zakázáno (SRN), alternativy. Výběr zvířete pro přípravu antiséra závisí na množství potřebných protilátek. Nejčastěji králík a koza. Pro první injekci s kompletním F.a. se doporučuje intramuskulární aplikace. Následující aplikace mají být podkožní. Protokoly pro imunizaci bývají různé, obvykle trvají 35-60 dnů. Na počátku se odebere kontrolní sérum. Po počáteční injekci se užije relativně velkého množství antigenu, pro další injekce se toto snižuje. 4
Antigen se má aplikovat do různých míst zvířecího těla - omezení fyzické bolesti. Krev králíků se odebírá z ušních žil, drastické je utrácení zvířat vykrvácením. Po 14 dnech od první injekce se odebírá zkušební sérum pro analýzu titru protilátky, pak následují další injekce s menším množstvím antigenu (aby se nevyvinula tolerance) pro povzbuzení imutního systému za účelem vyšší produkce protilátek. Po dalších 14 dnech následuje další injekce pro povzbuzení imunitního systému ( booster ). Dále po týdnu může být odebráno antisérum. Může být i třetí injekce Ag pro povzbuzení (8 týdnů o poč. injekce), po dalším týdnu se odebere antisérum. 5
Rupert Purifikace protilátek Po získání krve ze zvířete se nechá krev srazit, krevní koláč se odstraní centrifugací při 5,000 g, připravíme tak sérum. Sérum lze skladovat několik let při -80 o C. Doporučuje se inaktivace komplementu zahřátím při 56 o C po dobu 10-20 min. Pro přečištění immunoglobulinové frakce séra existuje několik metod: 1) precipitace síranem amonným, 45% sat. pro králičí sérum 2) konvenční chromatografické techniky 3) afinitní chromatografie na nosičích protein A nebo G; Jde o immobilizované komponenty z buněčné stěny bakterie Streptococcus aureus (A) nebo růz. spreptokokových kmenů (G), vážící IgG v konst. Fc regionech. 6
IgG se váží na afinitní nosič v neutrálním či slabě alkalickém prostředí, eluují se glycin-hcl pufrem, ph 2.7. Nutná okamžitá neutralizace kyselého eluátu. Podobně může být afinitní chromatografie provedena s immobilizovaným antigenem použitým pro imunizaci (navázání na aktivovaný nosič CNBr-Sepharosa, vinylsulfonyl agarosa). Nanášení při neutrálních podmínkách, eluce chaotropními látkami či nižším ph. Touto purifikací nelze získat monoklonální protilátky, ale směs monospecifických protilátek proti různým antigenním determinantům. Monoklonální protilátky 7
Nanoprotilátky ( nanobodies ) Běžné protilátky mohou být přirovnány k tankům: pro léčbu jistých onemocnění jsou velké, složité a nákladné. Nedokonalost lidského imunitního systému: často velmi pomalý v reakci (nádory, určité respirační infekce), jindy naopak reaguje nadměrně (odmítnutí transplantovaných orgánů, astma, alergie). Konečně může napadnout vlastní buňky (revmatická artritida). Snaha produkovat umělé protilátky bez negativních efektů u MAb problematické a nákladné. Velbloudi a lamy produkují ve svém imunitním systému neúplné protilátky, které mohou být pozměněny genovým inženýrstvím (použije se jediný variabilní segment). NanoAb jsou pak kódovány jediným genem a mohou být snadno produkovány expresí v hostitelském mikrobiálním organismu. Nanoprotilátky mají velikost 1/10 běžné Ab. Konstrukce a aplikace studovány firmou Ablynx v Gentu (Belgie). V podobné velikosti firma Domantis (Cambridge, MA, USA) produkuje doménové protilátky variabilní domény z Fab. 8
Interakce protilátka - antigen Použití vysoce specifické interakce pro analýzu. Provádí se v roztoku nebo na nosiči (gelu). Vytvoření Ab-Ag precipitátu (zákal) v roztoku se děje pouze v úzkém rozmezí koncentrací, které se nazývá zóna ekvivalence. K precipitaci dochází vazbou bivalentních Ab na antigen, který je multivalentní - vytvoří se nerozpustná síťová struktura. Fab fragmenty precipitát neposkytují. Podobně se precipitát netvoří u monoklonálních protilátek, které váží antigen s více kopiemi jediného epitopu. Precipitace vyžaduje malý nadbytek Ag (2:1). Kvantifikace měřením rozptylu světla (nefelometrie) nebo jeho pohlcování (turbidimetrie) zákalem. Imunoprecipitace se kombinuje s SDS- PAGE pro semikvantitativní detekci proteinů. 9
