Mgr. Jan Ištvánek, Ph.D. Laboratoø molekulární diagnostiky, I COR-99, s.r.o. Kvantitativní vyšetøení hepatitidy B a C první zkušenosti s virologickým panelem na pøístroji cobas 4800, srovnání s cobas TaqMan 48 Úvod Virové hepatitidy jsou celosvìtovì nejèastìjší jaterní onemocnìní, které vede až ke 2 milionùm úmrtí roènì. 1 V souèasnosti rozeznáváme 6 virù zpùsobujících virové hepatitidy (oznaèované jako hepatitidy A, B, C, D, E a G). V Èeské republice se bìžnì vyskytují pouze virové hepatitidy A, B a C. Mnohem závažnìjší prùbìh než hepatitida A mají hepatitidy B a C, což souvisí pøedevším s jejich schopností pøecházet do chronicity. Onemocnìní trvající déle než pùl roku ústí v chronickou hepatitidu, jaterní cirhózu èi rakovinu jater. Následkem chronických forem onemocnìní roènì umírá dalších nìkolik milionù osob. Nezanedbatelné jsou také ekonomické ztráty spojené s pracovní neschopností, léèbou apod. Virové hepatitidy tedy i ve 21. století pøedstavují velmi významný zdravotnický problém. Virová hepatitida B je jedním z nejzávažnìjších zdravotnických problémù souèasnosti, pøedevším v rozvojovém svìtì. Bìhem svého života se virem hepatitidy B nakazí více než 2 miliardy osob, pøièemž v souèasnosti je chronicky infikováno 350 400 milionù lidí. 1 5 Na následky chronické infekce HBV poté umírá pøibližnì 15 25 % chronicky infikovaných osob. V celosvìtovém mìøítku to pøedstavuje roènì pùl až jeden milion osob, což øadí hepatitidu B mezi deset nejèastìjších pøíèin úmrtí. Na základì posledních sérologických pøehledù, které v Èeské republice probìhly, byla chronická infekce virem hepatitidy B prokázána u 0,56 % spoluobèanù. 6 Chronická hepatitida B se pøitom léèí nejèastìji pomocí 4 úèinných preparátù (pegylovaným interferonem (I N) alfa-2a, konvenèním interferonem alfa, lamivudinem a adefovir dipivoxilem 7 ). Doba léèby je závislá na použitém preparátu, typu viru HBV, léèebné odpovìdi pacienta a trvá standardnì od 4 do 12 mìsícù. Virovou hepatitidou C jsou podle kvalifikovaných odhadù nakaženy pøibližnì 3 % svìtové populace, pøièemž vìtšina pøejde do chronicity, jelikož virová hepati- 14 Labor Aktuell 03/16
tida C je v akutním stadiu rozpoznána jen velmi zøídka. Celosvìtovì je nemocných více než 180 milionù. Virová hepatitida C je pøitom problémem nejen rozvojových zemí, ale i rozvinutých, a to v dùsledku nedostupnosti oèkování vùèi viru hepatitidy C. Poèet hlášených pøípadù novì zjištìných hepatitid C v Èeské republice rok od roku narùstá (158 pøípadù novì diagnostikovaných infekcí HCV v roce 1993, 868 pøípadù v roce 2004). 6 Protože naprostá vìtšina onemocnìní probíhá bezpøíznakovì a uniká proto pozornosti, budou skuteèná èísla výraznì vyšší. Èeská republika pøesto patøí mezi státy s relativnì nízkým výskytem infekce HCV okolo 0,2 % populace. 6 Bìhem uplynulých desetiletí podstatnì rostla úèinnost léèby z pùvodních 5 % na souèasných 50 60 % u nemocných infikovaných virem hepatitidy C typu 1 a 70 80 % u pacientù nakažených typy 2 a 3. Tento pokrok v léèbì je dosahován kombinací pegylovaného interferonu a ribavirinu. 8, 9 Léèba poté trvá nejèastìji mezi 24 a 48 týdny. Kvantifikace virové nálože se v souèasnosti stala dùležitou souèástí antivirové terapie chronických hepatitid. Graf 1: Srovnání výsledkù kvantifikaèních kitù pro urèení virové nálože HBV v logaritmickém mìøítku Detekce DNA viru HBV a RNA viru HCV pomocí PCR 10, 11 na rozdíl od vyšetøení protilátek prokazuje aktivní replikaci viru, a je tedy dùkazem probíhající infekce. Nicménì v pøípadì použití real-time PCR je možné kvantifikovat poèáteèní množství templátu, tzn. urèit aktuální virovou nálož. Kvantifikace virové nálože se v souèasnosti stala dùležitou souèástí antivirové terapie chronických hepatitid. Lze ji použít k prùkazu i monitorování trvalé i doèasné virologické odpovìdi na terapii. Vzhledem k tomu, že význam kvantifikace virové nálože v léèbì pacientù infikovaných HBV nebo HCV stále roste, zamìøili jsme se v následující studii na porovnání novì dostupného testu pro kvantifikaci virové nálože u hepatitidy B a C na automatickém pøístroji cobas 4800 s døívìjší, v souèasnosti však v ÈR stále nejpoužívanìjší metodou, zahrnující manuální izolaci a amplifikaci na pøístroji TaqMan 48. Metody Celkem 15 vzorkù (4 negativní a 11 pozitivních s rùznými virovými náložemi) bylo testováno obìma kvantifikaèními testy. V pøípadì testování na pøístroji cobas TaqMan 48 byla nukleová kyselina izolována manuální metodou pomocí kitu High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (Roche) z 500 µl klinického materiálu. K amplifikaci byly použity reagencie kitù cobas TaqMan HBV Test (Roche) a cobas TaqMan HCV Test, v2.0 (Roche). Mastermix byl namíchán ruènì, stejnì jako byl do PCR pøidán ruènì i templát. Izolace nukleových kyselin (ze 400 µl klinického materiálu), pøíprava mastermixu i pøíprava PCR reakce do mikrotitraèní Tab. 1: Srovnání výsledkù kvantitativních metod urèujících virovou nálož ve vzorku u HBV i HCV Labor Aktuell 03/16 15
destièky vèetnì pøidání templátu jsou na pøístroji cobas 4800 automatizovány a probíhají v pøístroji cobas x480. Samotná amplifikace probíhá v real-time cykleru cobas z480. Všechny použité soupravy byly použity dle návodu výrobce. U kvantitativních testù realizovaných na cobas 4800 urèujících virovou nálož HBV a HCV, jako nových laboratorních vyšetøení, byla provedena verifikace (mezilehlá preciznost, opakovatelnost) z dùvodu ovìøení základních charakteristik testù. K ovìøení pracovního rozsahu testù byly simulovány vzorky s rùznými virovými náložemi. Ovìøoval se limit detekce i meze lineárního rozsahu testù. Bylo také ovìøeno množství vstupního klinického materiálu a limitu, které je schopen cobas x480 (izolátor) zpracovat. Dle doporuèení výrobce je vstupní množství klinického materiálu stanoveno na 800 µl, pøièemž 400 µl je použito k izolaci nukleových kyselin. 400 µl je tudíž mrtvý objem. Vzhledem k možné limitaci ze strany množství materiálu byly vyzkoušeny alternativní sekundární zkumavky (Sarstedt, kat. è. 60.546.002) s jinými rozmìry (6 ml, 92 x 11,5 mm), které jsou vhodné pro 32místný nosiè, a byl ovìøen minimální použitelný objem. Graf 2: Srovnání výsledkù kvantifikaèních kitù pro urèení virové nálože HCV v logaritmickém mìøítku Výsledky Srovnáním výsledkù obou metod je patrné, že jak vzorky HBV, tak vzorky HCV byly shodnì hodnoceny jako pozitivní nebo negativní (u pozitivních výsledkù je pøímo uvedena hodnota virové nálože; tabulka 1). Srovnáním vypoèítaných virových náloží u pozitivních vzorkù v logaritmickém mìøítku se poté ukazuje, že v pøípadì HBV cobas 4800 pøi nízkých virémiích oproti cobas TaqMan výsledky mírnì nadhodnocuje a pøi vysokých mírnì podhodnocuje (graf 1). U HCV jsou poté oba testy pøi nízkých virémiích srovnatelné, avšak pøi vyšších virémiích cobas 4800 ve srovnání s cobas TaqMan výsledky mírnì nadhodnocuje (graf 2). V rámci verifikace nových kvantifikaèních testù bylo provedeno mìøení opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti a z namìøených hodnot byly vypoèítány základní charakteristiky testu. Namìøené hodnoty i charakteristiky testù jsou shrnuty v tabulce 2. Oba testy vykazují velmi malou odchylku mìøení, jak lze vidìt z výsledkù opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti. Malé odchylky mìøení jsou pøitom dùležité z hlediska spolehlivosti výsledkù a správného monitoringu virové nálože u pacientù s chronickými hepatitidami. V rámci ovìøení pracovního rozsahu Tab. 2: Verifikace nových kvantifikaèních testù HBV a HCV provádìných na cobas 4800. Stanovení opakovatelnosti, mezilehlé preciznosti a ovìøení základních parametrù testù (smìrodatná odchylka, variaèní koeficient, bias a rozšíøená kombinovaná nejistota mìøení) 16 Labor Aktuell 03/16