Př. Studium membránových Ag imunoprecipitací. Proteiny v b. membráně se radioaktivně značí metabolickou cestou -např. použitím jodovaných aminokyselin. Buňky jsou pak lyzovány detergentem. Membránové částice s antigeny jsou vychytány přídavkem monoklonálních protilátek vázaných na nerozpustné částice nosiče - vytvoří se nerozpustné komplexy. Vše ostatní se vymyje. Komplexy Ab-Ag Ag se štěpí přídavkem SDS, uvolněné proteiny se separují SDS-PAGE a identifikují dle radioaktivity. Interakce v gelu 1. Radiální imunodifuse 1. Radiální imunodifuse. V 1-2% agarovém gelu obsahujícím protilátku jsou vyřezány kruhové jamky pro aplikaci různě zředěného antigenu. Ag difunduje do gelu a dle jeho koncentrace vznikají různě široké precipitační prstence (dosažení ekvivalence). Kvantifikace s kalibrační přímkou. 10
2. Dvojitá imunodifuze. Protilátka a antigen se umístí do různých jamek na opačné konce agarového gelu a ponechají se difundovat proti sobě. Precipitační linie se vytvoří v místě příslušné ekvivalence v poloze mezi Ab a Ag. Obsahuje-li vzorek Ag více složek (rodílné mobility) rozpoznávaných stejnou Ab, vznikne více precip. linií. Semikvantifikace, studium antigenních determinant. 3. Ouchterlonyho imunodifuze. Čtvercový agarový gel, centrální jamka, periferní jamky umístěny v kruhu kolem jamky centrální. Do centrální jamky se dávkuje protilátka, do periferních jamek různé antigeny. Po difuzi a vytvoření precipitačních linií můžeme posoudit, identitu, částečnou identitu nebo naprostou odlišnost těchto antigenů. 11
Imunoelektroforetické metody jsou podstatně rychlejší a a pro analýzu tudíž efektivnější než metody imunodifuzní. 4.. Raketová imunoelektroforéza. Provádí se v agarovém gelu s protilátkou. Na katodové straně se dávkuje antigen o různé koncentraci. Ab-Ag komplexy tvoří obrazce podobnému plamenuům hořícího paliva rakety. Hodnota ph (~ 8.0) zajišťuje, že Ab a Ag migrují do opačných směrů. 5. Křížová imunoelektroforéza. Protilátka a antigen se dávkují na opačných stranách agarosového gelu, Ag na katodové straně, Ab na anodové. Po připojení zdroje el. napětí se Ab a Ag pohybují proti sobě (nutné správné ph) a v místě dosažení koncentrační ekvivalence se vytvoří precipitační linie. 12
6. Imunoelektroforéza pro směsi antigenů. Provádí se ve dvou krocích. Nejprve se směs antigenů vpravená do dvou centrálně umístěných jamek separuje zónovou elektroforézou. Do podélné ( slot-like ) jamky v gelu, která je mezi jamkami pro antigen) se vnese protilátka. Jamka je paralelní s osou provedené elektroforézy pro separaci antigenů. Ab difunduje proti separovaným antigenům, tvoří se obloukovité precipitační linie. Poloha linií odpovídá mobilitě antigenů separovaných elektroforézou. Kvalitativní i kvantitativní analýza směsi antigenů. 13
Radioimunoanalýza (RIA) Jedna z nejcitlivějších a nejpřesnějších metod analýzy (až pg/ml). Založena na kompetici radioaktivně značeného a neznačeného antigenu o vazbu na protilátku. Může být prováděna dvěma způsoby: 1. Smísí se Ag* (známá konc.) a Ag (neznámá konc.) a směs se inkubuje se specifickou protilátkou (volně v roztoku). Následuje přídavek sekundární protilátky, komplex Ab- Ag/Ag* je takto precipitován, separován, v precipitátu se měří radioaktivita. Primární protilátka může být immobilizována, např. na stěně zkumavky, pak se zkumavka po přídavku směsi a inkubaci pouze vymyje. 2. Protilátka reaguje nejdříve pouze se značeným antigenem a přídavky neznačeného antigenu o různé koncentraci různě vytěsňují Ag* z vazby. Ab-Ag* se tak doplňuje Ab-Ag. 14
Značení - 125 I a 131 I pro proteinové antigeny, tritium nebo 14 C pro nízkomol. látky. Radioaktivita se měří např. scintilací. Pro kvantifikaci nutná standardizace. 15
ELISA Dnes nejběžnější imunoanalýza v biochemických a klinických laboratořích. Stejná specifita a srovnatelná citlivost jako u RIA. Detekce spočívá v přeměně chromogenního substrátu nějakým enzymem (alkalická fosfatasa, křenová peroxidasa), který je ve formě konjugátu s antigenem nebo protilátkou. Komplex protilátky s antigenem je immobilizován na pevný povrch - plastové mikrotitrační destičky. Existuje několik způsobů provedení: přímá ELISA, nepřímá ELISA, kompetitivní ELISA, sendvičová ELISA. Liší způsobem provedení detekce, immobilizované jsou buď protilátky nebo antigeny. Přímá ELISA Pro detekci antigenu (virus, bakterie; rekombinantní peptid či protein, ale i jiné antigeny). Protilátka pro detekci je značena (HRP, AP, FITC). Po vymytí nadbytku Ab-konjugátu se přidá chromogenní substrát pro tvorbu zbarvení nebo se měří fluorescence. Ab-konjugát je komerční nebo připravený v laboratoři. 16
Nepřímá ELISA Opět immobilizovaný antigen. Nejdříve se Ag inkubuje s primární protilátkou a její nadbytek se vymyje. Sekundární protilátka - konjugát se váže na primární Ab, nadbytek se opět vymyje. Positivní reakce - ve vzorku musí být přítomna primární Ab. Podmínkou spolehlivosti je, že sekundární Ab neváže immobilizovaný Ag ani nepřilne na stěny mikrotitrační destičky. Sendvičová ELISA ( capture, sandwich ELISA) Varianta se záchytem antigenu Varianta se záchytem antigenu. Protilátka vážící Ag je immobilizována (může to být i test jejího titru). Přídavek Ag, vymytí. Přidá se značená protilátka, která váže zachycený Ag. Přísné podmínky podobně jako u nepřímé ELISA - značená Ab nesmí reagovat s immobilizovanou Ab. Značená Ab by měla být z jiného obratlovce (králík - koza). Nesmí být nespecifická vazba s pevnou fází. 17
Sendvičová ELISA Varianta se záchytem protilátky. Immobilizovaná protilátka váže protilátky ze vzorku (např. lidské IgG, IgA nebo IgM ze zkoumaného séra pacientů). Po vymytí se přidá specifický antigen a nakonec anti- Ag konjugát poskytující signál. Značená Ab nesmí reagovat s Ab ve vzorku bez přítomnosti Ag. Nesmí ani vytvářet nespecifickou vazbu s pevnou fází Při sendvičové ELISE může být použito i sekundární protilátky. 18
Kompetitivní nebo blokovací ELISA U kompetitivní ELISA se zkoumané sérum inkubuje společně se značeným anti-ag konjugátem. Antigen je vázán na nosič. Kompetice o vazbu, čím více Ab v séru, tím silnější zbarvení. Nutná standardizace. U blokovací ELISA se nejdříve přidá zkoumané sérum. Nadbytek se po inkubaci vymyje. Pak se přidá anti-ag konjugát, který vytěsňuje zkoumanou Ab z vazby. Komp. ELISA má varianty s immobilizovanou protilátkou. Nespecifické vazby protilátek mohou být odstraněny blokováním stěn ELISA destiček 0.1% roztokem BSA. 19
Používané substráty pro peroxidasu v Ab-konjugátech: 3, 3, 5, 5 -tetramethylbenzidin 2,2 -azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát) - ABTS o-fenylendiamin o-dianisidin o-toluidin Používané substráty pro alkalickou fosfatasu v Ab-konjugátech: 4-nitrofenylfosfát Western blotting a dot blotting Jde o metody s vysokou citlivostí pro detekci proteinů separovaných elektroforézou, obě jsou založené na použití specifických protilátek. Proteiny (= antigeny) jsou vázány na membránu, nejčastěji se používá hydrofobní PVDF. U dot blottingu se protein aplikuje přímo na membránu bez počáteční elektroforetické separace. Detekce je stejná jako u Western blottingu (viz dále). Pro kvalitativní a semikvantitativní stanovení. Při Western blottingu se proteiny nejdříve separují elektroforézou (SDS-PAGE). Následuje blotting na PVDF membránu. Stejně jako u dot blottingu, vazebná místa na membráně musí být blokovány inertním proteinem (BSA, želatina, odtučněné mléko) před aplikací protilátek. 20
Pro viditelnou detekci se používá Ab-konjugát s enzymy (HRP, ALP) nebo protein A konjugát s HRP. Pro Western blotting je třeba jiných enzymových substrátů než pro ELISA; je nutné, aby poskytovaly precipitující barevné produkty. Př. pro peroxidasu se používají diaminobenzidin a 4-chlor-1- naftol; pro ALP se používá 5-brom-4-chlorindoxyl fosfát/nitrotetrazoliová modř. Detekční limit proteinů je tak 1 ng/mm 2 membrány. O 2-32 3 řády citlivější je použití luminiscenčních detekčních technik (fluoresc. substráty pro Ab-konjugáty s enzymy). Emitované světlo lze zachytit např. film. 21