Tab. 3: Ovìøení pracovního rozsahu nových kvantifikaèních testù kvantitativního testu HBV byl testován limit detekce (4,4 IU/ml) a lineární rozsah (10 IU/ml až 10 9 IU/ml). U kvantitativního testu HCV pak byl ovìøen limit detekce (9,2 IU/ml) a lineární rozsah testu (15 IU/ml až 10 8 IU/ml) (tabulka 3). V rámci testování detekèního limitu oba testy detekovaly i polovinu limitu detekce stanoveného výrobcem. Pøestože limit detekce u obou testù ležel pod dolní mezí lineárního rozsahu testu, v pøípadì HCV byla stanovena virová nálož a celkovì výsledky virové nálože pøi dolní hranici lineárního rozsahu HCV testu byly mírnì nadhodnoceny. U vysoce pozitivního HCV vzorku pak byla namìøená virová nálož menší. To však mùže být zpùsobeno delším skladováním a opakovaným rozmražením vzorku. V pøípadì testu HBV výsledky ovìøující lineární rozsah velmi dobøe korelují. Pøi testování potøebného vstupního množství klinického materiálu v alternativních sekundárních zkumavkách bylo použito 8 vzorkù o rùzných objemech (450 µl až 800 µl). Minimální vstupní objem vzorku byl tímto experimentem definován na 600 µl, což znamená, že mrtvý objem, který nemùže pøístroj použít, se zmenšil na polovinu. Pøístroj cobas x480 byl sice schopen nalézt hladinu a použít i vzorek s objemem 550 µl, nicménì kvùli možné pipetovací chybì nemùžeme toto množství spolehlivì doporuèit (obrázek 1). Diskuse Ze srovnání výsledkù testù pro kvantifikaci virové nálože HBV a HCV je patrné, že oba srovnávané systémy poskytují výsledky o velmi dobré shodì. Mírné nadhodnocení nebo podhodnocení výsledkù, a již v rámci srovnání systémù nebo pøi Obr. 1: Testování vstupního objemu, který je nutný pro zpracování vzorku v alternativních sekundárních zkumavkách verifikaci pracovního rozsahu, jsou z klinického hlediska pro lékaøe nepodstatné. Jelikož i pøi hodnocení léèebné odpovìdi jsou nejdùležitìjším ukazatelem mocninné exponenty virové nálože, bylo i srovnání testù provedeno v logaritmickém mìøítku. Verifikací kvantifikaèních testù HBV a HCV na automatickém pøístroji cobas 4800 bylo dokázáno, že pøístroj splòuje všechny potøebné parametry pro rutinní použití v laboratoøi, pøièemž eliminuje podstatnou èást lidské práce, a tudíž Verifikací kvantifikaèních testù HBV a HCV na automatickém pøístroji cobas 4800 bylo dokázáno, že pøístroj splòuje všechny potøebné parametry pro rutinní použití v laboratoøi, pøièemž eliminuje podstatnou èást lidské práce, a tudíž možnost chyby zpùsobené lidským faktorem. Labor Aktuell 03/16 17
možnost chyby zpùsobené lidským faktorem. Pøi ovìøení pracovního rozsahu bylo navíc prokázáno, že oba testy dokážou detekovat i polovinu detekèního limitu uvádìného výrobcem, což umožòuje dostateènou senzitivitu testu i v pøípadì malých virových náloží v zaèátcích onemocnìní èi relapsu. Samotný pøístroj však potøebuje drobné softwarové i hardwarové úpravy. Izolátor cobas x480 vyžaduje relativnì velký objem klinického materiálu v sekundární zkumavce doporuèované výrobcem, aby byl schopen nabrat vzorek k izolaci. To vede k potøebì mnohem vìtšího objemu vzorku (doporuèeno je 800 µl), pøestože samotná izolace probíhá pouze ze 400 µl klinického materiálu. Urèitým východiskem mùže být volba alternativní sekundární zkumavky, což v našem pøípadì zmenšilo nevyužitý objem na polovinu. Ovšem vhodnìjším øešením by byla úprava nastavení izolátoru. Samotný pøístroj umožòuje také alternativní postup, izolaci z 200 µl klinického materiálu, který lze použít i s menším vstupním objemem (doporuèeno 600 µl). Tato možnost je nicménì spojena s mírnì nižší senzitivitou testù a potøebou speciálního diluentu. Protože diluent nebyl v dobì našeho testování k dispozici, tuto možnost jsme nezkoušeli. V softwaru je poté potøeba zapracovat limity pro dolní i horní meze lineárního rozsahu testù tak, aby byly virové nálože, které jsou pod nebo nad touto hranicí, uvádìny na výsledku jako <10 IU/ml nebo >1x10 9 IU/ml u testu HBV a <15 IU/ml nebo >1x10 8 IU/ml u testu HCV. V souèasnosti je totiž uvádìno pouze <min Titer nebo >max Titer, což mùže komplikovat spárování s laboratorním informaèním systémem nebo mùže dojít k lidské chybì pøi pøepisu výsledkù, jelikož se u obou testù lineární rozsah liší. Celkovì však kvantifikaèní testy HBV a HCV zpracované pøístrojem cobas 4800 podstatnì urychlí èas potøebný k vydání výsledku pøi souèasné redukci manuální pracnosti obou metod. Závìr V této práci je diskutováno použití pøístroje cobas 4800, který pøináší vyšší stupeò automatizace, s dosud používaným systémem cobas TaqMan 48, který je založen na manuálním zpracování. Z výsledkù testování vyplývá, že obì metody poskytují srovnatelné výsledky. Kvantifikace virové nálože HBV i HCV na pøístroji cobas 4800 splòuje veškeré požadavky kladené na rutinní použití kvantitativních metod v laboratorní praxi. Použitím jiných sekundárních zkumavek lze navíc analýzu spustit bez nutnosti øedìní z menšího množství klinického materiálu, pøedevším díky zmenšení mrtvého (nevyužitého) objemu. Kvantifikace virové nálože HBV i HCV na pøístroji cobas 4800 splòuje veškeré požadavky kladené na rutinní použití kvantitativních metod v laboratorní praxi. Literatura: 1) Husa P., Husová L. Virové hepatitidy. 1. vyd. Praha: Galén 2005, 247 s. 2) Conjeevaram H.S., Lok A.S.. Management of chronic hepatitis B. J Hepatol 2003; 38 (Suppl. 1): S90 S103. 3) Lee W.M. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997; 337: 1733 1745. 4) Lok A.S., Heathcote E.J., Hoofnagle J.H. Management of hepatitis B: 2000 Summary of a workshop. Gastroenterology 2000; 120: 1828 1853. 5) Lok A.S., McMahon B.J. Chronic hepatitis B: update of recommendations. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 857 861. 6) Nìmeèek V. Sérologický pøehled ÈR v roce 2001 virová hepatitida A, B, C. Zprávy CEM 2003; 12: 55 61. 7) Ozaras R., Corti G., Ruta S., Lacombe K., Mondelli M.U., Irwing W.L., Puoti M., Khalighi A., Santos M.L., Harxhi A., Lazarevic I., Soriano V., Gervain J., Leblebicioglu H., Salmon D., Arends J.E. Differences in the availability of diagnostics and treatment modalities for chronic hepatitis B across Europe. Clin Microbiol Infec 2015; 21 (11): 1027 1032. 8) Galský J., Husa P., Kümpel P., Nìmeèek V., Plíšek S., Šperl J., Urbánek P., Volfová M. (abecednì). Diagnostika a léèba chronické virové hepatitidy C (HCV). Doporuèený postup Èeské hepatologické spoleènosti a Spo- leènosti infekèního lékaøství z roku 2002. Klin mikrobiol inf lék 2003; 9: 54 56. 9) Strader D..B., Wright T., Thomas D.L., Seeff L. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology 2004; 39: 1147 1171. 10) Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Virology of hepatitis C virus infection. Best Pract Res Cl Ga 2012; 26 (4): 381 389. 11) Kania D., Ottomani L., Meda N., Peries M., Dujols P., Bolloré K., Rénier W., Viljoen J., Ducos J., Van de Perre P., Tuaillon E. Performance of two real-time PCR assays for hepatitis B virus DNA detection and quantitation. J Virol Methods 2014; 201: 24 30. 18 Labor Aktuell 03/16