Mikroskopické techniky - imunofluorescence a imunogold Protilátky lze využít k in vivo detekci látek v buňce nebo buněčných organelách. Jako sekundární protilátky se používají fluorescenční konjugáty (fluorescein, rhodamin, FITC) nebo konjugáty s částečkami zlata (připravují se redukcí kyseliny tetrachlorzlatité, průměr několik nm). Vazba částeček je elektrostatická, závislá na ph (obvykle ~ 7). Detekce se provádí viditelným (pro imunogold) či fluorescenčním (pro imunofluorescenci) mikroskopem na tkáňových řezech. Elektronová mikrosk. dává přednost imunogold konjugátům. Při imunofluorescenční mikroskopii lze detekovat simultánně dvě látky, pokud se použijí konjugáty s různými fluorescenčními značkami. V EM se analogicky použijí různě velké částečky zlata. Přímý test 22
Nepřímý test 23
FACS - fluorescence activated cell sorting Průtoková cytometrie ( flow cytometry ) je technika pro rychlé měření jednotlivých částic/buněk, které procházejí snímačem. Argonový laser umožňuje analýzu mnoha parametrů na základě odklonu laserového paprsku. Úroveň tohoto odklonu odpovídá velikosti a granularitě (denzitě). Cytoplazmatické znaky (antigenní determinanty) v buněčné membráně mohou být značeny fluorescenčním konjugátem monoklonálních protilátek. Je tak možné určit přítomnost, denzitu i distribuci těchto znaků. Analogicky lze studovat i vnitřní znaky, např. obsah DNA. Cytoplazmatické znaky jako tzv. diferenciační znaky (Clusters of Differentiation - CD) umožňují určovat specifické buněčné subpopulace - například CD4+ T lymfocyty značené monoklonální protilátkou proti znaku CD4 na jejich povrchu. až 10 7 b. /h tolik obsaženo např. v 1 ml krve 24
Flow cytometry is a technique for counting, examining and sorting microscopic particles suspended in a stream of fluid. It allows simultaneous multiparametric analysis of the physical and/or chemical characteristics of single cells flowing through an optical/electronic detection apparatus. A beam of light (usually laser light) of a single frequency (colour) is directed onto a hydrodynamically focused stream of fluid. A number of detectors are aimed at the point where the stream passes through the light beam; one in line with the light beam (Forward Scatter or FSC) and several perpendicular to it (Side Scatter (SSC) and one or more fluorescent detectors). Each suspended particle passing through the beam scatters the light in some way, and fluorescent chemicals in the particle may be excited into emitting light at a lower frequency than the light source. This combination of scattered and fluorescent light is picked up by the detectors, and by analysing fluctuations in brightness at each detector (one for each fluorescent emission peak) it is possible to deduce various facts about the physical and chemical structure of each individual particle. FSC correlates with the cell volume and SSC depends on the inner complexity of the particle (i.e. shape of the nucleus, the amount and type of cytoplasmic granules or the membrane roughness). There are now some flow cytometers on the market that have eliminated the need for fluorescence and use only light scatter for measurement. Measurable parameters are: volume and morphological complexity of cells cell pigments such as chlorophyll or phycoerythrin DNA (cell cycle analysis, cell kinetics, proliferation etc.) RNA chromosome analysis and sorting (library construction, chromosome paint) proteins cell surface antigens (CD markers) intracellular antigens (various cytokines, secondary mediators etc.) nuclear antigens enzymatic activity ph, intracellular ionized calcium, magnesium, membrane potential membrane fluidity apoptosis (quantification, measurement of DNA degradation, mitochondrial membrane potential, permeability changes, caspase activity) cell viability monitoring electropermeabilization of cells oxidative burst characterising multi-drug resistance (MDR) in cancer cells glutathione various combinations (DNA/surface antigens etc.) This list is very long and constantly expanding. 25